CC BY
82
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.2
Пространственная структура и динамика трансмембранного домена белка-предшественника в-амилоида
К. Д. Надеждин, О. В. Бочарова, Э. В. Бочаров*, А. С. Арсеньев
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 *E-mail: bon@nmr.ru Поступила в редакцию 28.10.2010 г.
РЕФЕРАТ Для адекватной терапии болезни Альцгеймера, которая поражает людей во всем мире независимо от национальности и социально-экономического статуса, необходимо понимать молекулярные основы патогенеза этого заболевания. Амилоидный Р-пептид, формирующий амилоидные бляшки в головном мозге при болезни Альцгеймера, образуется в результате последовательного расщепления мембранного белка-предшественника Р-амилоида (amyloid precursor protein - APP). Более половины мутаций APP, обнаруженных при семейных формах болезни Альцгеймера, локализованы в его трансмембранном домене. Патогенные мутации, как предполагают, влияют на структурно-динамические свойства трансмембранного домена APP, изменяя его конформационную стабильность и/или латеральную димеризацию. В настоящей работе методами ЯМР-спектроскопии в среде, имитирующей мембранное окружение, - детергентных мицеллах, определены пространственная структура и динамика рекомбинантного пептида, соответствующего фрагменту APP Gln686-Lys726, который включает трансмембранный домен APP с прилегающим N-концевым примембранным участком. Структура, полученная в мицеллах додецилфосфохолина, представляет собой две а-спирали: короткая амфифильная примембранная Lys687-Asp694 и длинная трансмембранная Gly700-Leu723, соединенные подвижным петлевым участком. В районе спаренных остатков Gly708-Gly709 наблюдается небольшое искривление трансмембранной а-спирали. Под петлевым участком в области контакта примембранной а-спирали с поверхностью мембраны рядом с N-концом трансмембранной а-спирали, по-видимому, образуется гидрофобная полость, предназначенная для взаимодействия APP с холестерином. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА болезнь Альцгеймера, белок-предшественник Р-амилоида, трансмембранный домен, ЯМР-спектроскопия, пространственная структура, динамика.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ APP - белок-предшественник Р-амилоида (amyloid precursor protein); AP - амилоидный Р-пептид; ТМ - трансмембранный (transmembrane); JM - примембранный (juxtamembrane), APPjmtm -фрагмент APP686 726; ДФХ - додецилфосфохолин; ДСК - доксилстеариновая кислота; ЯЭО (NOE) - ядерный эффект Оверхаузера (nuclear Overhauser effect); NOESY - ЯМР-спектроскопия ЯЭО; HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция.
ВВЕДЕНИЕ
Более века назад немецкий врач А. Альцгеймер описал дегенеративное заболевание головного мозга, проявляющееся в избирательной дегенерации нейронов в участках коры головного мозга, ответственных за когнитивное восприятие и память [1]. Возможно как наследование заболевания, так и его спорадическое развитие, причем в раннем возрасте обычно проявляются наследственные, так называемые семейные формы болезни Альцгеймера. Несмотря на определенный прогресс в изучении молекулярных основ патогенеза болезни Альцгеймера [2], современная терапия может лишь замедлить прогрессирование заболевания, но не излечить от него.
По мере развития болезни в местах контакта нейронов вне нервных клеток накапливается амилоидный в-пептид (Ae), который собирается в упорядоченные тяжи, фибриллы, образующие так называемые амилоидные бляшки [1]. Присутствие гидрофобных белковых агрегатов приводит к нарушению передачи нервного импульса [1, 3, 4]. Aв образуется в результате последовательного расщепления мембранного гликопротеина, предшественника в-амилоида (amyloid precursor protein - APP) в- и у-секретазами [1, 5]. Недавно показано, что Aв обладает мощной антимикробной активностью и, возможно, входит в систему врожденного иммунитета в нервной системе человека [6]. В организме Aв вырабатывается в небольших
количествах и имеет длину от 38 до 43 а.о., при этом наиболее распространенные изоформы состоят из 40 и 42 а.о. [1, 3, 4]. Низкое в норме количественное соотношение пептидов Aв1-42/Aв1-40 (около 1/9) сильно возрастает при болезни Альцгеймера, что приводит к появлению амилоидных бляшек, в основе образования которых лежит структурное изменение Aв [1, 3, 4]. В то же время ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что олигомерные формы AP (в том числе внутриклеточные) могут оказывать ней-ротоксичный эффект еще до формирования фибрилл и бляшек [1, 3, 4].
APP димеризуется в плазматической мембране и имеет многодоменную структуру интегрального битопного белка [7]. При семейных формах болезни Альцгеймера более половины всех мутаций в APP приходится на его трансмембранный (ТМ) домен и примембранные участки [В, 9]. На сегодняшний день выдвинута гипотеза о том, что эти патогенные мутации влияют на латеральную димеризацию APP в мембране, изменяя конформацию димера и/или его стабильность, что рассматривается как вероятная причина альтернативного расщепления APP Y-секретазой в мембране и преобладания патогенного Aв1-42 над Aв1-40 [9-11]. Вместе с тем показано, что ТМ-домен APP и его примембранные участки специфически взаимодействуют с мембранным окружением, в частности с холестерином, а также с катионами металлов Cu2+ и Zn2+, что может влиять на структурно-динамические свойства и димери-зацию APP [12-15]. Таким образом, для понимания молекулярных механизмов патогенеза болезни Альцгеймера необходимо установить пространственную организацию не только пептидов Aв и их агрегатов, но и самого белка APP, и его ТМ-домена в частности. Тем не менее, несмотря на определенные успехи в структурно-динамических исследованиях амилоидных пептидов Aв, на сегодняшний день существуют только теоретические пространственные модели ТМ-домена APP и его мутантных патогенных форм. В настоящей работе методами гетероядерной ЯМP-спектроскопии в мембраноподобной среде установлена пространственная структура и описана динамика ТМ-домена APP с примембранным (juxtamembrane -JM) участком, встроенного в виде мономера в детер-гентные мицеллы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАя ЧАСТЬ
Пр иготовление ЯМР-образцов ТМ-домена APP в мембраноподобной среде
Необходимые для ЯМP-исследований количества изотопно-меченного по ядрам 15N и 1ЗС образца рекомбинантного пептида APPjmtm, соответствующего
фрагменту APP Gln686-Lys726 с дополнительными N-концевыми остатками Gly-Ser, оставшимися после расщепления гибридного белка тромбином, получены по методике, описанной в [16]. Чистоту препаратов контролировали с помощью спектров :H/15N-HSQC изотопно-меченных APPjmtm, растворенных в 500 мкл смеси хлороформ-метанол-вода 5 : 5 : 1 с концентрацией пептида 0.3 мМ. На основе скрининга состава мембраномоделирующей среды для последующих структурных ЯМР-исследований APPjmtm были выбраны детергентные мицеллы из додецил-фосфохолина (ДФХ) [16]. Сухие препараты APPjmtm и ДФХ растворяли в смеси трифторэтанол-вода 1 : 1, озвучивали в течение нескольких минут в ультразвуковой бане, лиофилизировали и растворяли в 20 мМ ацетатном буфере (pH 5.0, 5% D2O). Для предотвращения заражения бактериями в образцы добавляли 0.05 мМ NaN3, а для ингибирования фосфолипаз - 1 мМ EDTA. Для большей однородности размера мицелл проводили несколько циклов замораживания и нагревания до 40-45°С с последующим озвучиванием в ультразвуковой бане для достижения полной прозрачности раствора. Все образцы готовили из расчета 0.3-1 мМ APPjmtm в 400 мкл раствора мицелл с молярным соотношением пептид-детергент 1 : 70, что обеспечивает содержание примерно одного пептида на мицеллу, при этом концентрация ДФХ была в несколько раз выше критической концентрации ми-целлообразования (~1 мМ). Приготовленные образцы помещали в ЯМР-ампулы Shigemi со стеклянным плунжером, качество образцов оценивали при помощи двухмерных ЯМР-спектров :H/15N-HSQC. Варьирование рН и температуры показало, что лучшие с точки зрения разрешения сигналов ЯМР-спектры APPjmtm, солюбилизированного в мицеллах ДФХ, получаются при рН 4.3-5.3 и температуре 40-50°С.
ЯМР-спектроскопия ТМ-домена APP в мембраноподобной среде
ЯМР-спектры APPjmtm, солюбилизированного в мицеллах ДФХ при pH 4.6 и 45°С, получены на снабженных криодатчиками спектрометрах AVANCE III (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Германия) с рабочими частотами на протонах 600 и 800 МГц. Спектры обрабатывали в программе TOPSPIN 3.0 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Германия). ЯМР-спектры анализировали с использованием программы CARA [17]. Для отнесения :H-, 13C- и ^N-резонансов пептида и получения структурной информации (отнесение и интегрирование кросс-пиков ЯЭО) использовали набор из двух-и трехмерных спектров: :H/15N-HSQC, :H/13C-HSQC; 1H/13C/15N-HNCA, 1H/13C/15N-HN(CO)CA, 1H/15N-HNHA, 1H/13C/15N-HNCO, 1H/15N-NOESY-HSQC, 1H/13C-TOCSY-HSQC, 1H/13C-NOESY-HSQC [18]. Ин-
формация о внутримолекулярной динамике пептида получена на основе анализа 15П-релаксационных данных. Для этого значения гетероядерного 15N{1H} ЯЭО, времена продольной (Т1) и поперечной (Т2) релаксации, а также время вращательной корреляции (tr) для 15П-меченного образца APPjmtm измеряли по методике, описанной в [19]. Значения времен обмена амидных протонов основной цепи пептида на дейтерий растворителя оценивали по изменению интенсивностей сигналов в наборе спектров 1H/15N-HSQC, последовательно накопленных через 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 и 24 ч для растворенного в D2O предварительно лиофилизированного образца APPjmtm, встроенного в мицеллы. Степень пространственной удаленности аминокислотного остатка от поверхности и центра мицеллы определяли из уширения сигналов от амидных групп APPjmtm в спектрах 1H/15N-HSQC при последовательном добавлении парамагнитных спиновых меток 5- и 16-доксилстеариновых кислот (5- и 16-ДСК) соответственно, в соотношении 0.5, 1 и 2 метки на одну мицеллу ДФХ. Остатки APPjmtm, участвующие в связывании холестерина, идентифицировали, анализируя изменения обобщенных химических сдвигов A6[hn] (вычисляемых как квадратный корень суммы квадратов изменений химических сдвигов сигналов 1Н (Аб1н) и 15N (Аб^/5) [13]) кросс-пиков амидных групп в спектрах 1H/15N-HSQC, вызванных добавлением холестерилгемисукцината (аналог холестерина) из расчета одна молекула ге-мисукцината на одну мицеллу ДФХ.
Расчет пространственной структуры ТМ-домена APP
Пространственная структура APPjmtm получена по стандартной методике [18]. Расчет пространственной структуры по данным спектроскопии ЯМР осуществлен в программе CYANA 2.1 [20] с использованием метода молекулярной динамики в пространстве торсионных углов и алгоритма “моделируемого отжига” (simulated annealing). Ограничения на меж-протонные расстояния, используемые при расчете структуры, получены из объемов кросс-пиков ЯЭО в спектрах 1H/15N-NOESY-HSQC и 1H/13C-NOESY-HSQC, накопленных со временем смешивания tm = 80 мс. Ограничения на двугранные углы получены из значений 1Н, 15N и 13C химических сдвигов NH-, CaH- и CO-групп APPjmtm в программе TALOS [21]. Ограничения на водородные связи добавлены после предварительного расчета структуры из анализа пространственной близости амидных протонов и атомов кислорода основной цепи APPjmtm согласно критерию для углов 140° < NHO < 180° и 130° < COH < 170° и для расстояний 1.9 А < d(O, HN) < 2.3 А, 3.0 А < d(O, N) < 3.4 А, 3.2 А < d(C, HN) < 3.6 А [22]. В результате
15N
м.д.
-110
-115
-120
Рис. 1. Гетероядерный ЯМР-спектр 1Н/15Ы-^ОС рекомбинантного тотально 13С/15Ы-меченного пептида APPjmtmf солюбилизированного в водной суспензии мицелл ДФХ с молярным отношением пептид-детергент 1 : 70, рН 4.6, 45°С. Приведено отнесение сигналов от 15ЫН-групп APPjmtm.
на основе верхних ограничений на межпротонные расстояния, на двугранные углы ф, ф и х1, на водородные связи с учетом стереоспецифического отнесения групп пептида рассчитан набор из 100 структур APPjmtm, из которых в качестве репрезентативных выбраны 20 структур с наименьшей штрафной функцией. Анализ и визуализация рассчитанных структур APPjmtm были проведены с помощью программ СУАПА и MOLMOL [23].
результаты и обсуждение
Рекомбинантный пептид APPjmtm, содержащий ТМ-домен APP с прилегающим П-концевым примем-бранным участком, изучали методами гетероядер-ной ЯМР-спектроскопии в мембраноподобной среде в виде водной суспензии мицелл ДФХ с молярным соотношением пептид-детергент 1 : 70 (соответствующим примерно одному пептиду на мицеллу) при pH 4.6 и 45°С. Интересно, что APP расщепляется в клеточных эндосомах со значением рН около 5 [13]. Образцы APPjmtm в мицеллах ДФХ были стабильными при 45°С в течение месяца, что приемлемо для структурных ЯМР-исследований. В спектре 1H/15N-HSQС (рис. 1) общее количество кросс-пиков от амидных групп совпадало с ожидаемым, исходя из первичной структуры APPjmtm. Это указывает на отсутствие медленного в шкале ЯМР конфор-
Рис. 2. Структурно-динамические данные ЯМР для APPjmtm. а - Межпротонные контакты ЯЭО, наблюдаемые между остатками APPjmtm в спектрах 1H/15N-NOESY-HSQC и 1H/13C-NOESY-HSQCf накопленных со временем смешивания tm = 80 мс. б - Доступность амидных групп APPjmtm водному окружению мицеллы. Сверху представлены данные о временах полуобмена, ^ , амидных протонов остатков APPjmtm на дейтерий растворителя. Закрашенными кругами показаны остатки с ^ > 2 ч, пустыми - с 1
< t1/2 < 2 ч; для остальных остатков t1/2 < 1 ч. Снизу квадратами обозначены остатки APPjmtmf сигналы амидных протонов которых претерпевают изменения химического сдвига более 3 х 10-3 м.д. при изменении температуры на 1°С, что указывает на доступность данных протонов растворителю. в - Приведено отличие значений химических сдвигов сигналов ядер 13Са и 1Н APPjmtm от табличного значения в конформации «неупорядоченный клубок», так называемый вторичный химический сдвиг. Значение Д613(Са (показано сверху) зависит от типа вторичной структуры полипептидной цепи: положительное для спиральных участков, отрицательное для развернутой (в том числе в-структуры) конформации [18]. Значение Дб^ (показаны снизу) помимо прочего сильно зависит от длины водородной связи, в которой участвует амидный протон, при этом локальное увеличение значения Дбнм указывает на укорочение данной водородной связи [24]. г - Для амидных групп APPjmtm приведены ^-релаксационные параметры: сверху, значения гетероядерного 15^^} ЯЭО; снизу, значения эффективного времени корреляции броуновского вращения тк, рассчитанного из отношения ^ Т /Т , д - Уширение сигналов амидных групп APPjmtm в спектрах 1H/15N-HSQC после добавления 5- и 16-ДСК (в соотношении одна спиновая метка на мицеллу), имеющих тенденцию преимущественно распределяться вблизи поверхности и центра мицеллы соответственно. е - Изменение обобщенного химического сдвига Дб кросс-пиков от амидных групп APPjmtm в спектрах 1H/15N-HSQC при добавлении одной молекулы холестерилгемисук-цината на мицеллу ДФХ. ж - Распределение значений углов ф, ф и х1 основной и боковой цепей остатков по репрезентативному набору из 20 ЯМР-структур APPjmtm. Под аминокислотной последовательностью APPjmtm стрелками указаны места расщепления APP а- и у-секретазами, а также аминокислотные мутации, обнаруженные при наследственных формах болезни Альцгеймера [8, 10].
APPjmtm 690 700 710 720
а GSQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKK
dj'', i+1) daN(i"' /+1)^ d|3N(i' i+1) "
^ '+3) daP(/' '+3) daN(i"' /+4)
б H-D
т Г ■
AKa 2 м.д. 0
A6HN
м.д.
-2 0.4 0.2 -
0
-0.2
-0.4
II
0.8
0.4
15N{1H} ЯЭО °-0.4 -10 -
Tr нс
д
5-ДСК
/Д 0
16-ДСК
///0 0.5
е
ж
Д5 0.'
[HN]
м.д.
0.05
Холест.
0
180 ф 0180-ф ° 180-
X
1 0-
lllL
■OOOOI
||| -I-
||
►•о
III
llllllllllll
1
III "I "Т14*
1 Ilm.ll (.ill ..НИ
[| huiilll IiIIii lull
. 1 ll .ll. l.ill ill. liil-.llluLlll
mstr
У"’™’’!!
jjifl______________________Щ
ТТРзз
~~1 Г-!.
ИЙЕ cdrG^TpP11 Ll
ГГШ ITU-Tprwn____ГГЬ;
тг
п №
ш
-CL
Н Ijm
GSQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKK
1 Ш ШШ^7 I
Ogz
о«>о
■S * S
и £
со m-
<U
%
1л с о с У
з «игл О ^
6
в
4
г
690
700
710
720
мационного обмена и содержание белковых примесей не более 5%. Для последовательного отнесения :Н-, 13С- и 15П-резонансов APPjmtm и получения структурно-динамической информации был накоплен стандартный набор из двух- и трехмерных ге-тероядерных ЯМР-спектров (см. раздел «Экспериментальная часть»).
Из анализа совокупности полученных ЯМР-данных следует, что пептид APPjmtm содержит два структурированных спиральных участка. Здесь наблюдаются характерные для спиралей ^, i+3-контакты ЯЭО (рис. 2а) и положительные вторичные химические сдвиги сигналов 13Са (рис. 2в), а также небольшие значения температурных коэффициентов химических сдвигов сигналов :НП (рис. 2б). В спектрах 1H/15N-NOESY-HSQС и 1H/13С-NOESY-HSQС кросс-пики ЯЭО между протонами аминокислотных остатков двух спиральных участков не обнаружены, что, по-видимому, свидетельствует об отсутствии межспиральных взаимодействий. В результате расчета пространственной структуры на основе экспериментальных данных, приведенных в таблице, установлено, что APPjmtm в мицеллах ДФХ состоит из двух а-спиралей - Lys687-Asp694 и Gly700-Leu723 (рис. 3), соединенных неструктурированным петлевым участком Val695-Lys699. Относительная ориентация двух спиралей в полученном наборе структур APPjmtm не определена (рис. 3а). В то же время структура каждой а-спирали рассчитана с высокой точностью (таблица, рис. 2ж, 3а,б). Отметим также, что конформация основной цепи и боковых цепей точнее установлена для а-спирали Gly700-Leu723.
Для определения топологии а-спиралей APPjmtm в мицелле ДФХ проанализировано уширение сигналов протонов амидных групп пептида, вызванное их пространственной близостью к парамагнитным спиновым меткам 5- и 16-ДСК, преимущественно распределяющимся вблизи поверхности и центра мицеллы соответственно. На основании картины изменения интенсивности кросс-пиков в спектре 1H/15N-HSQС при добавлении спиновых меток (рис. 2д), а также данных о замедленном обмене протонов амидных групп на дейтерий растворителя (рис. 2б) сделан вывод о том, что а-спираль Lys687-Asp694 (далее JM-спираль) лежит в области гидратированных полярных групп ДФХ, а а-спираль Gly700-Leu723 (далее ТМ-спираль) пронизывает гидрофобную часть мицеллы. Амфифильность короткой JM-спирали также предполагает ее расположение вдоль поверхности мицеллы приблизительно перпендикулярно к ТМ-спирали, как показано на рис. 3г. Следующие друг за другом слабополярные и гидрофобные аминокислотные остатки на участке Gly700-Leu723 форми-
Структурная статистика для репрезентативного набора из 20 ЯМР-структур APPjmtm, встроенного в мицеллы ДФХ
ЯМР-данные для расчета структуры Статистика
Общее количество ограничений ЯЭО 31В
Внутриостаточные 111
Межостаточные 207
последовательные (|i-j|=1) 132
средней дальности (1<|і—||<4) 75
дальние (|i-j|>4) 0
Ограничения на водородные связи (верхние/нижние) между атомами основной цепи (24 связи) между атомами основной и боковой цепей (0 связей) 72/72 0/0
Ограничения на двугранные углы 74
угол ф основной цепи 30
угол ф основной цепи 30
угол X1 боковой цепи 14
Качество расчета и структурная статистика
Штрафная функция программы CYANA (А2) 0.3В ± 0.03
Нарушения ограничений
на расстояния (>0.2 А) 1
на двугранные углы (>50) 0
Попарное среднеквадратическое отклонение между структурами (А)
примембранная а-спираль, остатки Lys687-Asp694
по атомам основной цепи 0.23 ± 0.09
по всем тяжелым атомам 1.59 ± 0.2В
ТМ а-спираль, остатки Gly700-Leu723
по атомам основной цепи 0.14±0.05
по всем тяжелым атомам 0.55±0.10
Анализ карты Рамачандрана (% остатков)
в благоприятных регионах В4.б
в дополнительных разрешенных регионах 13.5*
в принципиально разрешенных регионах 1.5*
в запрещенных регионах 0.4*
*Остатки из подвижных и неструктурированных участков APPjmtm.
руют протяженный ~40 А ТМ-сегмент. Положительно заряженные аминогруппы боковых цепей Lys699 и Lys724, фланкирующих ТМ-спираль, взаимодействуют, по-видимому, с отрицательно заряженными фосфатными группами головок детергента. Наблюдаемая i+4-периодичность вторичного химического сдвига сигналов протонов (рис. 2в) указывает
на периодичное изменение длин водородных связей HN•••Oc вдоль ТМ-спирали [24]. Амидные группы остатков Leu705, Gly709, А1а713 и Val715, располо-
б
Рис. 3. Пространственная структура APPjmtm. а - Набор из 20 ЯМР-структур APPjmtm, совмещенных по атомам основной цепи а-спирали Gly700-Leu723. Показана только основная цепь пептида. б - Набор из 20 ЯМР-структур APPjmtm, совмещенных по атомам основных цепей а-спиралей Lys687-Asp694 ^М-спираль) и Gly700-Leu723 (ТМ-спираль) по отдельности. Из-за неопределенности в расположении а-спиралей относительно друг друга структуры APPjmtm приведены с разрывом в неструктурированном петлевом участке между остатками Gly696-Ser697. Показаны только тяжелые атомы. в - Репрезентативная пространственная структура APPjmtm с нумерацией остатков, соответствующей АРР. Показаны ковалентные связи с участием тяжелых атомов (для а-спиралей зеленым цветом), а также амидных протонов (желтым). Красным выделены амидные группы остатков ТМ-спирали с максимальными локальными значениями вторичного химического сдвига Д6Н^0 (рис. 2в). Голубым выделены амидные группы остатков, показавшие изменение обобщенного химического сдвига Д6[Н|ч|]>0.04 (рис. 2е) при добавлении аналога холестерина к мицеллам со встроенным APPjmtm. г -Представлено схематичное изображение мицеллы ДФХ со встроенным мономером APPjmtm, JM- и ТМ-спирали которого выделены синим и красным соответственно. Под JM-спиралью показано предполагаемое разрежение полярных головок детергента со встроенными спиновыми метками 5- и 16-ДСК, парамагнитные центры которых схематично показаны в виде звездочек, расположенных ближе к поверхности и к центру мицеллы соответственно. Под межспиральной петлей рядом с ^концом ТМ-спирали схематично указан холестеринсвязывающий центр ТМ-домена АРР.
а
женные на одной стороне ТМ-спирали (рис. 3в), образуют более короткие водородные связи ^-ОС чем остатки с противоположной стороны спирали. Таким образом, у ТМ-спирали в районе спаренных остатков Gly708-Gly709 имеется небольшая вогнутость со слабополярной поверхностью.
Наличие двух независимых спиральных участков в структуре APPjmtm подтверждается также ^^релаксационными данными. JM- и ТМ-спирали APPjmtm имеют разные характерные значения (~6
и ~9 нс соответственно) эффективного времени корреляции броуновского вращения тн, рассчитанного из отношения Т /Т (рис. 2г). Оценка массы супра-молекулярного комплекса согласно эмпирической зависимости [25] из усредненного по спиральным участкам значения <тн> «8 нс дает величину около 27 кДа, что соответствует мономеру APPjmtm, окруженному примерно 57 молекулами детергента (типичный состав мицеллы ДФХ [26]). Значительная разница (~3 нс) в значениях <тн> у остатков
JM- и TM-спиралей частично объясняется топологией APPjmtm с перпендикулярным относительным расположением а-спиралей в анизотропно вращающейся мицелле. Помимо этого, возможно вращение APPjmtm внутри мицеллы, а также повышенная латеральная подвижность JM-спирали (по сравнению с ТМ-сегментом) за счет подвижной соединительной петли Val695-Lys699. О подвижности петлевого участка в сравнении с а-спиралями свидетельствует локальное уменьшение для Ser697 значения эффективного времени корреляции броуновского вращения тн. В свою очередь, из распределения значений гетероядерного ^^Ш} ЯЭО (рис. 2г) следует, что, в отличие от жесткой ТМ-спирали (15N{1H} ЯЭО > 0.8), ^концевая половина JM-спирали и соединительная петля Val695-Lys699 подвижны в пико-наносекундном диапазоне (0.6<15N{1H} ЯЭО < 0.8). Повышенная подвижность приводит к тому, что конформация JM-спирали установлена менее точно (таблица, рис. 2ж и 3б), а структура петлевого участка не определена.
Полученные в настоящей работе структурнодинамические данные соответствуют результатам недавних ЯМР-исследований [13] вторичной структуры и динамики более длинного фрагмента APP - Asp672-Asn770, так называемого пептида С99, который является С-концевой частью APP после гидролиза в-секретазой. Определены границы спиральных участков Val689-Asp694 и Asn698-Lys724, пептида С99, соответствующих а-спиралям -короткой примембранной и длинной трансмембранной, соединенным подвижной перемычкой. Однако пространственная структура пептида С99 не была рассчитана. На основании данных о титровании пептида С99 в мицеллах LMPG водорастворимым аналогом холестерина, P-СH0LBIMALT, предположили, что APP может функционировать и как сенсор холестерина в мембране нейронов. Действительно известно, что в организме человека APP накапливается в богатых холестерином микродоменах, названных липидными рафтами [27, 28]. Более того, ферментативный гидролиз в-секретазой, ведущий к образованию в-амилоида, происходит, в первую очередь, в липидных рафтах [28]. Также установлено, что гидролиз по неамилоидогенному пути а-секретазой происходит вне холестерин-богатых кластеров, причем фермент инактивируется при связывании субстрата с липидными рафтами [28]. В настоящей работе изучено связывание APPjmtm со встраивающимся в мицеллу аналогом холестерина - холесте-рилгемисукцинатом. Наиболее значимые изменения обобщенного химического сдвига Дб наблюдаемые у остатков Gly695, Ser696, Gly700, 11е701, 11е703 и №г713 (рис. 2е), указывают на место встраивания
холестерилгемисукцината в области межспиральной петли (рис. 3в,г), что хорошо согласуется с ранее полученными данными о специфическом взаимодействии пептида С99 с другим аналогом холестерина [13].
Данные по титрованию APPjmtm в мицеллах парамагнитными спиновыми метками (рис. 2д) косвенно подтверждают, что рядом с JM-спиралью и ^концом TM-спирали находится гидрофобная полость, предназначенная для взаимодействия APP с холестерином. При равномерном распределении спиновых меток 5- или 16-ДСК наблюдалось бы одинаковое уширение сигналов, находящихся на одном расстоянии от центра мицеллы ДФХ. Однако в обоих случаях регистрируется различное уширение сигналов остатков, находящихся на разных концах трансмембранной а-спирали (рис. 2д). Причин у этого явления может быть несколько. Во-первых, распределение спиновых меток по мицелле может быть неоднородным в силу особой структуры и свойств встроенного в нее APPjmtm. Во-вторых, длина и размер боковых цепей, контактирующих с метками аминокислотных остатков, влияют на степень экранирования амидных протонов (что, видимо, наиболее выражено на участках G700-Leu705 и Пе718^еи723). Вместе с тем значительное уширение сигналов на участке Leu688-Ala692 при титровании спиновой меткой 16-ДСК напрямую указывает на локальное изменение структуры мицеллы под поверхностной примембран-ной а-спиралью, которая, по-видимому, «расталкивает» полярные головки ДФХ (липидов), что приводит к образованию «гидрофобного кармана». В этот «карман» с некоторой избирательностью встраиваются обе спиновые метки (рис. 3г), имеющие небольшие полярные группы.
Модификация внешних условий и окружения APP в клеточной мембране может влиять на изменение конформации межспирального петлевого участка. Это должно привести к вариации взаимной ориентации JM- и ТМ-спиралей с изменением размера холестеринсвязывающего «гидрофобного кармана», что, в свою очередь, может играть роль в модулировании функции APP. Тандем из остатков Gly708-Gly709 в центре ТМ-спирали APP может служить неким компенсатором толщины липидного бислоя, которая изменяется в зависимости от состава клеточной мембраны, в том числе из-за холестерина, входящего в состав липидных рафтов. Важно отметить, что семейные мутации, ассоциированные с ранним развитием болезни Альцгеймера, сосредоточены не только рядом с ТМ-сайтами расщепления APP у-секретазой, но и на С-конце JM-спирали, где расположены ионогенные остатки Asp693 и Glu694 (рис. 2, низ). Поэтому установле-
ние в мембраноподобной среде методом гетероядер-ной ЯМР-спектроскопии пространственной структуры ТМ-домена АРР с холестеринсвязывающим примембранным участком является необходимым шагом в раскрытии молекулярного механизма альтернативного расщепления АРР, ассоциированного с патогенезом болезни Альцгеймера.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, Федеральной целевой программой «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» и Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
CnMCOK ^MTEPATYPH
1. Grigorenko A.P., Rogaev E.I. // Mol. Biol. (Mosk). 2007. V. 41.
P. 331-345.
2. Duce J.A., Tsatsanis A., Cater M.A., James S.A., Robb E., Wikhe K., Leong S.L., Perez K., Johanssen T., Greenough M.A., et al. // Cell. 2010. V. 142. P. 857-867.
3. Rauk A. // Dalton Trans. 2008. V. 14. P. 1273-1282.
4. Selkoe D.J. // Nature. 2003. V. 426. P. 900-904.
5. Steiner H., Fluhrer R., Haass C. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283.
P. 29627-29631.
6. Soscia S.J., Kirby J.E., Washicosky K.J., Tucker S.M., In-gelsson M., Hyman B., Burton M.A., Goldstein L.E., Duong
5., Tanzi R.E., Moir R.D. // PLoS One. 2010. V. 5. P. e9505.
7. Thinakaran G., Koo E.H. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283.
P. 29615-29619.
8. Wiley J.C., Hudson M., Kanning K.C., Schecterson L.C., Bothwell M. // J. Neurochem. 2005. V. 94. P. 1189-1201.
9. Gorman P.M., Kim S., Guo M., Melnyk R.A., McLaurin J., Fraser P.E., Bowie J.U., Chakrabartty A. // BMC Neuroscience. 2008. V. 9. P. 17-27.
10. Munter L.M., Voigt P., Harmeier A., Kaden D., Gottschalk K.E., Weise C., Pipkorn R., Schaefer M., Langosch D., Mul-thaup G. // EMBO J. 2007. V. 26. P. 1702-1712.
11. Kienlen-Campard P., Tasiaux B., van Hees J., Li M., Huys-seune S., Sato T., Fei J.Z., Aimoto S., Courtoy P. J., Smith
5.0., et al. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 7733-7744.
12. Marenchino M., Williamson P.T., Murri S., Zandomeneghi G., Wunderli-Allenspach H., Meier B.H., Kramer S.D. // Biophys. J. 2008. V. 95. P. 1460-1473.
13. Beel A.J., Mobley C.K., Kim H.J., Tian F., Hadziselimovic A., Jap B., Prestegard J.H., Sanders C.R. // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 9428-9446.
14. Curtain C.C., Ali F., Volitakis I., Cherny R.A., Norton
R.S., Beyreuther K., Barrow C.J., Masters C.L., Bush A.I., Barnham K.J. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 20466-20473.
15. Bokvist M., Lindstrom F., Watts A., Grubner G. // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 1039-1049.
16. Бочарова О.В., Надеждин К.Д., Бочаров Э.В., Арсеньев А.С. // Биоорган. химия. 2010. Т. 36. № 1. С. 105-111.
17. Keller R.L.J. The Computer Aided Resonance Assignment Tutorial., Goldau, Switzerland: CANTINA Verlag, 2004. 81 p.
18. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., Skelton N.J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. 2nd ed. San Diego, CA, USA: Acad. Press, 2007. 886 p.
19. Bocharov E.V., Korzhnev D.M., Blommers M.J., Arvinte T., Orekhov V.Y., Billeter M., Arseniev A.S. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 46273-46279.
20. Gflntert P. // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2003. V. 43. P. 105-125.
21. Cornilescu G., Delaglio F., Bax A. // J. Biomol. NMR. 1999.
V. 13. P. 289-302.
22. Baker E.N., Hubbard R.E. // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1984. V. 44. P. 97-179.
23. Koradi R., Billeter M., Wflthrich K.J. // Mol. Graphics. 1996. V. 14. P. 51-55.
24. Wagner G., Pardi A., Wflthrich K. // J. Am. Chem. Soc. 1983. V. 105. P. 5948-5949.
25. Daragan V.A., Mayo K.H. // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1997. V. 31. P. 63-105.
26. Lazaridis T., Mallik B., Chen Y. // J. Phys. Chem. B. 2005.
V. 109. P. 15098-15106.
27. Vetrivel K.S., Thinakaran G. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V. 1801. P. 860-867.
28. Beel A.J., Sakakura M., Barrett P.J., Sanders C.R. // Bio-chim. Biophys. Acta. 2010. V. 1801. P. 975-982.
