CC BY
23
УДК 577.15.02
РОЛЬ ОСТАТКОВ ПРОЛИНА В СТАБИЛЬНОСТИ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ
А.Е. Серов, В.И. Тишков
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: vit@enz.chem.msu.ru)
Введение дополнительных остатков пролина методом направленного мутагенеза представляет собой один из распространенных методов повышения термостабильности белков. Изучено влияние подобных мутаций на стабильность NAD -зависимых формиатдегидрогеназ (ФДГ; КФ 1.2.1.2) из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 и пекарских дрожжей. В случае бактериальной ФДГ данный метод не может быть использован. Низкая стабильность ФДГ пекарских дрожжей, вероятно, связана с невысоким содержанием в ней остатков пролина. Однако замена G141P не привела к повышению термостабильности этого фермента. В отличие от ФДГ из бактерий стабилизация фермента пекарских дрожжей возможна за счет увеличения жесткости полипептидной цепи.
Жесткость полипептидной цепи является одним из важных факторов, определяющих термостабильность ферментов. По своим конформационным свойствам от других аминокислот наиболее сильно отличается Pro, поскольку его боковая цепь ковалентно связана с атомом азота предшествующей пептидной связи [1]. Пяти-членное пироллидиновое кольцо накладывает жесткие ограничения на вращение вокруг N-Ca-связей. В полипептидной цепи у Pro меньше степеней свободы и этот остаток характеризуется более низкими значениями конфигурационной энторопии, чем другие аминокислоты.
Благодаря своим структурным особенностям остаток Pro может стабилизировать белки, жестко фиксируя их нативную конформацию. По всей видимости, стабилизирующий эффект обусловлен падением конфигурационной энтропии процесса денатурации [2]. Сравнение олиго-1,6-глюкозидаз [3], алкогольдегидрогеназ [4], 3-изопропилмалатдегидрогеназ, пуллюлоназ и неопул-люлоназ [5] из мезофильных и термофильных источников показало, что белки из термофилов содержат больше Pro в неструктурированных участках, ß-изгибах и а-спиралях по сравнению со своими аналогами из мезо-филов. Остатки Pro существенно влияют на термостабильность алкогольдегидрогеназы [6] и триозофофатизо-меразы [7] из Bacillus stearothermophilus, ß-лактамазы TEM-1 [8], дрожжевой фософглицераткиназы [9], адени-латкиназы [10] и субтилизина Е [11].
В связи с биотехнологической ценностью NAD-за-висимых формиатдегидрогеназ (ФДГ; КФ 1.2.1.2) большое значение имеет термостабильность ферментов этой группы [12]. Из изученных на сегодняшний день ФДГ наиболее стабильным является фермент из метилотроф-ных бактерий Pseudomonas sp.101 ^еФДГ) [13], а наименее стабильным - фермент из пекарских дрожжей
(БееФДГ) (неопубликованные данные). Термостабильность ФДГ коррелирует с содержанием в ней остатков Pro. В Р8еФДГ находится 24 Pro, в ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida boidinii и Candida methylica, обладающих промежуточной термостабильностью [14, 15], -14, а в БееФДГ - всего 12 Pro. В данной работе на примере Р8еФДГ и БееФДГ изучена возможность стабилизации формиатдегидрогеназ при введении в них дополнительных остатков Pro. Соответствующие гены ранее были нами клонированы и экспрессированы в клетках E. coli, что позволило проводить эксперименты по белковой инжененерии данных ферментов.
Методы исследования
В работе использовали ДНК-полимеразу, ДНК-ли-газу, полинуклеотидкиназу фага Т4 и эндонуклеазы рестрикции фирмы "New England Biolabs " и Pwo ДНК-полимеразу фирмы "Boehringer Mannheim". Все реактивы, использованные для генно-инженерных манипуляций, были марки "Molecular Biology Grade" (Sigma). В кинетических экспериментах использовали NAD+ (99% чистоты, Sigma) и формиат натрия ("ч.д.а.", Реахим).
Направленный мутагенез ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 осуществляли по модифицированному методу Кункеля, как описано ранее [13]. В ФДГ пекарских дрожжей аминокислотную замену вводили с помощью двухстадийной полимеразной цепной реакции, как описано в [16], используя Pwo ДНК-полимеразу. Мутанты ФДГ и рекомбинантные ферменты дикого типа, экспрес-сированные в клетках E. coli, выделяли и очищали по стандартной методике, разработанной для бактериальной ФДГ [17]. Полученные препараты фермента были не менее 90-95% чистоты согласно данным аналитического
электрофореза в 12%-м полиакриламидном геле в присутствии додецильсульфата натрия.
Активность фор миатдегидр огеназы определяли спектрофотометрически по накоплению NADH при длине волны 340 нм (е340 = 6 2 2 0 М см ) на спектро-фотометре Schimadzu UV 1601 PC при 25° в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Концентрация NAD+ и формиата натрия в кювете составляла 1,5 мМ и 0,3 М соответственно.
Термо стабильность мутантов ФДГ и рекомбинант-ных ферментов дикого типа измеряли в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Для каждой формы ФДГ готовили серию образцов: по 100 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл) в каждой из 20 пластиковых пробирок объемом 1,5 мл. Пробирки помещали в предварительно прогретый до необходимой температуры водный термостат (точность термостатирования ±0,1°). В моменты отбора проб пробирки с ферментными препаратами переносили в лед на 5 мин. Константу скорости термоинактивации бактериальной ФДГ и ее мутанта (k ) определяли из зависимости остаточной активности А/А0 от времени в координатах ln (А/А0) - t (мин) с помощью метода линейной регрессии в программе Sigma plot 2000.
Анализ трехмерной структуры нативной ФДГ из Pseudomonas sp. 101 проводили с помощью программы RasMol 2.7.
Результаты экспериментов
В литературе существует ряд примеров увеличения термостабильности белков методом направленного мутагенеза при заменах остальных 19 аминокислот на остатки Pro. Введение Pro привело к стабилизации лизо-цима фага Т4 [18, 19], лизоцима человека [20], лизоци-ма цыпленка [21], протеазы из Bacillus sp. [22], рибо-нуклеазы HI bp E. coli [23, 24], легкой цепи иммуноглобулина мыши [25] и термолизин-подобной протеазы из Bacillus stearothermophilus [26].
В олиго-1,6-глюкозидазу из Bacillus cereus [3, 5] последовательно вводили девять мутаций: X ^ Pro: по три замены в ß-изгибах, на N-концах а-спиралей и в неструктурированных участках. Термостабильность мутантов аддитивно возрастала с увеличением количества Pro. Полученные результаты позволили авторам сформулировать так называемое "пролиновое правило" для стабилизации белков. Данное правило включает в себя два основных положения. Во-первых, важные для термостабильности остатки Pro, как правило, расположены в (+1)-м положении ß-изгибов и первом положении а-спиралей. Во-вторых, стабилизирующие эффекты этих Pro независимы и аддитивны.
ФДГ из Pseudomonas sp. 101 ^еФДГ) превосходит по термостабильности все свои изученные аналоги из бактерий и дрожжей [13] . Широко распространенный метод стабилизации, основанный на сравнении аминокислотных последовательностей данного фермента и его аналогов из термофилов, в данном случае не подходит. Для повышения термостабильности PseФДГ необходимо опираться исключительно на общие подходы к стабилизации белков, которые только начинают формироваться благодаря накопленным в последние 15-20 лет экспериментальным данным. Данные РСА [27] позволяют проводить моделирование и анализ аминокислотных замен в белковой глобуле PseФДГ. Ранее этот фермент уже успешно стабилизировали методом гидрофобизации а-спиралей [13]. Предложенное в [3] "пролиновое правило" может рассматриваться как еще один подход к повышению устойчивости PseФДГ к тепловой денатурации.
Каждая субъединица димерной молекулы фермента содержит 17 ß-изгибов. В (+1)-м положении большинства из них расположен либо Pro, либо другой, но консервативный аминокислотный остаток. Однако в изгибе, сформированном 111-114 остатками, вторую позицию занимает неконсервативный Lys. В некоторых бактериальных ФДГ этот Lys заменен на остаток Pro (рис. 1, а). Величина двугранных углов ф и у остатка Lys-112
аЗ
ßv
<-
<-
->
РэеФДГ 104TPERIAKAKNLKLALTA
МогФДГ TAERIAKAPKLKLALTA
БаиФДГ TRERIEKAPNLKLAITA
РагФДГ TAERIAKAPKLKLALTA
НурФДГ TAERIAKAPKLKMIVTA
а5
<-
->
120 РэеФДГ 165YLPSHEWARKG175
МогФДГ YIPSHDWARNG
БсеФДГ 139YNGGHQQAING149
СтеФДГ FVPAHEQIINH
СЬоФДГ FVPAHEQIINH
а о
Рис. 1. а - Аминокислотные последовательности бактериальных ФДГ в районах а-спирали 3 и ß-цепи 7. PseФДГ - Pseudomonas sp.101 [SWISS-PROT:FDH_PSESR], МогФДГ - Moraxella C-1 [EMBL Accession Y13245], SauФДГ - Staphylococcus aureus [Gene Bank Accession AP003358], РагФДГ -Paracoccus sp. 12-A [Gene Bank Accession AB071373], НурФДГ - Hyphomicrobium sp.JC17 [Gene Bank Accession AB051073]. 0 - аминокислотные последовательности ФДГ из бактерий и дрожжей в районе а-спирали 5. SceФДГ - пекарские дрожжи [EMBL Accession Z75296], CmeФДГ -C. methylica [EMBL Accession X81129], ^ФДГ - C. boidinii [EMBL Accession AJ245934]. Структурные элементы относятся к PseФДГ
Lys-112
Lys-112
Рис. 2. Апо-форма РвеФДГ (а ); структура апо-фор-мы РвеФДГ в районе остатка Lys-112 (б). Пунктиром обозначена водородная связь между аминогруппой Lys-112 и карбонильным кислородом основной цепи остатка Ala-109
составляет -62° и -30° соответственно. Эти значения характерны для Pro [1]. Остаток Lys-112 расположен на поверхности белковой глобулы (рис. 2, а). На расстоянии 5,3 А от аминогруппы Lys-112 находится положительно заряженная гуанидиновая группа Arg-135 (рис. 2, б). Взаимное отталкивание двух одинаковых зарядов может отрицательно влиять на термостабильность белка. Боковая цепь Lys-112 образует водородную связь с карбонильным кислородом Ala-109. Соответствующее расстояние между атомами азота и кислорода составляет 3,1 А. Таким образом, замена K112P будет оказывать как стабилизирующее, так и дестабилизирующее действие на PseФДГ. Суммарный эффект можно определить только экспериментальным путем.
Кристаллическая структура ФДГ пекарских дрожжей (БсеФДГ) неизвестна. Отсутствие структурных данных затрудняет применение для стабилизации этого фермента общих теоретических подходов, поскольку все они основаны на анализе структуры белка. Однако БсеФДГ можно стабилизировать, сравнивая ее аминокислотную последовательность с более термостабильными аналогами. Такое сравнение показало, что полипептидная цепь
БсеФДГ обладает повышенной гибкостью. Несколько консервативных остатков Pro в белке пекарских дрожжей заменены на другие аминокислоты. Например, в 141-м положении аминокислотной последовательности БсеФДГ расположен Gly. В большинстве остальных формиатдегидрогеназ эта позиция занята остатком Pro (рис. 1, б). В частности Pro содержат более термостабильные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 и Moraxella C-l, а также дрожжей C. boidinii и C. methylica.
Для выяснения влияния остатков в 112-м и 141-м положениях последовательностей PseФДГ и БсеФДГ на термостабильность этих ферментов были получены точечные мутанты PseФДГ K112P и БсеФДГ G141P и изучены их свойства. Результаты экспериментов представлены на рис. 3. Инактивацию бактериальной ФДГ и ее мутанта изучали при 63°. Процесс термоденатурации PseФДГ описывается кинетикой необратимой реакции первого порядка [13]. Для сравнения термостабильности PseФДГ дикого типа и мутанта K112P использовали отношение соответствующих констант инактивации (¿ин). Оказалось, что введенная мутация привела к дестабилизации бактериальной ФДГ (рис. 3, а). Константа инактивации мутанта ((13±3)х10 4 с в 1,6 раза выше константы инактивации немутантной PseФДГ ((8±2)х10- с- ). ФДГ пекарских дрожжей имеет более сложный двухстадийный механизм инактивации, первая стадия которого обратима (неопубликованные данные). В связи с этим устойчивость SceФДГ дикого типа и мутанта G141P к тепловой денатурации сравнивали по периодам полуинактивации (t1/2) при 42,5°. При данной температуре за время проведения эксперимента фиксируются как первая, так вторая стадии процесса. Мутация G141P не вызвала изменения термостабильности SceФДГ (рис. 3, б). Период полуинактивации при 42,5° для обеих форм дрожжевого фермента составил 2,5 мин.
Обсуждение результатов
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что "пролиновое правило" не может быть использовано для стабилизации PseФДГ. В большинстве своих ß-из-гибов и начальных участков а-спиралей PseФДГ уже содержит остатки Pro или непролиновые консервативные аминокислоты, замена которых, скорее всего, резко ухудшит кинетические свойства фермента. В случае Lys-112 водородная связь боковой группы данного остатка с основной цепью Ala-109, очевидно, более важна для термостабильности белка, чем конформационная устойчивость ß-изгиба 111-114. Следует отметить, что в литературе уже встречались работы, которые не согласуются с "пролиновым правилом". На основе анализа первичных структур алкогольдегидрогеназ из мезофи-лов Clostridium beijerinckii и гипертермофилов Thermoanaerobacter brockii в мезофильный фермент ввели восемь дополнительных Pro [4]. Наилучшие резуль-
1
0.5
0.1 0.05
0.01 0.005
а
^v 1
1.0
3
J
¡3
О X
со
S
Ё
с§ 0.4
0.2
0.0
б
^v 1
10 20 30 40 50 60 70 Время, мин
10
Время, мин
15
20
Рис. 3. а - Зависимость остаточной активности РйеФДГ дикого типа (7) и мутанта К112Р (2) от времени в координатах 1п(А/А0)-б — зависимость остаточной активности ЗееФДГ дикого типа (7) и мутанта 0141Р (2) от времени в координатах А/А0 - ? (0,1 М калий фосфатный буфер, рН 7,0; температура 63° (а) и 42,5° (б)
таты дали замены в Р-изгибе и неструктурированном участке, а мутации в первых положениях а-спиралей привели к дестабилизации белка. Кроме того, не наблюдалось аддитивности вкладов точечных мутаций в суммарный стабилизирующий эффект.
Задача дальнейшей стабилизации бактериальной ФДГ требует поиска других подходов. Это может быть вытеснение молекул воды из гидрофобных полостей внутри белковой глобулы, создание дополнительных ионных пар и водородных связей. Возможно применение метода, противоположного в своей основе "проли-новому правилу", - снятие конформационных напряжений в белковой глобуле при увеличении гибкости полипептидной цепи. Предварительный анализ структуры выявил в Р8еФДГ несколько аминокислотных остатков в неоптимальной конформации. Замена этих остатков на 01у позволит снять конформационное напряжение в молекуле белка, так как в полипептидах 01у обладает гораздо большим набором разрешенных конформаций по сравнению с остальными аминокислотами. Замена 0141Р также не привела к повышению
термостабильности БсеФДГ. Соответствующий Gly-141 остаток Pro занимает третье положение в а-спирали 5 структуры Р8еФДГ. Как уже было упомянуто выше, в начале спиральных участков Pro оказывает стабилизирующее действие на белки. Напротив, в середине а-спиралей этот остаток практически не встречается, поскольку у него отсутствует атом водорода, необходимый для формирования внутриспиральной водородной связи [1]. По всей видимости, в третьем положении спирали Pro не влияет существенно на термостабильность. Спираль сама по себе является достаточно стабильным элементом вторичной структуры и не нуждается в дополнительном увеличении жесткости. Тем не менее в случае ФДГ пекарских дрожжей остаются перспективы стабилизации этого фермента за счет введения дополнительных остатков Pro. Интересными кандидатами для замены представляются остатки Lys-299 и Val-323. БсеФДГ - это единственная ФДГ, содержащая в данных положениях непролиновые аминокислоты. Согласно кристаллической структуре бактериального фермента, эти остатки находятся в неструктурированных участках.
0
0
5
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. MacArthur M.W., Thornton J.M. // J. Mol. Biol. 1991. 218.
Р. 397.
2. Watanabe K., Chishiro K., Kitamura K., Suzuki Y. // J. Biol. Chem.
1991. 266. Р. 24287.
3. Watanabe K., Masuda T., Ohashi H., Mihara H., Suzuki Y. // J.
Biochem. 1991. 226. Р. 277.
4. Bogin O., PeretzM., Hacham Y. // Protein Sci. 1998. 7. Р. 1156.
5. Suzuki Y., Watanabe K. // J. Molec. Catal. B: Enzymatic 4. 1998.
Р. 167.
6. Cannio R., RossiM., Bartolucci S. // J. Biochem. 1994. 222. Р. 345.
7. Delboni L.F., Mande S.C., Rentier-Delrue F. // Protein Sci. 1994. 4.
Р. 2594.
8. Huang W., Petrosino J., HirschM. // J. Mol. Biol. 1996. 258. P. 688.
9. McHarg J, Kelly S.M., Price N.C. // J. Biochem. 1999. 259. P. 939.
10. Tagaya M., Yagami T., Noumi T. // J. Biol. Chem. 1989. 264. P. 990.
11. Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H. // J. Biochem. 1989. 105. P. 953.
12. Tishkov V.I., Galkin A.G., Fedorchuk V.V., Savitsky P.A. // Biotechnol. Bioeng. 1998. 64. P. 187.
13. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E. // FEBS Lett. 1999. 445. P. 183.
14. SlusarczykH., Felber S., KulaM.R., PohlM. // J. Biochem. 2000. 267. P. 1280.
15. Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. // Biochemistry-Moscow. 1989. 54. P. 231.
16. Ho S.N., HuntH.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. // Gene.
1989. 77. P. 51.
17. Tishkov V.I., Matorin A.D., Rojkova A.M. // FEBS Lett. 1996. 390. P. 104.
18. Matthews B.W., Nicholson H., Becktel W.J. // Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 1987. 84. P. 6663.
19. Matthews B.W. // Annu. Rev. Biochem. 1993. 62. P. 139.
20. Herning T., Yutani K., Inaka K., Kuroki R. // Biochemistry. 1992. 31. P. 7077.
21. Ueda T., Tamura T., Maeda Y., Hashimoto Y., Miki T., Yamada H. // Protein Eng. 1993. 6. P. 183.
22. Masui A., Fujiwara N., Imanaka T. // Appl. Environ. Microbiol.
1994. 60. Р. 3579.
23. Ishikawa K., Kimura S., Kanaya S., Morikawa K. // Protein Eng. 1993. 6. Р. 85.
24. Kimura S., Nakamura H., Hashimoto T., Oobatake M. // J. Biol. Chem. 1992. 267. Р. 21535.
25. Ohage E.C., Graml W., WalterM.M., Steinbacher S. // Protein Sci.
1997. 6. Р. 233.
26. Veltman O.R., Vriend G, Middelhoven P.J. // Protein Eng. 1996. 9. Р. 1181.
27. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H. // J. Mol. Biol. 1994. 236. Р. 759.
Поступила в редакцию 25.10.02
