CC BY
51
УДК 539.19+ 612.822.3
А. А. Малицкий, Б. Ф. Щеголев, В. Е. Стефанов, М. Л. МакКи, В. Х. Хавинсон
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТЕТРАПЕПТИДА А1а-С1и-А8р-Рго С МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИ ДНОЙ МЕМБРАНОЙ НЕРВНОЙ КЛЕТКИ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ
Исследования роли регуляторных пептидов в функционировании различных систем организма показали их особенную эффективность в регуляции работы центральной нервной системы. Было выявлено, что наибольшей биологической активностью обладают короткие пептиды, состоящие из 2-6 аминокислотных остатков [6]. Уже сейчас на их основе разрабатываются лекарства эффективные против эпилепсии, рассеянного склероза, нейродегенеративных и целого ряда других заболеваний [4,5].
Создание вышеупомянутых лекарств требует знаний о механизмах взаимодействия пептидов с клеточными мембранами, однако получение таких данных представляет собой сложную экспериментальную задачу. Здесь на помощь приходит биомолекулярное моделирование, предоставляющее возможность рассматривать процессы взаимодействия на атомном уровне, а также получать информацию, которая не может быть извлечена из экспериментальных исследований.
Для того чтобы попасть в клетку, пептид должен преодолеть барьер клеточной биологической мембраны, которая окружает каждую клетку в организме. Биологические мембраны — тонкие пограничные структуры молекулярных размеров (толщина не более 100 А), расположенные на поверхности клеток и субклеточных частиц, а также канальцев и пузырьков, пронизывающих протоплазму. Они не только разделяют клетку на отдельные отсеки, но и участвуют в регуляции множества связей и взаимодействий. Биохимическая цепочка биогенеза пептида завершается его взаимодействием со «своим» рецептором на мембране, внутри нее или внутри клетки на основе химического закона «узнавания». С этого момента процесс обретает новое качество — он превращается в результат.
Тетрапептид кортаген Аіа-Оіи-А8р-Рго — синтетический аналог пептидных биорегуляторов из коры головного мозга — мощный стимулятор подавленной при стрессе цитотоксической активности КК-клеток. Кроме того, его применение является перспективным для коррекции нарушений функций мозга [3].
Цель настоящей работы — построение модельной мембраны нервной клетки и исследование взаимодействия с ней тетрапептида Аіа-Оіи-А8р-Рго.
Материалы и методы исследований. Согласно жидкокристаллической модели [12], мембрана представляет собой текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки. Белок в мембране нервной клетки составляет 55,3 % от сухой массы бислоя, 44,7 % приходится на липиды, вода же составляет до 10 % от общей массы мембраны [1]. Липиды представлены фосфолипидами (69,5 % от общей массы липидов), а также холестерином и галактолипидами. В настоящей работе белки, образующие рецепторы, поры и каналы, рассматриваться не будут. Основными фосфолипидами
© А. А. Малицкий, Б. Ф. Щеголев, В. Е. Стефанов, М. Л. МакКи, В. Х. Хавинсон, 2008
нервных клеток мозга являются фосфатидилхолин (ФТХ), фосфатидилэтаноламин (ФТЭ) и фосфатидил-серин (ФТС) [1], из которых и был построен бислой модельной мембраны.
Вначале с помощью программы HyperChem 7.Q [1Q] были построены молекулы трех фосфолипидов: фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, а затем проведены расчеты их равновесной геометрии методом молекулярной механики MM+ [1Q].
Далее была проведена полная оптимизация геометрических параметров этих молекул полуэмпи-рическим методом MNDO [1Q]. Для получения данных о длинах связей, валентных и торсионных углах использовалось силовое поле gmx forcefield [1З]. На следующем этапе с помощью программы Gromacs [1З] для каждого из трех фосфолипидов была построена отдельная модельная мембрана. Для каждой молекулы, помещенной в пространственную ячейку, первым делом проводилась минимизация энергии методом спаренных градиентов (conjugate gradients) [1З]. Молекула размножалась с целью образования бислоя, построенного из 2QQ молекул (по 1Q в ряду по осям x и y, 2 по оси z) так, чтобы полярные головки были обращены наружу, а гидрофобные хвосты внутрь мембраны.
Путем слияния трех однокомпонентных мембран удалось получить две модельные двух- и трехкомпонентные мембраны. Полученные мембраны были сжаты, отминимизированы, а ячейки заполнены
водой. В результате двухкомпонентная мембрана (рис. 1) содержит: 140 молекул ФТХ, 60 молекул ФТЭ и 7 068 молекул воды, а трехкомпонентная мембрана соответственно содержит: 11Q молекул ФТХ, 6Q молекул ФТЭ, 30 молекул ФТС, б З8З молекул воды и 30 ионов Na+ для нейтрализации отрицательных зарядов ФТС.
Далее обе мембраны рассчитывались методом молекулярной динамики [7], т. е. моделировалось поведение мембран при заданных условиях на заданном отрезке времени. Весь расчет производился в два этапа. На первом этапе расчеты производились при постоянных объеме (постоянный размер ячейки) и температуре (так называемый NVT ансамбль) для нейтрализации «плохих» контактов, в течение короткого отрезка времени 5Q пс. На втором — расчеты производились уже при постоянном давлении и температуре, для каждой из мембран система уравновешивалась за счет изменения размера ячейки (NPT ансамбль) на отрезке времени 4 нс. Временной шаг интегрирования составлял dt = Q,QQ1 пс для первого этапа и dt = 0,003 пс для второго этапа. Для поиска окружения каждого атома использовался алгоритм grid [1З].
При расчетах электростатических взаимодействий использовался алгоритм PME [1З]. Расстояния усечения Кулоновского взаимодействия и взаимодействия Леннарда-Джонса составляли соответственно rcoulomb = 0,9 нм; rvdw = 0,9 нм. При термостатировании и баростатировании использовался метод Берендсена [1З], [7] Tcoupl=berendsen; Pcoupl=berendsen. Температура и давление составляли T = З00 K; P = 1 бар. Тип баростатирования — полуизотропный: Pcoupltype = semiisotropic [1З]. Алгоритм, отвечающий за корректировку длин связей — SHAKE [1З].
Рядом авторов настоящей работы уже были предприняты квантово-химические расчеты пространственного и электронного строения молекулы Ala-Glu-Asp-Pro [8]. В наших расчетах эта молекула с помощью программы HyperChem [10] была переведена в цвитерионную форму (в которой этот пептид находится при физиологических значениях PH). Затем геометрические параметры молекулы были полностью оптимизированы: вначале с помощью методов AMBER и MM+ [1Q], а затем методом steep с помощью программы Gromacs [1З] (см. рис.1).
На следующем этапе работ тетрапептид Ala-Glu-Asp-Pro был размещен над поверхностью как трех, так и двухкомпонентной мембраны. Система мембрана-пептид рассчитывалась методом молекулярной динамики на отрезке времени в б нс. После этого пептид был погружен внутрь двухкомпонентной
Рис. 1. Пространственная структура цвитерионной формы молекулы тетрапептида Л1а-О1и-Л8р-Рго после полной оптимизации геометрических параметров
модельной мембраны. Для внедрения короткого пептида в фосфолипидном слое была подготовлена впадина (ее глубина соответствовала толщине одного слоя фосфолипидов ~ 2,4 нм), путем удаления из слоя трех молекул ФТХ и трех молекул ФТЭ. Далее полученная система рассчитывалась в течение 11 нс методом молекулярной динамики для изучения взаимодействия тетрапептида и мембраны. Предпринятое исследование потребовало значительных вычислительных ресурсов, поэтому расчеты выполнялись в Санкт-Петербургском филиале Межведомственного суперкомпьютерного центра и на суперкомпьютере CRAY-J9Q-Unicos Аубурнского университета США.
Обсуждение результатов исследований. Трехкомпонентная мембрана и ее взаимодействие с тетрапептидом. Прежде всего необходимо отметить, что для построенной трехкомпонентной мембраны стабильным оказался вариант расчета, при котором большая часть молекул ФТС сконцентрировалась в одной области мембраны, тогда как молекулы ФТХ и ФТЭ распределены в мембране достаточно равномерно (рис. 2). Молекула тетрапептида Ala-Glu-Asp-Pro была произвольно (Ala и Glu направлены в сторону бислоя) размеще-
на над поверхностью трехкомпонентной мембраны. По данным графиков профилей плотности (количество атомов определенного типа на единицу объема), вдоль оси х пептид за время счета, составившее 8,3 нс, переместился над поверхностью мембраны из области с высокой концентрацией ФТС в область его низкой концентрации. Согласно полученному в результате расчетов (после первых 50 пс) профилю плотности для рассматриваемой системы, молекула тетрапептида располагается в области от 2,2 до 3,6 нм (плотность ФТС составляет ~ 5 ат/нм3), тогда как после 8,3 нс расчетов пептид перемещается на 1 нм по оси х в область от 3,25 до 4,7 нм, которая характеризуется значительным понижением плотности ФТС ~ 2 ат/нм3. Таким образом, взаимодействие кортагена с трехкомпонентной мембраной характеризуется его активным перемещением над поверхностью мембраны к области с малой концентрацией ФТС, что обусловлено его электростатическим отталкиванием от отрицательно заряженных молекул ФТС. Полученный результат позволил упростить задачу взаимодействия молекулы Л1а-01и-Л8р-Рго с модельной мембраной и продолжить исследование с двухкомпонентной мембраной.
Общие характеристики двухкомпонентной мембраны. На рис. 3 представлен вид двухкомпонентной модельной мембраны нервной клетки вдоль оси г (разрез в плоскости хх). Области
Рис. 2. Общий вид липидного бислоя трехкомпонентной модельной мембраны нервной клетки в плоскости ху Черным цветом обозначены молекулы ФТС, серым — молекулы ФТХ, светло-серым — молекулы ФТЭ. Фосфолипиды ориентированы неполярными алкильными фрагментами внутрь мембраны, а полярными группировками — наружу; молекулы воды с обеих сторон мембраны опущены.
Рис. 3. Общий вид липидного бислоя двухкомпонентной модельной мембраны нервной клетки в плоскости ху Светло-серым цветом обозначены молекулы ФТХ, темносерым — молекулы ФТЭ; выше и ниже бислоя находятся молекулы воды (короткие штрихи).
Таблица 1
Основные характеристики двухкомпонентной мебраны
Параметры мембраны Численное значение
Е пот -453615 Кдж/моль
Е общ -374269 Кдж/моль
с 4,9 нм
S ■ V сл сл 48,8нм2; 474,2 нм3
5 ■ V мол мол 0,5нм2; 4,7 нм3
К 0,26 нм
Примечание. Епот — потенциальная энергия системы; Еобщ — общая энергия системы; С — толщина мембраны; 5сл, Усл — площадь и объем фосфолипид-ного слоя; £мол, Умол — площадь и объем мембраны, приходящиеся на одну молекулу; Яср — среднее расстояние между молекулами ФТХ и ФТЭ.
Таблица 2
Распределение атомов в двухкомпонентной мембране, межатомные расстояния г и координационные числа Сп
с наибольшей плотностью по оси х (1,52,5 нм; 6,5—7,5 нм) соответствуют липидным головкам. Области (0-1,5 нм; 7,5-9 нм) соответствуют водной фазе (на рис. 3 не обозначена). И, наконец, область с наименьшей плотностью в центре графика (3-6 нм), так называемое ядро мембраны, соответствует углеводородным гидрофобным хвостам фосфолипидов. Основные параметры модельной двухкомпонентной мембраны, полученные в результате расчетов методом молекулярной динамики, представлены в табл. 1. По расстоянию между пиками, соответствующими атомам фосфора на графике плотности этих атомов, можно оценить толщину мембраны: С ~ 4,9 нм, что хорошо согласуется с литературными данными, где С~ 5,0 нм [1]. В табл. 2 представлены данные для сферически симметричной функции радиального распределения ФРРА (г), которая носит статистический характер и обозначает вероятность обнаружения атома того или иного вида, находящегося на расстоянии г от данного. ФРРА (г) имеет несколько максимумов по большей части два-три, которые соответствуют первым, вторым и третьим ближайшим соседям [2]. Во втором столбце этой таблицы представлены расстояния, соответствующие максимальной вероятности встретить рассматриваемый атом (группу атомов). В третьем столбце указаны расстояния, соответствующие минимальной вероятности встретить рассматриваемый атом; эти расстояния определяют координационную сферу. В четвертом столбце таблицы приведены значения координационных чисел (число атомов вокруг выбранного атома в пределах координационной сферы), которые определяются из графика функции кумулятивного распределения. Полученные данные показывают, что структура упаковки обобщенных атомов азота фосфолипидов, азотов ФТЭ относительно азотов ФТХ и азотов ФТХ относительно друг друга наиболее близка к линейной (каждый из этих атомов координирован к двум другим таким же атомам [11]). Таким образом, распределение ФТЭ и ФТХ в мембране в целом достаточно равномерное.
Тетрапептид над двухкомпонентной мембраной. Молекула Л1а-01и-Л8р-Рго снова была произвольным образом размещена над модельной двухкомпонентной мембраной параллельно ее поверхности (расстояние от К-конца до фосфолипидного бислоя составляет 0,35 нм). Проводимые расчетные шаги показали, что небольшие структурные перестройки самого пептида происходят в течение всего времени счета, в результате чего эта молекула образует над мембраной «дугу», гидрофобные концы которой обращены к мембране, а гидрофильная середина — к воде. Кроме того, анализ параметров
Атомы г, нм гт, нм с„
К-К 0,63 0,78 2,1
N (Н)-К (Н) 0,63 0,79 1,6
N (Н)-М (Е) 0,48 0,79 0,8
N (Е)-Ы (Е) 0,38 0,62 0,8
N (Е)-Ы (Н) 0,48 0,79 1,8
Примечание. N — все атомы азота, N (Н) — атомы азота ФТХ, N (Е) — атомы азота ФТЭ.
RMSD (среднеквадратичное отклонение от первоначальной структуры) показывает, что основные активные передвижения Ala-Glu-Asp-Pro осуществляются вдоль поверхности мембраны в первые 2,2 нс.
В это же время начинается сближение тетрапептида с ФТX, а затем и с ФТЭ, что характеризуется уменьшением межмолекулярного расстояния с 0,3 до 0,16 нм. N-конец пептида активно взаимодействует с гидрофильными частями фосфолипидов (в основном с фосфатидилхолином) с образованием водородных связей и стабилизацией положения пептида относительно ФТX; PRO не образует водородных связей.
Диффузия тетрапептида в двухкомпонентную мембрану. В работе [9] для рассмотрения возможных процессов диффузии и взаимодействия пептидов с мембраной был предложен метод «активного погружения», согласно которому в бислое создается впадина путем удаления некоторого числа фосфолипидов с поверхности, и в нее помещается пептид. Этот метод был использован и в настоящей работе. Искусственное погружение возможно только при удалении определенного числа фосфолипидов (в нашем случае 3 ФТX и 3 ФТЭ), так как иначе не избежать перекрывания координат и возникновения нескомпенсированных сил.
Анализ коэффициентов диффузии молекулы тетрапептида Ala-Glu-Asp-Pro через модельную двухкомпонентную мембрану (табл. 3) показывает, что за время счета 10 нс пептид в основном мигрировал под поверхностью мембраны вдоль нее, причем гораздо более активно, чем когда он находился над поверхностью бислоя, поскольку внутри мембраны пептид не обременен водородными связями с окружением.
Основные передвижения пришлись на первые 4 нс счета. В первые 2,1 нс пептид двигался в основном по оси у, а в последующие 8 нс в основном вдоль оси x приповерхностного слоя мембраны.
Таким образом, данные расчетов показывают, что тетрапептид Ala-Glu-Asp-Pro, погруженный в мембрану, движется в ней тангенциально, при этом не наблюдаются ни его погружение внутрь гидрофобной области мембраны, ни выталкивание к поверхности. Можно полагать, что в реальной мембране такое движение будет происходить вплоть до встречи пептида с рецептором или каналом.
В свою очередь и структура молекулы Ala-Glu-Asp-Pro также подвергается некоторым изменениям. Стабилизация всех этих параметров, по данным анализа радиуса циркуляции Rg (radius of gyration) белка (Rgx, Rgy, Rgz и Rg выходят на плато), достигается после 4,7 нс расчетов. В целом структура пептида напоминает «дугу», образованную им над поверхностью мембраны, но развернутую наоборот: таким образом, Ala направлен в гидрофобную часть мембраны, N-конец и Asp развернуты «наверх» в сторону водной фазы, а Glu и Pro располагаются параллельно поверхности мембраны. Кривая RMSD тетрапептида выходит на плато со средним значением RMSD = 0,115 нм, т. е. к этому времени структура пептида в целом уравновешивается (Rg = 0,39 нм) в соответствии с внешними условиями и окружением, а дальнейшие изменения его структурных параметров не превышают 0,025 нм в течение всего времени счета. В целом структура молекулы кортагена за время счета остается достаточно консервативной, хотя имеются литературные
Таблица З
Компоненты коэффициента диффузии тетрапептида, помещенного внутрь мембраны
Расчетное время
Компоненты коэффициента диффузии D (1e - 5 см2/с) 0-2,1 нс 2,1-4,2 нс 4,2-1Q нс
Dx Q,QQ9 Q,Q4Q Q,Q24
Dy Q,162 -0,001 Q,Q11
Dz Q,Q14 Q,QQ1 0,003
данные о пептидах, которые при подобном помещении в мембрану многократно перестраивали свою конформацию [11]. Для кортагена это связано с тем, что исследуемая молекула обладает определенной конформационной жесткостью: Pro обладает малоподвижным пирролидиновым кольцом, а Asp и Glu — достаточно разветвленными боковыми фрагментами, затормаживающими их относительное перемещение. Нельзя не учитывать и электростатическое отталкивание карбоксильных групп Glu и Asp друг от друга.
Следует отметить, что добавление пептида в модельную мембрану не привело к изменению ее структурных параметров: взаимные расстояния между фосфолипидами и координационные числа практически не изменились. Начиная со счета 1 500 пс, полностью сформировывается стабильное фосфатидилхолиновое окружение пептида (среднее расстояние от кортагена до ФТХ = 0,3 нм, расстояние до фосфатидилэтаноламина колеблется от 0,3 до 0,45 нм). Толщина бислоя мембраны практически не изменилась (А ~ 0,03 нм).
Выводы. Проведено построение двух- и трехкомпонентных бислойных модельных мембран нервных клеток, состоящих из молекул фосфатидилхолина, фосфатидилэта-ноламина, фосфатидилсерина и молекул воды. Расчеты трехкомпонентной мембраны, включающей противоионы Na+ для нейтрализации отрицательных зарядов ФТС, показали, что в ней присутствует область с высокой концентрацией ФТС. При размещении тетрапептида Ala-Glu-Asp-Pro над поверхностью этой мембраны наблюдается его перемещение из области с высокой концентрацией ФТС в область ее низкой концентрации. Анализ взаимодействия кортагена с двухкомпонентной мембраной (ФТХ, ФТЭ) показывает, что при его размещении над мембраной он образует «дугу», гидрофобные концы которой обращены к мембране, а гидрофильная середина — к воде, при этом его основные перемещения осуществляются вдоль поверхности мембраны в первые 2,2 нс, в дальнейшем его движение затормаживается образованием водородных связей с фосфолипидами.
Исследование диффузии молекулы Ala-Glu-Asp-Pro через модельную двухкомпонентную мембрану показывает, что за время счета 10 нс пептид в основном активно мигрировал под поверхностью мембраны вдоль нее. Структура самого пептида напоминает «дугу», образованную им над поверхностью мембраны, но развернутую наоборот, так, что Ala направлен в гидрофобную часть мембраны, N-конец и Asp развернуты «наверх» в сторону водной фазы, Glu и Pro располагаются параллельно поверхности мембраны.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования РФ (Грант РНП 2.1.1.4139) и Инновационного образовательного проекта СПбГУ «Инновационная образовательная среда в классическом университете (пилотный проект «Нанобиология»)».
Summary
Malitskii А. А., Shchegolev B. F., Stefanov V. E., М~cKeeМ. L, Khavinson V. H. Molecular dynamics investigation for the Ala-Glu-Asp-Pro tetrapeptide imteraction with nervous ceil lipid model membrane.
Simulation of a plasmatic membrane of a nervous cell from the cerebral cortex was carried out. The model phospholipid bilayer consists of 200 molecules of dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphat idylethanolamine and dipalmitoylphosphatidyserine, in proportion corresponding to their content in the natural membrane. The membrane structure was calculated by molecular dynamics methods. Characteristics obtained from the simulation are in good agreement with experimental data. Interaction of Ala-Glu-Asp-Pro tetrapeptide with the model membrane was investigated. The tetrapeptide was shown to move along the membrane surface from the region with high dipalmitoylphosphatidyserine concentration to the region where it is low. When immersed into the membrane, the tetrapeptide moves in the direction parallel to membrane surface.
Key words: molecular simulation, membrane of a nervous cell, tetrapeptide, molecular dynamics.
E-mail: [email protected]
1. Ашмарин И. П. Биохимия мозга. СПб., 1999.
2. Воронцов В. А., Васильева Н. Д. Определение параметров ближнего порядка в расположении атомов аморфных веществ по данным электронографических исследований. М., 2002. C. 16-17.
3. Гумен А. В., Шанин С. Н., Козинец И. А., Малинин В. В., Рыбакина Е. Г. Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс при стрессе и ее коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами // Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 2. С. 37-41.
4. Дьяконов М. М., Трофимова Т. В. Клинические аспекты применения ретиналамина, офталамина и других пептидных биорегуляторов // Terra Medica. № 1. СПб., 2001. http://terramedica.spb.ru/1_2001/ dyakonov.htm
5. Полунин Г. С., Шеремет Н. Л. Экспериментальное обоснование использования нейропротектора «Семакс 0.1 %» в лечении заболеваний зрительного нерва. М., 2001. http://www.semax.ru/SEMAX/ semax_01_eyes.htm
6. Смирнов В. С. Тимоген в животноводстве и ветеринарии. СПб., 2004.
7. Шайтан К. В., Сарайкин С. С. Молекулярная динамика. М., 1999. С. 217.
8. Щеголев Б. Ф., Плахова В. Б., Рогачевский И. В., Хавинсон В. Х., Малинин В. В., Крылов Б. В. Ингибирующее действие кортагена на натриевые токи сенсорных нейронов; исследование методами локальной фиксации потенциала и квантовой химии // Клиническая патофизиология. 2003. Т. 2. С. 7-13.
9. Antoranz S., Lemaitre V. Unfolding and Extraction of a Transmembrane a-Helical Peptide: Dynamic Force Spectroscopy and Molecular Dynamics Simulations // Biophys. J. 2005. Vol. 89. P. 2-3.
10. HYPERCHEM Professional Release 7.0. A Molecular Vizualization and Simulation Software Package. User Manual. 2003. P. 860-863.
11. Jensen M., Mouritsen O. Simulations of a membrane-anchored peptide: structure, dynamics, and influence on bilayer properties // Byophis. J. 2004. Vol. 86. P. 2-18.
12. Singer S. J., Nicolson G. L. The Fluid Mosaic Model of the Structure of Cell Membranes // Science. 1972. P. 731-742.
13. Van der SpoelD., LindahlE., HessB. Gromacs, User Manual version 3.2. 1991-2000 // Department of Biophysical Chemistry, University of Groningen. Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, Netherlands.
