CC BY
18УДК 616-002.828:577.214.3
РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БЛАСТОМИКОЗА С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
маркин А.м. (н.с.)*, ткаченко г.А. (зав. лаб.), Половец н.В. (с.н.с.), савченко с.с. (зав. сектором), Шаров т.н. (н.с.), Антонов В.А. (зав. отд.), топорков А.В. (директор института)
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Волгоград, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Представлены результаты работы по подбору и анализу прай-меров, направленных на обнаружение ДНК Blastomyces dermatitidis -возбудителя бластомикоза. Определение оптимальных параметров реакции амплификации с выбранными праймерами проводили на чистых культурах B. dermatitidis. Эффективность работы диагностического набора реагентов для индикации возбудителя бластомикоза в пробах биологического материала проверена в условиях моделирования заболевания на лабораторных животных.
Ключевые слова: бластомикоз, Blastomyces dermatitidis, набор реагентов, ПЦР в режиме реального времени
DEVELOPMENT OF A DIAGNOSTIC KIT FOR INDICATION OF CAUSATIVE AGENT OF BLASTOMYCOSIS BY REAL TIME PCR
Markin A.M. (scientific collaborator), Tkachenko G.A. (head of the laboratory), Polovec N.v. (senior scientific collaborator), savchenko s.s. (senior scientific collaborator), sharov Т.п. (scientific collaborator), antonov v.A. (head of the laboratory), Toporkov A.v. (head of the institute)
Volgograd Research Institute for Plaque Control, Volgograd Russia
© Collective of authors, 2015
The results of searching and analysis of primers designed to detect the DNA of the fungus Blastomyces dermatitidis, the causative agent of Blastomycosis have been presented. The determinations of the optimal parameters of the amplification reaction with selected primers were performed on pure cultures of B. dermatitidis. The efficiency of diagnostic reagent kit for indication the causative agent of blastomycosis in samples of biological material tested using a simulation of the disease in laboratory animals.
Key words: Blastomyces dermatitidis, blastomycosis, diagnostic kit, real-time PCR
Контактное лицо: Маркин Александр, e-mail: alexander.markin.34@gmail.com
Бластомикоз - особо опасное заболевание, этиологическим агентом которого является микромицет Blastomyces dermatitidis. Наиболее частые проявления заболевания: лихорадка, озноб, артралгия, миалгия, головная боль, непродуктивный кашель, кожные бородавчатые или язвенные поражения. Острая форма заболевания сходна и трудно дифференцируема с бактериальной пневмонией, хронической формой туберкулёза и раком легких. Существует молниеносная форма заболевания с развитием ОРДС (острый респираторный дисстресс синдром). Причем в таком виде заболевание заканчивается в большинстве случаев летально [1]. В научной литературе представлены редкие случаи заболевания с поражением печени, селезенки, надпочечников, сердца, лимфатических узлов, центральной нервной системы, слизистых оболочек, костей и суставов, предстательной железы. Последнее наиболее интересно в плане отслеживания распространения инфекции, так как описаны случаи передачи инфекции при незащищенном половом контакте с больным бластомикозом, у которого имела место диссеминация возбудителя в предстательную железу [2].
По данным современных исследований, очерчена эндемичная зона бластомикоза в районе южных и восточных штатов США [3-5]. В Африке бластомикоз известен в 18 странах, однако большинство случаев заболевания регистрируют в южной части материка, особенно - в Южно-Африканской республике и Зимбабве [6]. Известны завозные случаи бластомикоза, например на Гавайских островах, а также некоторых странах Европы (Италия, Франция, Венгрия, Польша) [7, 8].
Случаи заболевания бластомикозом в Российской Федерации не регистрировали. Однако, исходя из данных о росте туристической и деловой активности между странами Африки, Северной и Южной Америки и Российской Федерацией, не исключена возможность появления больных на территории России. Нельзя забывать о вероятности применения возбудителя бластомикоза в качестве биологического оружия террористическими организациями. Таким образом, медицинским организациям, в частности клиническим лабораториям Российской Федерации, необходимо иметь быстрые и надежные средства для индикации и идентификации B. dermatitidis [9, 10]. На сегодняшний день полимеразная цепная реакция (ПЦР) дает возможность обеспечить быстрое и точное обнаружение возбудителя бластомикоза.
Наиболее перспективными мишенями для конструирования ПЦР-тест-систем могут быть гены, кодирующие различные типы белков, участвующих в формировании факторов патогенности. Ранее для этого широко использовали рибосомальные гены. Они обладают важными положительными характеристиками, например, многокопийностью, которая обеспечивает высокую чувствительность реакции амплификации. Ограничением является то, что у близкородственных микроорганизмов последовательности рРНК высоко консервативны, и высокая степень гомологии ограничивает специфичность амплификации [11].
Среди наиболее перспективных мишеней для разработки молекулярно-генетических диагностических тест-систем некоторые исследователи выделяют антигены клеточной стенки дрожжевой формы B. dermatittidis Blastomyces adhesin 1 (BAD1) и а-(1,3)-
■
глюкан. BAD1 является фактором адгезии и модулирует иммунный ответ макроорганизма. Ген a-(1,3)-glucan кодирует фермент, ответственный за синтез а-1,3-глюкана клеточной стенки гриба, способствующий колонизации альвеол [12].
В настоящее время сконструированы и прошли комиссионные испытания несколько генодиагностических тест-систем, направленных на обнаружение других представителей группы особо опасных микро-мицетов. Это набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii методом по-лимеразой цепной реакции [13, 14] и набор реагентов для выявления ДНК микромицетов рода Histoplasma методом полимеразной цепной реакции [15].
Цель нашей работы - подбор праймеров и зонда для создания чувствительной и специфичной диагностической тест-системы для индикации возбудителя бластомикоза в пробах биологического материала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования: штаммы B. dermatitidis 9, B. dermatitidis 2, B. dermatitidis 6/85. Изучали штаммы микромицета в мицелиальной и дрожжевой формах. Также в работе использовали гетерологичные микроорганизмы: по 3 штамма Histoplasma capsulatum var. capsulatum, Coccidioides immitis, C. рosadasii, Cryptococcus neoformans.
Работу с микромицетами осуществляли в соответствии с требованиями нормативных документов: СП 1.3.3118-13 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности), СП 1.3.232208 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней [16, 17].
Моделирование бластомикозной инфекции проводили посредством заражения белых мышей внутри-брюшинно по 0,1 мл взвеси микромицета B. dermatitidis 6/85 в концентрации 5-106 клеток/мл. Равное количество мышей заражали возбудителем в мицелиальной и дрожжевой формах.
Молекулярную структуру праймеров анализировали с использованием компьютерных программ Unipro UGENE: 1.11.1. Олигонуклеотидные праймеры и зонд синтезированы ЗАО «Синтол» (Москва). Реакционная смесь для проведения ПЦР в объеме 25 мкл содержала: исследуемую ДНК, специфические прямые и обратные праймеры, флуоресцентные зонды, дезоксирибонукле-озидтрифосфаты (дНТФ), MgCl2, буфер, фермент Taq-полимеразу и деионизованную стерильную воду. Амплификацию в режиме реального времени выполняли на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно мировым исследованиям, верной стратегией является поиск мишеней среди генов, кодирующих синтез факторов патогенности. Однако в этом утверждении может скрываться ошибка. Среди близкородственных микроорганизмов встречаются сходные молекулы факторов патогенности, что исходит из гомологии нуклеотидной последовательности выбран-
ных генов. Следовательно, поиск, в первую очередь, должен касаться максимально специфичного для изучаемого организма гена. Перспективными мишенями могут стать также гены, отвечающие за морфологические перестройки. В качестве мишени мы выбрали уникальный для B. dermatitidis ген BYS-1 (blastomyces yeast-phase specific protein), который участвует в процессе конверсионного перехода из мицелиальной в дрожжевую фазу роста гриба [18]. Экспрессия продукта происходит в дрожжевой фазе и влияет на морфогенез дрожжевых клеток B. dermatitidis. Олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления ДНК возбудителя бластомикоза выбраны в результате анализа секвенированных нуклеотидных последовательностей генов, представленных в генетической базе GenBank. Праймеры, названные нами как Bys-1R-Bys-1F, обеспечивали специфичную амплификацию фрагмента ДНК размером 305 п.н. Также в качестве мишени выбран ген а-1,3-глюкансинтазы. Праймеры были обозначены BDags-1F - BDags-2R, размер ампликона составлял 178 п.н.
Используя базу данных BLASTn и программный пакет Primer-BLAST [18], проверили праймеры на отсутствие гомологии с секвенированными нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, находящихся в базах данных Genbank и Broad Institute [18, 19]. В ходе анализа in silico было показано, что выбранные последовательности прай-меров специфически взаимодействуют только с предложенной мишенью, геном BYS-1 возбудителя бластомикоза B. dermatitidis. Аналогичные результаты были получены при анализе праймеров, направленных на обнаружение гена а-1,3-глюкансинтазы. Для осуществления детекции результатов амплификации сконструированы флуоресцентные зонды построенных по типу «молекулярного маячка». На одном конце каждого из зондов нами пришита флуоресцентная метка FAM, а на другом - гаситель флуоресценции RTQ1.
На следующем этапе исследования определяли оптимальную концентрацию компонентов реакционной смеси, подбирали температурные режимы для денатурации, отжига праймеров и элонгации цепи.
Для проведения ПЦР с праймерами Bys-1R-Bys-1F и BDags-1F - BDags-2R реакционная смесь в 25 мкл содержала: 5 мкл x5 ПЦР-буфер (ООО «ИнтерЛабСер-вис»), MgCl2 2,5 мМ, 200 мкМ каждого из четырёх де-зоксинуклеозидтрифосфатов; специфические прямые и обратные праймеры по 12 пМ, 6 пМ флуоресцено-меченого зонда, 0,5 ед. фермента Taq-F полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис») и 10 мкл исследуемой пробы ДНК.
Для праймеров Bys-1R-Bys-1F установлены оптимальные условия проведения реакции амплификации: этап предварительной денатурации ДНК при 95 °C -15 мин., затем в течение 45 циклов - денатурация ДНК при 95 °C - 20 сек.; отжиг праймеров и элонгация цепи 60 °C - 60 сек.
Для праймеров BDags-1F - BDags-2R отработаны оптимальные условия проведения реакции амплификации: этап предварительной денатурации ДНК при 95 °C - 15 мин., затем в течение 45 циклов - денатурация ДНК при 95 °C - 10 сек.; отжиг праймеров 55 °C -20 сек. и элонгация цепи 72 °C -20 сек.
При определении чувствительности необходимо установить точную концентрацию клеток гриба в исследуемой взвеси. Однако клетки мицелия гриба имеют достаточно сильные межклеточные соединения и агрегируют с образованием крупных хлопьевидных структур, которые затрудняют подсчет концентрации. Вследствие этого прямой подсчет количества клеток при исследовании мицелиальной культуры B. dermatitidis в камере Горяева невозможен, а определение концентрации по стандарту мутности не дает точных результатов. Для определения количества клеток использовали подход определения расчета количества клеток по концентрации ДНК, которую измеряли на спектрофотометре «GeneQuant» («Amersham», США). А затем производили пересчет концентрации геномной ДНК на геномные эквиваленты (или копии ДНК клеток в мл) на основе среднего значения размера генома B. dermatitidis, который составляет около 70 Мб [19]. При исследовании чистых культур гриба после обеззараживания проб выделение ДНК осуществляли путем лизиса в растворе фенол-гуанидинизотиоцио-ната натрия с последующим осаждением ДНК изопро-панолом [Sandhu G.S., et al.//J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 41, №4].
В результате проведенных экспериментов минимальный порог чувствительности реакции амплификации, при котором происходит детекция с помощью праймеров Bys-1R-Bys-1F, составил 1-103 кл/мл (Рис. 1). Для праймеров BDags-1F - BDags-2R минимальный порог чувствительности достигал концентрации 1-102 кл/ мл (Рис. 2). Меньшее количество циклов, необходимое для достижения порогового уровня является показателем того, что праймеры BDags-1F - BDags-2R имеют более низкий предел обнаружения и, следовательно, более высокую чувствительность.
2
и / 7
äc ^
Порог! __^
Цикл
Рис.1. Кривые флуоресценции накопления продуктов
амплификации с праймерами ВуБ-1К-ВуБ-1Р: 1 - В. бегтаШШ'к 6/85, концентрация 1-105 кл/мл, пороговый цикл 27,62; 2 - В. бегтаШШ'к 6/85 концентрация 1-104 кл/мл, пороговый цикл 30,82; 3 - В. бегтаШШ'к 6/85 концентрация МО3 кл/мл, пороговый цикл 35,55.
Z/7
/ j > /
/Та / ' / /
1 //3 4
Порог| - -—-
Рис.2. Кривые накопления продуктов амплификации с праймерами ВЭадБ-1Р - ВОадБ-2К: 1 - В. бегтаШШ'к 9, концентрация МО5 кл/мл, пороговый цикл 25,24; 2 -В. бегтаШШ'к 9, концентрация МО4 кл/мл, пороговый цикл 28,89; 3 - В. 9, концентрация МО3 кл/мл,
пороговый цикл 32,80; 4 - В. бегтаШШ'к 9, концентрация 1-102 кл/мл, пороговый цикл 36,19
При исследовании проб чистых культур гетероло-гичных микроорганизмов в концентрации 1-107 кл/мл с праймерами Ву8-1К.-Ву8-1Б и ВОа§8-1Б - ВОа§8-2К. не выявили положительных реакций амплификации.
Следующим шагом было определение эффективности выбранных нами наборов праймеров и зондов для применения в диагностике заболеваний. Для этого проводили несколько экспериментов по моделированию бластомикоза, а именно - контаминацию крови возбудителем бластомикоза и заражение лабораторных животных. В обоих экспериментах использовали штамм В. dermatitidis 6/85.
Для контаминации крови применяли взвесь грибных клеток В. dermatitidis 6/85 в дрожжевой форме. Установлено, что праймеры Ву8-1К.-Ву8-1Б и ВБа§8-1Б - ВБа§8-2Я способны детектировать ДНК возбудителя бластомикоза в крови в концентрации 1-104 кл/мл.
Для определения диагностической эффективности исследуемых праймеров была проверена возможность их использования для выявления ДНК B.dermatitidis в пробах с биологическим материалом от 8 зараженных животных при экспериментальном бластомико-зе. Исследовали кровь и внутренние органы (печень, селезенку, легкие) белых мышей на 14 сутки после заражения, т.к. манифестация заболевания у инфицированных начинается, в среднем, от двух недель. При исследовании методом ПЦР в режиме реального времени ДНК В. dermatitidis обнаружили в 4 пробах от 3 животных, у одного из них в пробах суспензии печени и крови, у другого - в 1 пробе печени и у третьего - в 1 пробе селезенки. При сравнении с результатами микологического посева культура В. dermatitidis выделена в 5 пробах. При этом в двух образцах (суспензии печени и селезенки) результаты совпадали с ПЦР. Полученные дискордантные результаты, вероятно, связаны с низкой концентрацией возбудителя и пределом чувствительности ПЦР. При проведении микологического посева во всех пробах рост наблюдали только спустя 14 дней, что в условиях клинической лаборатории удлиняет срок постановки диагноза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования методом ПЦР в режиме реального времени проб чистых культур музейных штаммов, проб контаминированных клетками возбудителя бластомикоза, а также результаты анализа
проб от зараженных мышей показана потенциальная возможность использования выбранных экспериментальных праймеров для создания набора реагентов для обнаружения возбудителя бластомикоза.
Применение сконструированного набора реаген-
тов для индикации возбудителя бластомикоза клинико-диагностическими лабораториями, позволит повысить качество диагностики и сократить время постановки диагноза.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Dworkin M.S., Duckro A.N., Proia L., et al. The epidemiology of blastomycosis in Illinois and factors associated with death// Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41. - P.107-111.
2. Bradsher R.W., Chapman S.W., Pappas P.G. Blastomycosis// Infect. Dis. Clin. North Am. - 2003. - Vol. 17. - P. 21-40.
3. Baumgardner D.J., Steber D., Glazier R., et al. Geographic information system analysis of blastomycosis in northern Wisconsin, USA: waterways and soil// Med. Mycol. - 2005. - Vol. 43. - P. 117-125.
4. Baumgardner D.J., Knavel E.M., Steber D., et al. Geographic distribution of human blastomycosis cases in Milwaukee, Wisconsin, USA: association with urban watersheds// Mycopathologia. - 2006. - Vol. 161. - P. 275-282.
5. Smith J.A., Kaufman C.A. Blastomycosis// Proc. Am. Thorac. Soc. - 2010. - Vol. 7, №3. - P. 173-180.
6. Alvarez G.G., Burns B.F., Desjardins M., et al. Blastomycosis in a young African man presenting with a pleural effusion// Can. Respir. J. - 2006. - Vol. 13, №8. - P. 441-444.
7. Arnett M.V., Fraser S.L., Grbach V.X. Pulmonary blastomycosis diagnosed in Hawaii// Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 2008. - Vol. 39, №4. - P. 701-705.
8. Smith J.A., Kaufman C.A. Blastomycosis// Proc. Am. Thorac. Soc. - 2010. - Vol. 7, №3. - P. 173-180.
9. Маркин A.M., Гришина M.A., Кочубеева E.H. Эпидемиология бластомикоза и паракокцидиоидомикоза // Проблемы особо опасных инфекций. - 2014. - №3. - С. 34-37.
10. Антонов В.А., Липницкий А.В., Лесовой B.C. и др. Особо опасные микозы /Под ред. В. В. Малеева. - Волгоград: изд. Волга-Паблишер, 2013. - 193 с.
11. Bialek R., Gonzalez G.M., Begerow D., et al. Coccidioidomycosis and blastomycosis: advances in molecular diagnosis// FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2005. - Vol. 45. - P. 355-360.
12. Sestero С.М., Scalarone G.M. Detection of the surface antigens BAD1 and a-(l,3)-glucan in six different strains of Blastomyces dermatitidis using monoclonal antibodies// J. Biology. - 2007. - Vol. 1, №1.
13. Гришина M.A., Кочубеева E.H., Вьючнова H.B. и др. Лабораторная диагностика кокцидиоидомикоза // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - №1. - С. 70-76.
14. Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Антонов В.А. и др. Идентификация возбудителей кокцидиоидомикоза методом полиме-разной цепной реакции// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - №4. - С. 25-31.
15. Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А. и др. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, №2. - С. 58-62.
16. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.3118-13 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патоген-ности (опасности) // Бюллетень нормативных и методических документов. Госсанэпиднадзор России. - М., 2013. - С. 196.
17. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп па-тогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней // Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2009.
18. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
19. http://www.broadinstitute.org/
Поступила в редакцию журнала 22.06.2015
Рецензент: Н.П. Елинов
