CC BY
50
Том 153, кн. 3
Естественные науки
2011
УДК 541.12.038.2:536.75:536.728
ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ГЕПТАПЕПТИДА Aß16-22 В РАСТВОРЕ И КОМПЛЕКСЕ ГЕПТАПЕПТИД -МОДЕЛЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ
К.С. Усачев, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, О.Н. Анцуткин, С. Афонин, А.В. Аганов, В.В. Клочков
Аннотация
Методами ЯМР 1Н спектроскопии и двумерной ЯМР (TOCSY, HSQC-HECADE, NOESY) спектроскопии исследовано и описано пространственное строение активного фрагмента бета-амилоида Aß1-40 - гептапептида Aß16-22 (Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu) -в растворе и комплекса гептапептид - модель поверхности мембраны клетки (мицеллы, на основе додецилсульфата натрия). Комплексообразование подтверждено изменением химических сдвигов ЯМР 1Н спектров гептапептида, а также знаками и величинами ядерного эффекта Оверхаузера в различных средах. Проведено сравнение пространственного строения гептапептида, определенного в растворе боратного буфера и в комплексе Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu - модель поверхности мембраны клетки.
Ключевые слова: структура, бета-амилоид, мицеллы, ЯМР 1Н спектроскопия, двумерная ЯМР (TOCSY, HSQC-HECADE, NOESY) спектроскопия.
Введение
Болезнь Альцгеймера (также сенильная деменция альцгеймеровского типа) -неизлечимое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся накоплением Р-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в тканях головного мозга. Бляшки состоят из фибрилл, образованных в результате агрегации малых пептидов длиной в 39-43 аминокислотных остатков, именуемых амилоидными Ap-пептидами. Эти пептиды являются продуктом энзиматического расщепления более крупного белка-предшественника - APP (amyloid precursor protein) [1]. Этот трансмембранный белок играет важную роль в росте нейрона, его выживании и восстановлении после повреждений. В свою очередь, Ap-пеп-тиды, как известно [1, 2], участвуют в механизмах иммунной защиты.
Для создания лекарственных препаратов, препятствующих развитию се-нильной деменции, необходимо иметь точную информацию о механизме агрегации альцгеймеровских Р-амилоидов. Предполагается, что ядром агрегации является активный участок этого пептида между 16-м и 22-м аминокислотными остатками [2]. По этой причине пространственное строение фрагмента Ap16-22 (Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu) представляет интерес. Нейротоксичное действие альцгеймеровских амилоидных пептидов проявляется в результате их взаимодействия с клеточной мембраной [3]. Отсюда описание пространственного строения комплекса Р-амилоид - мембрана, так же как и строения Р-амилоида в растворе, позволит подойти к фундаментальному пониманию механизмов, протекающих
на поверхности клеток, что может дать возможность поиска лекарственных препаратов, ингибирующих образование сенильных бляшек.
Экспериментальная часть
Синтез исследуемого пептида Ap16-22 выполняли методом твердофазного синтеза [4, 5] с помощью автоматического синтезатора пептидов ABI 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [6] при использовании аминокислот, защищенных 9-флуоренилметокси-карбонильными группами, при этом осуществлялся контроль процесса по проводимости реакционной смеси. Отделение пептида от подложки и защитных групп производили в кислой среде на основе трифторуксусой кислоты. Очистку пептида производили методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии на приборе Series 200 Perkin Elmer HPLC System (Waltham, MA, USA) в градиенте вода - ацетонитрил. Качество конечного продукта характеризовали методом MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption-ionization) масс-спектрометрии. Пептид до использования хранился при температуре 75 °С.
Регистрацию 1D и 2D (:H-:H, :H-13C) спектров ЯМР гептапептида Ap16-22 в растворах боратного буфера (Na2B4O7-10H2O + D2O) и в смеси и-алкил-поли-(этилен)гликоля (С12Е5), нормального спирта (гексанол) и исходного боратного буфера проводили на ЯМР-спектрометре AVANCE II-500 (Bruker) (500 МГц (1Н), 125.76 МГц (13С)) при температуре 293 K. Спектрометр работает в режиме внутренней стабилизации по линии резонанса Н. При записи спектров ЯМР Н использовали 90°-импульсы и задержки между импульсами равнялись 2 с; ширина спектра была 9.40 м.д.; число накоплений от 10. Для отнесения сигналов в спектрах ЯМР 'H гептапептида AP16-22 использовали двумерную 2D TOCSY спектроскопию. Образцы представляли собой растворы соединения в соответствующих средах, концентрации веществ 0.5% (весовых) при записи ЯМР 1Н. Отсчет химических сдвигов производили от линий резонанса эталонных жидкостей.
При проведении двумерных ЯМР-экспериментов (NOESY-модификация) в молекулярной системе время задержки между последовательностями импульсов было в 3 раза больше, чем усредненное время продольной релаксации Т1 для протонов гептапептида Ap16-22. Спектры записывали с использованием фазо-чувствительной методики для 1024 точек F2-координаты и 256 точек F1-коорди-наты; использовали экспоненциальную фильтрацию вдоль обеих координат. Параметр времени смешивания Tm выбирали равным 0.10, 0.30, 0.40, 0.60 и 0.80 с.
ЯМР-спектроскопия гептапептида А01б-22 в растворе
Гептапептид Ap16-22 (рис. 1) является активным фрагментом Р-амилоида Ap1-40. Предполагается, что данный фрагмент отвечает за агрегацию между р-амилоидами. Слабая растворимость пептида Ap16-22 в воде обусловила задачу поиска соответствующих водосодержащих смесей. В конечном итоге был выбран боратный буфер с pH 8.4. Отметим, что в этой среде длительное время не наблюдалась агрегация исследуемого пептида.
ЯМР 1Н спектр гептапептида AP16-22 в растворе боратного буфера представлен на рис. 2 (химические сдвиги приведены в табл. 1).
Рис. 1. Структурная формула гептапептида Aß16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2)
Рис. 2. 1Н (500 МГц) спектр ЯМР гептапептида Aß16-22 в растворе боратного буфера (Na2B4O7T0H2O + D2O) при pH 8.4; Т 293 К; 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС
Табл. 1
ЯМР 1H химические сдвиги (¿H, м.д., относительно ТМС) гептапептида Aß16-22 в растворе боратного буфера (Na2B407-10H20 + D2O) при pH 8.4; Т 293 К
Остаток Химические сдвиги
CttH CßH CYH Прочие
NAc 2.05
Lys16 4.26 3.00 1.38 1.7 (5), 2.95 (e)
Leu17 4.36 1.60 1.49 0.86 (50, 0.93 (52)
Val18 4.06 1.94 0.78, 0.84
Phe19 4.20 2.07, 2.28
Phe20 4.20 2.07, 2.28
Ala21 4.13 1.34
Glu22 4.35 2.38, 2.11 2.41
Рис. 3. Двумерный 1Н-1И TOCSY спектр ЯМР гептапептида Äßi6-22 NH2 в растворе боратного буфера (Na2B4O7-10H2O + D2O) при pH 7.4; Т 293 К
Табл. 2
ЯМР 13С химические сдвиги гептапептида Aß16-22 в растворе боратного буфера (Na2B4O7-10H2O + D2O) при pH 7.4; Т 293 К
Остаток Химические сдвиги
CttH CßH CYH Прочие
NAc 21.5
Lys16 53.18 16.2 26.4 (5), 39.4 (e)
Leu17 20.7 (51), 22.0 (52)
Val18 53.6 18.27 (Yl), 17.57 (Y2)
Phe19 33.4
Phe20 33.4
Ala21 16.5
Glu22 31.0
С учетом данных о наличии кросс-пиков в двумерных 1H-1H TOCSY (рис. 3) и 1H-1H COSY спектрах и сведений из литературы о химических сдвигах протонов в аминокислотных фрагментах [7, 8], были отнесены сигналы протонов CH-, CH2- и С^-групп аминокислот исследуемого гептапептида.
Величины химических сдвигов ЯМР 13C были получены на основе анализа двумерного 1H-13C HSQC спектра ЯМР (рис. 4) гептапептида Aß16-22 в растворе боратного буфера (химические сдвиги приведены в табл. 2).
Рис. 4. Двумерный H- C HSQC спектр ЯМР гептапептида Aßi6_22 в растворе боратного буфера (Na2B4O7-mH2O + D2O) при pH 7.4; Т 293 К
Пространственное строение гептапептида Aß16-22, определенное анализом остаточного диполь-дипольного взаимодействия
Для определения пространственной структуры небольших молекул (например, олигопептидов) двумерная ЯМР NOESY спектроскопия не всегда эффективна. Это связано с малыми временами корреляции движения таких молекул в растворе, что приводит к слабым по интенсивностям кросс-пикам в двумерных спектрах ЯМР NOESY. Известно, что в растворах диполь-дипольное взаимодействие между магнитными ядрами полностью усредняется. Если растворить молекулярную систему в лиотропной жидкокристаллической системе, то из-за соударений о магнитно-ориентированные молекулярные образования, движение молекул перестает быть изотропным. Эта анизотропия в движении молекул приводит к появлению диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами 1H и 13C (1DCH), что проявляется в ЯМР-спектрах в виде остаточного ди-поль-дипольного взаимодействия. Значение константы зависит от угла между направлениями магнитного поля и ^-^-связи. С помощью расчетов можно связать значения наблюдаемых констант с пространственным расположением межъядерных векторов и получить структуру соединения в растворе.
Экспериментальные данные величин взаимодействия получены с помощью двумерного 'H-13C HSQC-HECADE-эксперимента [9].
Спектр HSQC-HECADE эксперимента для гептапептида Aßi6-22, растворенного в боратном буфере, приведен на рис. 5. Из данного эксперимента были получены значения прямых констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) между ядрами H и C в герцах.
Рис. 5. Двумерный Н- С ЖрС-НЕСАБЕ спектр ЯМР гептапептида Лр16-22 в растворе боратного буфера (^В^'Ю^О + Б20) при рН 7.4; Т 293 К
Рис. 6. Двумерный Н- С ЖрС-НЕСАБЕ спектр ЯМР гептапептида Лр16-22 в смеси и-адкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), нормального спирта (гексанол) и исходного боратного буфера(№2В407-10Н20 + Б20); Т 293 К
Табл. 3
Экспериментальные величины остаточного диполь-дипольного взаимодействия гепта-пептида AP16-22, Гц
Остаток 1DCH
CH CeH CH Прочие
Lys16 -16.2 3 -5.9 (e)
Leu17 -2.4 (81)
Ala21 -2.5
Glu22 6.1
All couplings
• 16.3S7 Back 6.002
Рис. 7. Соотношение между наблюдаемыми величинами 1БСН для гептапептида Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu, растворенного в лиотропной жидкокристаллической среде, и рассчитанными величинами 1БСН в конформации, определенной с помощью программы DYNAMO
Затем гептапептид был растворен в жидкокристаллической лиотропной системе, представляющей собой смесь и-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), нормального спирта (гексанол) и исходного боратного буфера [10], и с помощью двумерного 1H-13C HSQC-HECADE-эксперимента были получены прямые константы спин-спинового взаимодействия в данной среде (:JCH + :DCH). Спектр двумерного H- C HSQC-HECADE-эксперимента для гептапептида растворенного в лиотропной среде приведен на рис. 6.
Величины остаточного диполь-дипольного взаимодействия (^СН) (табл. 3) были получены вычитанием из значений прямых констант спин-спинового взаимодействия, определенных в жидкокристаллической лиотропной среде (Jch + :DCH), величин КССВ в исходном боратном буфере (!JCH). Анализ полученных величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия (:DCH) осуществлялся с помощью метода молекулярной механики в программе DYNAMO [11].
Данная программа позволяет связывать значения наблюдаемых констант и пространственное расположение межъядерных векторов относительно внешнего магнитного поля в рамках известной конформации исследуемой молекулы. Критерием соответствия между рассчитанной и реальной структурами является
линейная корреляция между наблюдаемыми и рассчитанными значениями остаточных величин диполь-дипольного взаимодействия. Оптимизация исходной конформации гептапептида путем поворота отдельных фрагментов молекулы относительно других позволила выбрать единственную пространственную структуру, для которой наблюдалась линейная корреляция между наблюдаемыми и рассчитанными величинами 1DCH (рис. 7).
Рассчитанная структура гептапептида Ap16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2) в растворе, для которой наблюдалось лучшее соответствие между наблюдаемыми и рассчитанными величинами диполь-дипольного взаимодействия, приведена на рис. 12, а.
Пространственное строение гептапептида Ар1б-22 в комплексе:
олигопептид - синтетическая модель поверхности мембраны клетки на основе додецил сульфата натрия
Протеины могут взаимодействовать с мембраной клетки преимущественно двумя способами: проникновением сквозь бислой (и тогда говорят об интегральных мембранных белках) или образованием комплекса с поверхностью бислоя (периферийные или внешние мембранные белки) [1]. В настоящее время ЯМР-спектроскопия широко используется для исследования структуры липид-ной мембраны, однако ее приложения к исследованию комплексов протеин -мембрана клетки все еще ограничены.
В качестве примеров первых исследований методом ЯМР-спектроскопии комплексов протеин - мембрана можно привести исследования амфифильных пептидов, таких как мелиттин (melittin), пептид из пчелиного яда (26 аминокислотных остатков), и пептид 5-гемолизин (5-hemolysin), небольшой пептид, выделенный из Staphylococcus aureus, которые имеют тенденцию агрегировать в водном растворе [12-14].
Известно, хорошей моделью мембранной поверхности и подходящей для структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии [13, 15] являются мицеллы и мицеллярные комплексы. Одной из наиболее полных работ, выполненных в этом направлении, является работа [16], в которой методами спектроскопии ЯМР (TOCSY, HSQC, HMBC, NOESY) изучается структура комплекса протеин (Gly-Leu-Phe-Asp-Lys-Leu-Lys-Ser-Leu-Val-Ser-Asp-Asp-Lys-Lys) - мицеллы.
Для исследования комплексов протеин - поверхность мембраны доступно два варианта синтетической модели поверхности мембраны клетки: мицеллы на основе поверхностно-активных веществ и небольшие фосфолипидные везикулы [12, 16]. Среда, которая наиболее близко соответствует нативному бис-лою липида, состоит из фосфолипидных везикул, минимальный размер частиц которых составляет 250-300 А в диаметре. Частицы такого размера имеют большое вращательное время корреляции (тс ~ 4-10-6 с). Длинные времена корреляции приводят к коротким значениям времен поперечной релаксации Т2, что, в свою очередь, приводит к уширению резонансных сигналов в спектрах ЯМР и к увеличению спиновой диффузии в 1Н NOE-экспериментах [17]. Короткие времена поперечной релаксации Т2 приводят к уменьшению информативности двумерных ЯМР-экспериментов (TOCSY, HSQC, HMBC, NOESY), необходимых как для отнесения резонансных сигналов, так и для определения
пространственной структуры протеинов в комплексе [17, 18]. Таким образом, частицы такого размера являются неподходящими для двумерных экспериментов, и отсюда следует, что структурные исследования, использующие внутримолекулярные 1Н К0Е-эксперименты, ограничены для молекул больших молекулярных масс, связанных с небольшими мицеллами поверхностно-активных веществ.
Известно, что поверхностно-активные вещества образуются амфифильными молекулами, обладающими гидрофобными и гидрофильными участками. Кроме фосфолипидов, формирующих бислои или мультибислои в водных средах, существуют и другие органические соединения, образующие мицеллярные системы, в которых мицеллы рассредоточены по всему объему, находящиеся в быстром обмене с мономерными структурами. Критическая концентрация мицел-лообразования поверхностно-активных веществ является концентрацией ПАВ в растворе, при которой в системе образуются в заметных количествах устойчивые мицеллы. Полярная группа мицелл поверхностно-активных веществ в водной среде расположена на оболочке мицеллы, которая является гидрофильной, а центральная часть мицеллы является гидрофобной [15, 16].
В водном растворе мицеллы ведут себя как глобулярные белки, содержащие от 60 мономерных молекул, при этом частицы такого размера имеют относительно небольшое вращательное время корреляции (тс ~ 5-10-8 с) [12]. Интересным с точки зрения ЯМР-спектроскопии является то, что при связывании протеина с мицеллами образуется комплекс протеин - мицелла, молекулярная масса которого становится больше, чем у несвязанного протеина, что может перевести протеин из разряда малых молекул, подпадающих под условие быстрого обмена, в разряд молекул, подпадающих под условие медленного обмена [17, 18]. Последнее обстоятельство позволяет использовать спектроскопию ЯМР К0Е8У при решении структурных задач и для небольших по количеству аминокислотных остатков протеинов.
О о
СНг(2) СН2(4) СН;(6) СНг<8) СНг(10) СНг<12) СН3(1) СНг(3> СНг(5) СН;(7) СНг(9} СНг(11) О О +
Рис. 8. Структурная формула додецилсульфата натрия
Мицеллярные системы на основе додецилсульфата натрия (ДСН) (рис. 8) образуются в воде при минимальной концентрации 8.1 мМ [12].
Большинство протеинов связывается с мицеллами ДСН в весовом соотношении (1.4 г ДСН и 1 г протеина) [16]. Мицеллы ДСН могут быть использованы для моделирования поведения протеинов на биологических мембранах для небольших гидрофобных протеинов, которые образуют комплексы, связываясь непосредственно с мицеллой ДСН. Отметим, что у синтетических мицелл ДСН, подобно многим биологическим мембранам, имеется поверхностно-отрицательный заряд. От величины этого заряда зависит критическая концентрация мицеллообразования ДСН при формировании мицеллы.
Определение концентрации додецилсульфата натрия в воде, при которой образуются мицеллярные системы, проводили с помощью ЯМР 1Н спектроскопии [19].
1 ..........I ■ ■ ■ 11 ■ ■ 1 1 I 1 ■ ■1 I..............|, ... |.... |.... |..............|.
ал 75 7Л 65 6Л 55 5Л 45 4Л 15 ЗД 15 70 15 II!
Рис. 9. ЯМР 1Н (500 МГц) спектр гептапептида МАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-МИ2 в растворе Н2О + Б20 с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии; Т 293 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС
Если поместить гептапептид в раствор с мицеллярными образованиями на основе додецилсульфат натрия [15, 16], то можно ожидать образования комплекса протеин - мицелла, молекулярная масса которого будет существенно больше, чем у несвязанного протеина. При этом протеин из разряда малых молекул, для которого сохраняется условие быстрого движения, переходит в разряд молекул, для которых справедливо условие медленного движения, что дает возможность применить метод К0Е8У спектроскопии ЯМР для установления структуры исследуемого пептида в комплексе с мицеллой.
Была исследована система: гептапептид АР16-22 (КАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-КИ2) - водный раствор с додецилсульфатом натрия (ДСН), который использовался в качестве модели мембраны. При концентрации (ККМ) ДСН в растворе больше, чем 4.3 г/л, происходило образование мицелл, что контролировалось с помощью ЯМР :Н спектроскопии.
ЯМР :Н спектр гептапептида АР16-22 (КАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-МИ2), растворенного с мицеллами на основе додецилсульфата натрия, представлен на рис. 9 (химические сдвиги приведены в табл. 4). Большие по интенсивности сигналы на спектре принадлежат сигналам протонов от ДСН.
Отнесение сигналов в спектре ЯМР 1Н гептапептида АР16-22 (КАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-КИ2) в растворе Н2О + Б2О с ДСН сделано на основании двумерных экспериментов ЯМР 'Н-И Т0С8У (рис. 10), данных предыдущих исследований и сведений из литературы [8] (табл. 4).
Сравнивая химические сдвиги гептапептида в растворе Н2О + Б20 с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии (табл. 4), и в растворе боратного буфера (Ка2Б407-10И20 + Б20) (табл. 1), можно видеть изменения этих величин. Отличие химических сдвигов в этих растворах, возможно, обусловлено изменением конформации молекулы гептапептида и образованием комплекса гептапептид - мицеллы на основе додецилсульфата натрия. Кроме того, в двумерном ЯМР :Н К0Е8У спектре гептапептида наблюдаются кросс-пики положительного знака, что характерно для молекул, подпадающих под условие медленного движения. Все вышеприведенные факты подтверждают образование комплекса гептапептид - мицеллы на основе додецилсульфата натрия.
8.4
ВЛ вЛ 7Я 7& 7.4
рргп
ррт
7.0
1.5
2.0
23
3.0
3.5
4.0
.. . И* V VI S(NhVg: BÍNHÍai & ? V
К' L17 e{NhVa TJH/b)4 ; Ч-- < L , A2*l(Nh Л») J, t
■ К" к &CNHUJ 16(NH/b i 1 с :— — L17(l — E22(l !«&). . IH/h) IHJb) "H 1—V18 r " Ñh№)
•4 i—E2Z0 IHfa)
\m F19(NH F1B(NH b)—jó ь)—9 "W-4G (NH№) P
o—1 '20 (NH/ 0
■ »-vie (NH/a)
К1 KNWB) L17(N I A2iqjH&)-l Ifa) —F1B(N O—F 41a) KXNHfa
Рис. 10. Область двумерного 1Н-1Н ТОС8У спектра ЯМР (7.2-8.5 м.д.) гептапептида МЛс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-Л1а-01и-ЫН2 в растворе Н2О + Б2О с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии; Т 293 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС
Табл. 4
ЯМР 1Н химические сдвиги (8Н, м.д., относительно ТМС) гептапептида МАс-ЬуБ-Ьеи-Уа1-РИе-РИе-Л1а-01и-КН2 в растворе Н2О + Б2О с додецилсульфатом натрия; Т 293 К, раствор боратного буфера (№2В4О7-ШН2О + Б2О) (в скобках приведены данные химических сдвигов для раствора боратного буфера из табл. 1)
Остаток Химические сдвиги, м.д.
NH CaH CeH CYH прочие
Lys16 7.41 4.10 (4.26) 1.75 (3.00) 1.45 1.65 (5), 2.94 (e)
Leu17 8.02 4.30 (4.36) 1.72 (1.60) 1.52 0.93(5:), 0.86 (52)
Val18 7.57 3.80 (4.06) 1.97 (1.94) 0.82(Y1), 0.70 (Y2)
Phe19 7.64 4.23 (4.20) 2.84; 2.75 (2.07; 2.28) 6.86(2/6); 7.12(3/5)
Phe20 7.52 4.44 (4.20) 3.17; 2.93 (2.07; 2.28) 7.2 (2/6); 6.95 (3/5)
Ala21 7.85 4.15 (4.15) 1.36 (1.34)
Glu22 8.01 4.13 (4.35) 2.02; 1.89 (2.38; 2.11) 2.27
Для определения межпротонных расстояний, непосредственно характеризующих пространственную геометрию гептапептида ЛР16-22 (КЛс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-Л1а-01и-КН2) в растворе, записывали двумерные ЯМР КОЕ8У спектры
Рис. 11. Область двумерного ЯМР 1Н-1Н ШЕБУ спектра (6.4-9.0 м.д.) гептапептида МАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-ЫН2 в растворе Н2О + Б20 с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии; Т 293 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС. Время смешивания тт 0.4 с
(рис. 11) с вариацией времени смешивания тт. Наблюдались кросс-пики в двумерных ЯМР NOESY спектрах между сигналами протонов исследуемого соединения, относящихся к различным аминокислотным фрагментам. Анализируя и обрабатывая данные кросс-пики с использованием методики, изложенной в работе [19], были получены приближенные межпротонные расстояния. Данные приведены в табл. 5. В качестве калибровочной интенсивности кросс-пиков был выбран кросс-пик в ароматическом кольце фенилаланина Phe19(2/6)-Phe19(3/5) на основании того, что протоны в нем принадлежат ароматическому кольцу и положение их остается неизменным при любых внешних условиях. Расстояние между этими протонами определяли различными методами и приняли равным 2.49 А.
С целью установления пространственного строения гептапептида A|316-22 в растворе Н2О + D2O в присутствии ДСН были проведены расчеты по методу молекулярной механики по программе DYNAMO [11]. Эти расчеты позволили однозначно определить некий конформер как наиболее выгодную структуру для гептапептида (рис. 12, б). В качестве исходных экспериментальных данных использовали межпротонные расстояния, полученные из анализа интенсивно-стей кросс-пиков ЯМР NOESY спектров гептапептида (табл. 5).
Рис. 12. Пространственное строение гептапептида Aß16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2): а) в растворе; б) в комплексе гептапептид - синтетическая модель поверхности мембраны клетки
Табл. 5
Экспериментально определенные межпротонные расстояния для гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе Н2О + D2O с додецилсульфатом натрия. Звездочкой обозначено калибровочное расстояние
Пара протонов Межпротонное расстояние r, Â, NOESY Межпротонное расстояние r, Â, DYNAMO
F19(2/6)/F19(3/5) 2.49* 2.49
E22(NH)/A21(NH) 3.08 ± 0.62 3.48
F19(2/6)/F19(NH) 3.48 ± 0.70 3.08
K16(NH)/K16(a) 3.43 ± 0.69 2.87
K16(NH)/E22(b) 2.93 ± 0.59 3.44
A21(NH)/A21(a) 2.97 ± 0.59 3.01
E22(NH)/E22(b) 4.54 ± 0.91 3.72
E22(a)/E22(b) 3.58 ± 0.72 2.97
A21(NH)/F20(a) 2.54 ± 0.51 3.31
F19(NH)/F19(a) 2.98 ± 0.60 2.73
F19(NH)/V18(a) 3.10 ± 0.62 2.95
F19(NH)/F19(b) 3.30 ± 0.66 3.43
F19(2/6)/F19(a) 3.35 ± 0.67 3.64
F20(NH)/F19(a) 3.27 ± 0.65 3.56
F19(b)/F19(2/6) 3.60 ± 0.72 3.62
V18(NH)/V18(b) 3.02 ± 0.60 3.45
V18(a)/V18(NH) 2.80 ± 0.56 2.83
F19(b)/F19(a) 2.85 ± 0.57 2.85
V18(NH)/V18(g) 3.95 ± 0.79 3.65
V18(a)/V18(b) 3.03 ± 0.61 2.52
V18(g)/V18(a) 4.98 ± 1.00 4.28
F20(NH)/F20(a) 2.45 ± 0.49 2.88
F20(2/6)/F20(a) 2.14 ± 0.43 2.48
F20(NH)/F20(b) 3.12 ± 0.62 2.91
F20(2/6)/F20(b) 2.88 ± 0.58 2.40
Рис. 13. Строение комплекса гептапептид МАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РИе-РИе-А1а-01и-КН2 - мицеллы на основе додецилсульфата натрия
Как следует из рассмотрения рис. 12, пространственное строение гептапеп-тида Ар16-22 различно в этих двух средах.
Координаты атомов в р^-формате пространственной структуры АР16-22 (КАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-КН2) в растворе и в комплексе с мицеллами додецилсульфата натрия в Н20 + Б20 можно получить у авторов работы.
Анализируя изменения ЯМР 'И химических сдвигов протонов гептапептида при переходе от раствора боратного буфера (Ка2Б407 10Н20 + Б20) к раствору Н2О + Б20 с додецилсульфатом натрия, находящемуся в мицеллярном состоянии (табл. 4), можно на качественном уровне описать пространственное строение самого комплекса гептапептид КАс-Ьу8-Ьеи-Уа1-РЬе-РЬе-А1а-01и-КН2 -мицеллы на основе додецилсульфата натрия, который представлен на рис. 13.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 09-03-00077а), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».
Summary
K.S. Usachev, A.R. Yulmetov, A.V. Filippov, O.N. Antsutkin, S. Afonin, A.V. Aganov, V.V. Klochkov. Spatial Structure of Heptapeptide Ap16-22 in a Solution and in the Complex between the Heptapeptide and a Model Biological Membrane.
The spatial structure of an active fragment of beta-amyloid Ap1-40 heptapeptide Ap16-22 (Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu) in a solution and the spatial structure of the complex between the heptapeptide and a model cell membrane surface (a micelle based on sodium dodecyl sulfate) were investigated and described by 1H NMR spectroscopy and two-dimensional NMR (TOCSY, HSQC-HECADE, NOESY) spectroscopy. The complexation was confirmed by the change in the chemical shifts in the heptapeptide's 1H NMR spectra as well as by the signs and values of the nuclear Overhauser effect (NOE) in various media. A comparison of the
heptapeptide's spatial structure in a borate buffer solution and its structure in the complex
between Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu and the model cell membrane surface was made.
Key words: structure, beta-amyloid, micelles, NMR 1H spectroscopy, two-dimensional
NMR (TOCSY, HSQC-HECADE, NOESY) spectroscopy.
Литература
1. Coles M., Bicknell W., Watson A., Fairlie D.P., Craik D.J. Solution Structure of Amyloid ß-Peptide (1-40) in a Water-Micelle Environment. Is the Membrane-Spanning Domain Where We Think It Is? // Biochemistry. - 1998. - V. 37, No 31. - P. 11064-11077.
2. Balbach J.J., Ishii Y., Antzutkin O.N., Leapman R.D., Rizzo N.W., Dyda F., Reed J., Tycko R. Amyloid fibril formation by Ab 16-22, a seven-residue fragment of the Alzheimer's b-amyloid peptide, and structural characterization by solid state NMR // Biochemistry. -2000. - V. 39. - P. 13748-13759.
3. Aisenbrey C., Borowik T., Byström R., Bokvist M., Lindström F., Misiak H., Sani M.A., Gröbner G. How is protein aggregation in amyloidogenic diseases modulated by biological membranes? // Eur. Biophys. J. - 2008. - V. 37, No 3. - P. 247-255.
4. Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // J. Am. Chem. Soc. - 1963. - V. 85, No 14. - P. 2149-2154.
5. Jones J. Amino Acid and Peptide Synthesis. - N. Y.: Oxford Univ. Press, 2002. - 96 p.
6. Filippov A. Synthesis and aggregation studies on amyloid oligomers of Alzheimer's Abeta peptides: Licentiate of Technology Thesis. - Lulea, Sweden: Lulea Univ. Tech-nol., 2010. - 26 p.
7. Breitmaier E., Woelter W. 13C NMR spectroscopy. Methods and application in organic chemistry. - Weinheim, N. Y.: Verlag Chemie, 1978. - 322 p.
8. Wuthrich K. NMR of proteins and nucleic acids. - N. Y.: Wiley-VCH, 1986. - 320 p.
9. Kozminski W., Nanz D. Sensitivity improvement and new acquisition scheme of hetero-nuclear active-coupling-pattern-tilting spectroscopy // J. Magn. Res. - 2000. - V. 142, No 2. - P. 294-299.
10. Ruckert M., Otting G. Alignment of biological macromolecules in novel nonionic liquid crystalline media for NMR experiments // J. Am. Chem. Soc. - 2000. - V. 122, No 32. -P. 7793-7797.
11. Delaglio F. NMRpipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes // J. Biomol. NMR. - 1995. - V. 6, No 3. - P. 277-293.
12. Henry G.D., Sykes B.D. Methods to study membrane protein structure in solution // Meth. Enzymol. - 1994. - V. 239. - P. 515-535.
13. Lee K.H., Fitton J.E., Wüthrich K. Nuclear magnetic resonance investigation of the conformation of 5-haemolysin bound to dodecylphosphocholine micelles // Biochim. Biophys. Acta. - 1987. - V. 911, No 2. - P. 144-153.
14. Braun W., Wider G., Lee K.H., Wüthrich K. Conformation of glucagon in a lipid-water interphase by 1H nuclear magnetic resonance // J. Mol. Biol. - 1983. - V. 169, No 4. -P. 921-948.
15. Motta A., Pastore A., Goud N.A., Castiglione Morelli M.A. Solution conformation of salmon calcitonin in sodium dodecyl sulfate micelles as determined by two-dimensional NMR and distance geometry calculations // Biochemistry. - 1991. - V. 30, No 43. -P. 10444-10450.
16. Wang G., Keifer P., Peterkofsky A. Solution structure of the N-terminal amphitropic domain of Escherichia coli glucose-specific enzyme IIA in membrane-mimetic micelles // Protein Sci. - 2003. - V. 12, No 5. - P. 1087-1096.
17. Ernst R.R., Bodenhausen B., Wokaun A. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. - Oxford: Oxford Univ. Press, 1987. - 610 p.
18. Berger S., Braun S. 200 and More NMR Experiments. - Weinheim: Wiley-VCH, 2004. -810 p.
19. Блохин Д.С., Ефимов С.В., Клочков А.В., Юльметов А.Р., Филиппов А.В., Клочков В.В. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в комплексе протеин - мицеллы додецилсульфата натрия // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2011. - Т. 153, кн. 1. - С. 59-70.
20. Bremer J., Mendz G.L., Moore W.J. Skewed exchange spectroscopy. Two-dimensional method for the measurement of cross relaxation in proton NMR spectroscopy // J. Am. Chem. Soc. - 1984. - V. 106. - P. 4691-4696.
Поступила в редакцию 17.07.11
Усачев Константин Сергеевич - аспирант кафедры общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Юльметов Айдар Рафаилович - кандидат физико-математических наук, ассистент кафедры общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Филиппов Андрей Васильевич - доктор физико-математических наук, профессор кафедры физики молекулярных систем Казанского (Приволжского) федерального университета.
Анцуткин Олег Николаевич - Ph.D. in Chemistry, профессор департамента прикладной химии и геологии Университета Лулео, Швеция
Афонин Сергей - Ph.D. in Chemistry, научный сотрудник Технологического института Карлсруэ, Германия.
Аганов Альберт Вартанович - доктор химических наук, профессор кафедры общей физики, директор Института физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Клочков Владимир Васильевич - доктор химических наук, профессор кафедры общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: vladimir.klochkov@ksu.ru
