CC BY
44УДК 616.992
СРАВНИТЕЛЬНЫМ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ КЛЕТОК HIS ТО PL A SMA CAPSULATUM DARLING
Вьючнова Н.В. (научный сотрудник)*, Ткаченко Г.А. (старший научный сотрудник), Гришина М.А. (зав. лабораторией), Савченко С.С. (научный сотрудник), Антонов В.А. (зав.отд.), Яипницкий А.В. (замдиректора)
ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Россия
© Коллектив авторов, 2009
В статье рассмотрены различные методы выделения ДНК применительно кН. capsulatum. Проведен сравнительный анализ использования различных лизирующиж ферментов для расщепления компонентов клеточной стенки возбудителей гистоплазмоза. Показано, что оптимальным методом выделения ДНК является гуанидинтиоцианат-фенольная экстракция с переосаждением ДНК топропанолом. Чувствительность реакции амплификации составила 1104-1-105 клеток/мЛ. Добавление на стадии пробоподготовки в образец литических агентов позволяет повысить чувствительность реакции амплификации до1103- 1104 клеток/мл.
Ключевые слова: лизирующие ферменты, методы выделения ДНК, Н. capsulatum, ПЦР
THE COMPARATIVE ANALYSIS OF DNA EXTRACTION METHODS FROM HISTOPLASMA CAPSULATUM DARLING CELLS
Vyuchnova N.V. (scientific researcher), Tkachenko G.A. (senior scientific researcher), Grishina M.A. (head of the laboratory), Savchenko S.S. (scientific researcher), Antonov V.A. (head of the department), Lipnitsky A.V. (deputy director)
Research Institute for Plague Control, Volgograd, Russia
© Collective of authors, 2009
Контактное лицо: Вьючнова Надежда Васильевна, Тел.: (8442)37-37-74
There are different methods of DNA extraction of H. capsulatum reviewed in this article. The comparative analysis of Using of various lysing enzymes for destruction of cellular wall components of causative agents of histoplasmosis is carried out. It is shown that an optimum method of DNA extraction is guanidintiotsianat-phenolic extraction with DNA resedimentation by isopropanol. Sensitivity of reaction of amplification was 110* — 110s cells/ml. Addition at a stage DNA preparing in the sample lysis agents allows to raise the sensitivity of reaction of amplification to Ы№- 1401 cells/ml.
Key words: DNA extraction methods, H. capsulatum, lysing enzymes, PCR
ВВЕДЕНИЕ
К глубоким (эндемичным) микозам традиционно относят группу инфекций, обусловленных диморфными грибами, обитающими в почве определенных географических областей, и отличающихся респираторным механизмом заражения. Одним из таких этиологических агентов эндемических микозов является Н. capsulatum, вызывающая гистоплазмоз Ц,2].
В настоящее время выделяют: Н. capsulatum var. capsulatum — возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, высоко эндемичные очаги которого расположены вдоль реки Миссисипи (США), и Н. capsulatum var. duboisii - возбудитель африканского гистоплазмоза. Еще один вариант Н. capsulatum var. farciminosum - возбудитель эпизоотического лимфангоита у лошадей, ослов, мулов. Возбудитель широко распространен в Европе, Северной Африке, Индии и Южной Азии, в патологии людей какого-либо существенного значения не имеет [1, 2].
Природным источником возбудителя считается почва, особенно - верхние ее слои. В естественных условиях микромицет существует в мицелиальной (сапробной) форме. Механизм заражения - аэрогенный. Основной инфицирующий элемент — конидии и мелкие фрагменты мицелия. При вдыхании возбудителя в организме человека происходит конверсия гриба из мицелиальной фазы в дрожжеподобную форму. Продолжительность инкубационного периода - от 3 до 17 дней. В большинстве случаев заболевание протекает бессимптомно. Наиболее распространенным клиническим вариантом гистоплазмоза является пневмония. Возбудитель способен вызывать диссеминированные заболевания, преимущественно у лиц с ослабленной иммунной системой, а также в престарелом возрасте [1-3].
Организм человека не обладает естественным иммунитетом к данным грибам, поэтому восприимчивость населения к ним считается всеобщей. На сегодняшний день надежной вакцины от гистоплазмоза не найдено.
Разнообразие клинических проявлений, наряду с отсутствием характерных черт заболевания, являются причинами трудностей постановки диагноза «гистоплазмоз». В настоящее время лабораторная диагностика основана на использовании микологического, биологического и иммунологического методов. Возбудителей гистоплазмоза относят к агентам
s
э :п> рищ ■ ш • 1 1 D11
II группы патогенности [4]. Для выделения чистой культуры из клинического материала необходимо строгое соблюдение условий работы с Н. capsulatum, согласно действующим СП 1.3.1285-03. Достоверность культурального метода должна быть подтверждена получением конверсии одной фазы гриба в другую. Как правило, эти процедуры занимают минимум 2-3 недели. К биологическому методу лабораторной диагностики гистоплазмоза прибегают для идентификации культуры гриба при исследовании патологического материала, сильно загрязненного посторонней биотой. При этом время, необходимое для верификации диагноза, увеличивается до 8 недель. Постановка иммунологических реакций занимает значительно меньшее время, но они не обладают высокой чувствительностью и специфичностью из-за возможных перекрестных реакций с гетероло-гичными видами микромицетов [1, 2].
В последнее время получила развитие и широкое применение в диагностике и генотипировании патогенных микроорганизмов полимеразная цепная реакция (ПЦР). При постановке ПЦР необходимо выделить достаточное количество ДНК с минимальным содержанием белков и других ингибирующих примесей. Основная проблема при выделении ДНК из грибов - как наиболее эффективно разрушить их клеточные стенки для того, чтобы с максимальным выходом экстрагировать ДНК. Как известно, дрожжевые и мицелиальные грибы обладают прочной клеточной стенкой, которая устойчива к действию большинства лизирующих агентов [5]. Общая масса клеточной стенки может достигать 30% от массы всей клетки, которая состоит на 40% из маннопро-теинов и на 2% - из хитина; остальное приходится на полимер глюкозы - глюкан. Глюкан является важным структурным компонентом клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности, состоящим из нескольких типов молекул полисахарида, образованных, в основном, [5-1,3 и ß-1,6-связанными остатками глюкозы. Хитин - минорный, но чрезвычайно важный компонент клеточной стенки грибов, состоящий из р-1,4-связанных остатков N-ацетилглюкозамина. В настоящее время для получения протопластов у микромицетов используют различные ферменты: ß (1—>3) и ß (1—>6) глюканазу (коммерческое название литиказа или зимолаза), протеазу, маннаназу, хитиназу и сок виноградной улитки [6], которые действуют разрушающе на различные межмолекулярные связи.
В доступной научной литературе имеется ограниченное количество работ, посвященных разработке ПЦР тест-систем для анализа ДНК Н. capsulatum. Как правило, зарубежные авторы использовали коммерческие наборы для выделения ДНК из клеток. R. Bialek с соавторами применяли QIAamp tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) для образцов чистых культур, органов белых мышей линии Balb/c и клинического материла от больных. Чувствительность ПЦР составила 1-5 клеток/образец [7-9].
Н. L. de Matos Guedes с соавторами для выделения ДНК использовали коммерческий препарат Puregene DNA isolation kit (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, Minn.). Исследовали чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы [10].
А. Вгасса с соавторами разработали полугнездовую ПЦР. Исследования проводили с пробами крови, биоптата и кожных покровов, взятых у пациентов с подтвержденным диагнозом «гистоплазмоз»; для выделения ДНК использовали зимолазу. Все пробы исследовали микроскопически, культурально и в ПЦР. Проанализировали 30 проб (24 образца крови, 4 соскоба с кожи и 2 биоптата). При исследовании биоптатов и соскобов с кожи результаты всех трех методов совпадали. 4 образца крови были положительными в ПЦР, хотя в двух из них возбудитель не определялся другими используемыми в работе методами. В реакции амплификации показана возможность определять геномный материал, соответствующий 10 клеткам [11].
Анализ данных из научной литературы не позволяет сделать заключение о преимуществах использования тех или иных литических ферментов для экстракции ДНК из клеток возбудителей гистоплазмоза, а в случаях использования для выделения ДНК коммерческих наборов достаточно сложно оценить эффективность отдельных компонентов.
Цель данной работы заключалась в проведении сравнительной оценки методов выделения ДНК из клеток Н. capsulatum и изучении эффективности использования различных литических ферментов на стадии пробоподготовки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили 18 штаммов Н. capsulatum var. capsulatum, 4 штамма Н. capsulatum var. duboisii, 1 штамм H. capsulatum var. fareiminosum. Исследуемые штаммы микроорганизмов были предоставлены Коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (ФГУЗ ВолгоградНИП-ЧИ Роспотребнадзора).
Все работы проводили согласно требованиям режима работы с особо опасными микроорганизмами и общепринятыми требованиями к проведению ПЦР [12].
Штаммы возбудителей особо опасных микозов в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро с 3% дрожжевым экстрактом (Difco, США) при 28 °С в течение 30 суток. Дрожжевую форму Н. capsulatum получали на агаре Френсиса с добавками при 37 °С в течение 10-14 суток, в зависимости от штамма. Выросшую культуру суспендировали в 0,15 М растворе NaCl, фильтровали через марлевый фильтр и обеззараживали добавлением раствора натрия мертиолата до конечной концентрации 0,1 мг/мл с последующим прогреванием на водяной бане 40 мин при 56± 1 °С и инкубацией при комнатной температуре в течение 24 ч. После обеззараживания
взвеси делали контрольные высевы на стерильность. Количество клеток дрожжевой фазы подчитывали в камере Горяева.
Использовали три способа выделения ДНК: кипячение грибных суспензий при 100 °С в течение 30 мин, метод нуклеосорбции в присутствии гуани-динтиоцианата [13] и гуанидин-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [14].
В качестве источника литических ферментов использовали пищеварительный сок улитки (ПСУ) (ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзо-ра) и коммерческий препарат «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» (Sigma, CIIIA).
Реакционная смесь в объеме 25 мкл содержала исследуемую ДНК, специфические олигонуклеотид-ные праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, фермент Taq-полимеразу и буферный раствор, различный для каждой пары праймеров.
Амплификацию проводили на мультициклере «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) с использованием «горячего старта». Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиумом бромидом и визуализацией в УФ-свете. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением (размером) по отношению к маркерным фрагментам.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе использовали сконструированные нами 2 пары праймеров. Одна пара комплементарна фрагменту гена белка MS8 — mold-specific MS8 protein (GenBank NCBI, AY049031), экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе развития гриба [3,15,16]. Вторая пара специфична фрагменту гена кальций-связывающего белка — calcium-binding protein СВР1 (GenBank NCBI, AF006209), экспрессия которого происходит в дрожжевой фазе и способствует выживанию клеток в макрофагах человека [3,16,17]. Выбранные праймеры обозначили как HcMS8s-HcMS8as и HcCBPls-HcCBP2as, соответственно.
В ходе работы оценивали несколько методов выделения ДНК из микромицетов. При сравнении способов выделения ДНК учитывали следующие критерии - простота, доступность, быстрота выполнения, воспроизводимость, степень экстракции ДНК. Эффективность методов выделения ДНК определяли по наличию специфической амплификации в пробах.
Первоначально, для экстракции нуклеиновых кислот из клеток микромицетов, использовали кипячение грибной взвеси. Как следует из рисунка, фрагменты необходимого размера в реакции амплификации синтезировались с ДНК возбудителей гисто-плазмоза в пробах с концентрацией НО6 клеток/мл. Отмечено наличие «шлейфов» на электрофореграм-ме. Нами установлено, что высокотемпературный лизис, будучи самым простым и доступным методом выделения нуклеиновых кислот, оказался мало эф-
фективным для выделения ДНК Н. capsulatum, вероятно, в связи с недостаточным разрушением клеточной стенки грибов.
Использование в работе методики нуклеосорбции в присутствии натрия гуанидинтиоцианата позволило повысить чувствительность ПЦР до 1-105 клеток/мл (Рис. 1). Однако при использовании метода нуклеосорбции возможны потери ДНК вследствие необратимой адсорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце.
В ходе исследований для сравнения использовали ещё один метод выделения ДНК из микромицетов, разработанный G.S. Sandhu с соавторами [14]. Чувствительность реакции амплификации с используемыми праймерами составила 1-104 — 1-105 клеток/мл (Рис. 1).
106 105 104 103 1 о2 к+
<—Выделение ДНК методом кипячения
•«—Выделение ДНК методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата
<— Выделение ДНК методом гуанидин-фенольной экстракции без обработки клеток ферментом
Выделение ДНК методом гуанидинфе-нольной экстракции после обработки клеток ферментом
Рис.1. Электрофореграмма результатов ПЦР при сравнении эффективности различных способов экстракции ДНК возбудителей гистоплазмоза.
106-102 - концентрация грибных суспензий клеток/мл К+ - положительный контроль
Из всех апробированных методов наиболее эффективным для выделения ДНК из клеток Н. capsulatum оказался метод гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом.
Для изучения эффективности использования различных ферментов на стадии пробоподготовки при выделении ДНК из клеток Н. capsulatum в ПЦР применяли различные литические препараты, разрушающие компоненты клеточной стенки грибов [5,6,18]. Первоначально использовали пищеварительный сок улитки (ПСУ) как источник хитинолигических ферментов. Для определения оптимальных условий выделения ДНК к суспензии клеток Н. capsulatum добавляли 5, 10, 20, 30 мкл ПСУ и инкубировали смесь при 37 "С в течение 1, 6,18 часов, после чего выделяли ДНК методом гуанидин-фенольной экстракции с
э :п> риш ■ ш • 1 1 D11
переосаждением ДНК изопропанолом. Использование ПСУ позволило повысить эффективность выделения ДНК из клеток Н. capsulatum и обеспечило амплификацию специфичных фрагментов в ПЦР у большинства используемых в работе штаммов. ПСУ — фермент опытного образца, используемый для лизиса клеточной стенки грибов, не стандартизирован, и активность его может изменяться от серии к серии [18]. Вследствие этого, в дальнейшей работе для расщепления клеточной стенки микромицетов мы использовали коммерческий препарат «Lysing Enzymes из Trichoderma harzianum», обладающий целлюлаз-ной, протеазной и хитиназной активностями. Фермент добавляли в концентрациях 1, 2, 3, 4 и 5 мг/мл и инкубировали смесь 1, 6, 18 часов при температуре 37 "С. На основании проведенных экспериментов установлено, что применение лизирующих ферментов из Т. harzianum в оптимальной концентрации 2 мг/мл и выдерживанием смеси в течение 1 часа при 37 °С позволило повысить эффективность экстракции ДНК из клеток Н. capsulatum. В этом случае чувствительность ПЦР составила 1-103-1-104 клеток/ мл (Рис. 1).
Для сравнения полученных результатов использовали гнездовую ПЦР с олигонуклеотидными затравками Не 100 PCR на основе гена, кодирующего уникальный 100 кДа белок Н. capsulatum [7,9]. Чувствительность реакции амплификации с применением литических ферментов как для прайме-
ров HcMS8s-HcMS8as и HcCBPls-HcCBP2as, так и праймеров HclOO PCR, была одинаковой и составила 1-104 кл/мл. Однако в работах Bialek R. с соавторами чувствительность реакции амплификации составляла 1-5 клеток в образце, но для определения концентрации использовали чистую ДНК плазмиды pCR2.1-TOPO, на которой был клонирован участок амплифицируемого гена Н. capsulatum в бактериях. Клеточная стенка бактерий по своему составу сильно отличается от оболочки гриба. При экстракции ДНК из клетки бактерии полного лизиса можно достичь простым кипячением, в то время как клеточная стенка микромицетов, как правило, при этом не разрушается. Этим можно объяснить несовпадение заявленной авторами чувствительности ПЦР (1-5 грибных клеток) с нашими результатами, которые получены в экспериментах при работе с целыми клетками грибов.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о преимуществе метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом для выделения ДНК из клеток Н. capsulatum. В ходе работы мы оценили эффективность использования литических ферментов на стадии пробоподготовки. Предварительное воздействие лизирующих агентов на клетки Н. capsulatum, в конечном итоге, позволило повысить чувствительность реакции ПЦР до 1-103-1-104 клеток/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kauffman С.А. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update // Clin. Microbiol. Rev.-2007.-Vol.20, №1.-P.115~132,
2. Guimaraes A. J., Nosanchuk J.D., Zancope-Qliveira R.M. Diagnosis of histoplasmosis // Brazilian J. of Microbiology.-2006.-Vol,37.-P.l-13.
3. Maresca В., Kobayashi G.S. Dimorphism in Histoplasma capsulatum: a model for the study of cell differentiation in pathogenic fungi // Microbiol. Rev.-1989.-Vol.53, №2.-P.186-206.
4. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3»23.22-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV" групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» // утверждены главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 28.01.2008 г. под №4, зарегистрированы в Министерстве юстиции РФ 21.02.2008 г. под №11197, введены в действие с 1.05.2008 г.
5. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Новый подход для выделения геномной.ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-соДержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР // БиОорганическая химия.-2002.-Т.28, №2.-С.156-167.
6. Кабелина Т.С., Кулаев И.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биологической химии.-2001.-Т.41.-С.105-130.
7. Bialek R., Fischer J.R., FeuchtA., et al. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay // J.Clin. Microbiol.-2001.-Vol.39, №4.-P. 1506-1509.
8. Bialek R., Ernst F., DietzK., etal. Comparison of staining methods and a nested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections // Microbiol, and Infect. Dis.- 2002.-Vol.ll7.-P.597-603.
9. Bialek R., FeuchtA, Aepimcs C., et al. Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue // J.Clin.Microbiol.-2002.-Vol.40, №5.-P.l644-1647,
10. H.L. deMatos Guedes, Guimaraes A.J., Peralta J.M., etal. PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, №2.-P.535-539.
11. Bracca A., Tosello M.E., Girardini J.E., etal. Molecular detection oi Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, №4.-P.1753-1755.
12. МУ1,3.1794-03. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности. - М., 2003.
13. Boom R., Sol C.J.A., Salimans М.М., et al. Rapid and simple method purification of nucleic acids // J.Clin.Microbiol.-1990.-Vol.28, №3.-P.495-503.
14. Sandliu G.S., Bruce C.IC, Stockman L. Molecular probes for diagnosis of fungal infections // J.Clin.Microbiol.-1995--Vol,41, №4.-P.2913-2919.
15i Xianbin Т., Glenmore S. The mold-specific MS8 gene is required for normal hypha formation in the dimorphic pathogenic fungus Histoplasma capsulatum 11 Eukaryoticcell.-2002.-Vol.1, №2.- P.249-256.
16. Hwang L., Hocking-Мштау D., Bahrami A.K., et al. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray // Molecular Biology of the Cell.-2003.-Vol.l4.-P.2314-2326.
17. Ratel J.B., Batanghari J.W., Goldman WE. Probing the yeast phase-specific expression of the CBP1 gene in Histoplasma capsulatum II Journal of Bacteriology.-1998.-Vol.180, №7.-P.1786-1792.
18. Salazar О., }иапЖ„ Asenjo A. Enzymatic lysis of microbial cells // Biotechnol. Lett.-2007.-Vol.29.-P.985-994.
Поступила в редакцию журнала 03.08.09
Рецензент: С.М. Игнатьева
