CC BY
29УДК 616.992.28
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ПЦР ДЛЯ
УСКОРЕННОЙ
ИДЕНТИФИКАЦИИ
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ОСОБО ОПАСНЫХ
МИКОЗОВ
Антонов В.А., Ткаченко Г.А.,
Гришина М.А., Савченко С.С.,
Лесовой B.C., Замараев B.C.,
Липницкий A.B., Алексеев В.В.
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, Россия
В данной работе изучена возможность использования раз-личных праймеров для идентификации Coccidioides immitis, His-toplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis. Специфичность праймеров показана в реакции амплификации с ДНК различных гетерологичных микроорганизмов. С помощью сконструированных амплификационных тест-систем можно выявлять возбудителей особо опасных микозов при анализе проб от экспериментально зараженных животных. По сравнению с обычными методами ПЦР позволяет провести более быструю идентификацию и уменьшает риск внутрилаборатор-ного заражения персонала.
Ключевые слова: ДНК, идентификация, праймеры, ПЦР, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis
THE PCR USE FOR THE RAPID IDENTIFICATION OF PATHOGENS OF DANGEROUS MYCOSES
Antonov V. A., Tkachenko G.A.,
Grishina M.A., mSavchenko S.S.,
Lesovoy V.S., ZamarayevV.S.,
Lipnitsky A.V., Alekseev V.V.
Research Institute of Plague Control, Volgograd, Russia
A possibility of use of different primers for the identification of Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis has been studied. Primers specifity has been shown in the reaction of amplification with DNA of various microorganisms. The exciters of dangerous mycoses can be revealed by means of constructed amplification test-system at the analysis of samples from the experimentally infected animals. N comparison with usual methods
a PCR procedure allows more rapid identification at reduced risk for infection of laboratory personnel.
Key words: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, DNA, identification, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, primers
ВВЕДЕНИЕ
Особо опасные глубокие микозы, к которым относят кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, бластомикоз и паракокцидиоидомикоз, регистрируют во многих странах мира. Однако истинное число людей, инфицированных во всем мире первичными грибными патогенами — Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, не известно. С одной стороны, это связано с трудностью и длительностью культуральных методов диагностики, а с другой — отсутствием простых серологических тестов для быстрой лабораторной идентификации грибов. Общим для данных микозов является их диморфный характер - способность существовать в мицелиальной (сапробной) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) или дрожжеподобной - в организме человека и животных. Эуот диморфизм и определяет сложности диагностики системных микозов.
На сегодняшний день признают, что глубокие микозы имеют ограниченный ареал распространения. Так, С. immitis - возбудитель кокцидиоидомикоза обитает в почвах юго-западной части США, в Мексике и других странах Центральной и Южной Америки [1,2]. Известно, что источником инфекции является почва, из которой артроспоры гриба ингаляционно попадают в организм. В отдельных эндемических районах США до 60% населения заражены кокциди-оидомикозом, причем у многих из них были те или иные проявления инфекции. При диссеминированных и хронических прогрессирующих формах прогноз серьезный, и летальность остается высокой [3].
Н. capsulatum - возбудитель гистоплазмоза распространен по всему миру. Высокоэндемичные очаги гистоплазмоза расположены вдоль реки Миссисипи (США). Н. capsulatum var. duboisii встречается в Африке [4, 5]. Повсеместное распространение гистоплазмоза в мире служит поводом для предположения о том, что наличие гриба в южных районах России возможно (например, в Краснодарском и Ставропольском краях, Астраханской области, Калмыкии) и в странах СНГ (Армении, Азербайджане, Грузии). Однако ни достоверных находок гриба, ни местных случаев гистоплазмоза среди людей, подтвержденных выделением культуры микромицета, в этих странах до сих пор не зафиксировано. Инфицирование людей данным возбудителем происходит воздушно-пылевым путем. Однако, кроме ингаляционного способа заражения, гриб способен проникать через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Случаев заражения человека от больных людей и животных не наблюдали.
Возбудитель бластомикоза (В. dermatitidis) выяв-
ляют в почвенных микроочагах многих стран мира, но чаще бластомикоз наблюдали в США. Спорадические случаи болезни регистрировали в Канаде, Австралии, Индии, Франции, Италии, Венгрии [6], Уровень заболеваемости бластомикозом в мире, по-видимому, ниже, чем гистоплазмозом и кокциди-оидомикозом. Но, по сравнению с ними, отмечают более высокую пропорцию клинически выраженных случаев болезни, что является свидетельством высокой патогенности гриба. При диссеминированных формах без лечения погибают почти все больные.
Р. ЬгсшИепй^ - возбудитель паракокцидиоидомикоза, в основном, обнаруживают в сельских районах стран Южной Америки. Заболевание характеризуется гранулематозными очагами на коже и слизис тых оболочках полости рта и носа. Поражаются лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт и легкие. Генерализованная форма проявляется поражениями желудочно-кишечного тракта, гепато- и спленомега-лией, асцитом. В 80% поражаются легкие в области средостения, у корней легких. Поражения костей обнаруживают в 25% случаев. Прогноз тяжелый, часто - летальный.
Возросший интерес к данным инфекциям в настоящее время обусловлен возможностью использования возбудителей особо опасных микозов в качестве потенциальных агентов биотерроризма. Необходимо отметить, что до сегодняшнего дня надежных вакцин от патогенных микозов не найдено.
В России до сих пор не было зарегистрировано ни одного случая особо опасных микозов. Можно предположить, что причина заключается в малой осведомленности работников здравоохранения в отношении этих микозов и, как следствие, отсутствие лабораторных исследований, направленных на выявление данных возбудителей у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных стран тропического и субтропического регионов. Кроме того, имеется вероятность заноса данных инфекций на территорию России с инфицированными животными, а также с экзотическими растениями и продуктами растениеводства, импортируемыми из этих стран.
Изменение климатических условий и формирование очагов различных инфекций в неэндемичных для них регионах диктуют необходимость более пристального внимания и к возбудителям особо опасных микозов. Б.Г. Вальковым еще в 1970 г. [7] были проведены исследования, показавшие высокую чувствительность при экспериментальном заражении С. ттШз ряда диких грызунов, обитающих в степных районах бывшего Советского Союза.
Выраженный полиморфизм клинических проявлений и разнообразный характер течения системных микозов, практически исключают возможность постановки диагноза на основании клинической картины. В связи с этим на первый план должна быть поставлена лабораторная верификация возбудителей особо опасных микозов. Существующие методы идентификации данных возбудителей оказываются
недостаточно эффективными. Микробиологический метод, основанный на выявлении диморфизма грибов, длителен и трудоемок при исполнении [8]. Иммунологические методы - сравнительно быстрые по исполнению, но обладают относительно низкой чувствительностью и невысокой специфичностью из-за возможных перекрестных реакций с гетероло-гичными видами грибов [9-11]. Учитывая, что эти возбудители относятся к агентам II группы патогенности, работа в ними строго регламентирована Санитарными правилами (СП 1.3.1285-03), и манипуляции с данными возбудителями разрешены только в специализированных учреждениях [12].
В качестве альтернативных способов выявления данных патогенов в последнее время все более активно используют молекулярно-генетические методы идентификации. Одним из таких методических приемов является ДНК-зондирование [10,13]. Однако метод генодиагностики, основанный на реакции ДНК-ДНК гибридизации, имеет ряд недостатков и ограничений [14]. Другое направление связано с развитием полимеразной цепной реакции. Метод ПЦР более чувствителен и специфичен при выявлении ДНК первичных грибных патогенов [15-21]. Но для возбудителей особо опасных микозов до сих пор нет общепризнанных ДНК-мишеней, на основе которых конструировали бы амплификационные тест-системы. Отечественные ПЦР-тест-системы для идентификации патогенов находятся в стадии разработок.
Цель данной работы заключалась в проведении сравнительного анализа методов пробоподготовки, выделения и очистки ДНК, а также получения различных праймеров для идентификации возбудителей глубоких микозов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили 23 штамма С. immitis, 20 штаммов H.capsulatum, 2 штамма Н. duboisii, 10 штаммов В. dermatitidis и 3 штамма P. brasiliensis.
Для определения специфичности праймеров в качестве гетерологичных микроорганизмов (по отношению к возбудителям глубоких микозов) использовали по 2 штамма Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Sacharomyces cerevisiae, Mucor sp. и Aspergillus sp., а также по 1 штамму Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis и Escherichia coli. Исследуемые штаммы микроорганизмов представлены коллекционным центром Волгоградского научноисследовательского противочумного института.
Культивирование штаммов возбудителей особо опасных микозов проводили на агарах Сабуро и Френсиса, а для других микроорганизмов использовали общепринятые для соответствующих видов питательные среды.
При подготовке проб для ПЦР дрожжевые формы исследуемых грибов, выросших на плотных питатель-
ных средах, суспендировали в 0,85% растворе ЫаС1. В одном случае, после обеззараживания 1% формалином, подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Другую часть использовали для выделения ДНК. Параллельно, по отраслевому стандартному образцу мутности, суспензии грибов разводили таким образом, чтобы их концентрации составляли от 1-107до МО1 кл/мл. Одновременно из каждого разведения высевали по ОД мл на чашки с агаром Сабуро и по числу выросших колоний определяли концентрацию клеток (КОЕ). При работе С мицелиальной формой грибов концентрацию определяли по отраслевому стандарту мутности.
Для выделения и очистки ДНК использовали различные методические подходы. В пробирки с взвесями грибов добавляли натрия мертиолат до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Взвеси прогревали при температуре 56±1 °С в течение 30 мин. По 1 мл из всех разведений переносили в микропробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мкл стерильной, деионизированной воды. В одном случае осадок прогревали при 100 °С и после центрифугирования отбирали по 10 мкл для проведения ПЦР. В других случаях ДНК выделяли из клеток грибов различными методами: после обработки клеток соком виноградных улиток [22], нуклеосорбцией в присутствии гуанидинтиоцианата [23], фенол-хлоро-формной депротеинизацией [24], лизиса с помощью 808 и протеиназы [19, 20, 24], а также методом, предложенным СЬотсгушИ и БассЫ [25] в собственных модификациях.
Бульонные культуры обеззараживали добавлением натрия мертиолата до конечной концентрации
0,1 мг/мл. Пробы прогревали при 56±1 °С в течение 40 мин и по 1 мл переносили в микроцентрифужные пробирки. Клетки осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин, удаляли надса-дочную жидкость, а осадок суспендировали в 1 мл дистиллированной воды. Суспензию клеток кипятили в течение 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин. Для проведения ПЦР использовали 10 мкл супернатанта.
Кроме того, для проведения ПЦР использовали супернатан после автоклавирования культур. С этой целью суспензии грибов (после автоклавирования) центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин и отбирали по 10 мкл надсадочной жидкости на реакцию амплификации.
Анализ проб на стерильность проводили как после обеззараживания натрия мертиолата, так и автоклавирования.
Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в НПФ «ДНК-технология» (Москва). Амплификацию проводили а объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл) на мультициклере «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) с использованием «горячего старта». Реакционная смесь содержала: исследуемую ДНК, специфические олигонуклеотид-
ные праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимеразу. На поверхность смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской ферментов ДНК этидиумом бромидом и визуализацией в УФ-свете [24]. Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждали ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам.
Заражение лабораторных животных (белые мыши и морские свинки) проводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Одновременно из каждого разведения, использованного для заражения, производили высев по 0,1 мл на чашки с агаром Сабуро и по числу выросших колоний подтверждали величину заражающей дозы. В различные сроки (в зависимости от вида гриба) биопробных животных убивали, вскрывали и отбирали для исследований по 30-50 мг кусочков внутренних органов и 0,1-1 мл крови. Кровь обеззараживали добавлением натрия мертиолата до конечной концентрации 0,1 мг/мл, а к кусочкам органов добавляли 300 мкл 0,1% раствора натрия мертиолата, прогревали при 56±1 °С в течение 40 мин и оставляли на сутки. После этого ДНК грибов выделяли вышеописанными способами. Наличие возбудителей параллельно определяли культуральным методом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для детекции H. capsulatum использовали олигонуклеотидные затравки, сконструированные на основе гена 18S рРНК и гена, кодирующего 100 kDa белок [18]. Для идентификации C. immitis были апробированы праймеры, являющиеся ферментами гена Csa-протеиназы [15], а для В. dermatitidis - праймеры, специфичные для гена WI-1 адгезина [19]. Анализ праймеров и последовательностей ДНК-мише-ней проводили с помощью компьютерных программ Oligo 4,0, gene Runner 3,0, BLAST.
На первом этапе работы предварительно был апробирован метод обеззараживания грибных взвесей с помощью натрия мертиолата. Способ обеззараживания чистых культур и проб секционного материала описан в разделе «Материалы и методы»,
В результате исследований была показана эффективность использования 1-0,01% раствора (конечная концентрация) натрия мертиолата не только для обеззараживания взвесей чистых культур грибов, но и суспензий органов экспериментально зараженных животных. Использование данного препарата для проведения пробоподготовки, с одной стороны, обеспечивало безопасность дальнейшей работы с обеззараженным материалом при проведении ПЦР, а с другой - сохраняло целостность клеток грибов, снижая на этом этапе возможность деградации ДНК.
Одним из главных условий адекватного проведения ПЦР является получение ДНК в достаточно чистом виде - без примесей, ингибирующих реакцию. Использование множества методов экстракции и выделения ДНК обусловлено как видом возбудителя, так и природой изучаемых проб и образцов. При работе с чистыми культурами всех исследуемых грибов наиболее эффективным оказался метод температурного лизиса клеток. Для выделения и очистки ДНК методы с использованием протеиназы К, фенол-хлороформной депротеинизации, также как и гуанидинтиоцианата, были более трудоемки. Однако для анализа суспензий органов наибольшая эффективность экстракции и очистки ДНК отмечена при использовании метода, предложенного Chomczynski и Sacchi [25]. В остальных случаях высокая концентрация эукариотической ДНК и наличие различных примесей приводили или к ингибированию ПЦР, или к появлению «шмеров» на электрофореграммах.
На следующем этапе исследований в реакции амплификации анализировали ДНК, выделенную из грибных взвесей с различной концентрацией клеток. Для всех исследуемых праймеров были отработаны условия реакции и оптимизированы параметры «nesled»-11ЦР для олигонуклеотидных затравок, фланкирующих фрагменты генов 18S рРНК, 100 kDa белка и WI-1 адгезина. Проведен анализ различных буферных систем, концентраций праймеров, дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов и магния хлорида, а также отработано несколько температурных режимов отжига праймеров. В результате исследований специфические фрагменты амплификации были выявлены как в одностадийной ПЦР для всех штаммов C. immitis, так и nested-ПЦР для H. capsulatum и В. dermatitidis. Причем, во всех случаях амплифици-руемые фрагменты ДНК соответствовали размерам, полученным с помощью компьютерного анализа (Рис. 1). *
Чувствительность всех исследуемых праймеров составила 1*102-1-10 клеток/мл. Для определения специфичности праймеров использовали чистые препараты ДНК изучаемых грибов и различных ге-терологичных микроорганизмов. В результате проведенных исследований показано, что при анализе праймеров, сконструированных для идентификации H. capsulatum на основе гена 18S рРНК, специфические фрагменты амплификации, наряду с H. capsulatum и H. duboisii, выявлялись и при анализе некоторых штаммов В. dermatitidis и Р. brasiliensis, что свидетельствовало о недостаточной специфичности изучаемых олигонуклеотидов. При исследовании других гетерологичных микроорганизмов искомых фрагментов ДНК не было обнаружено (Рис 2.).
При использовании «nesled»-11ЦР с помощью праймеров, полученных на основе гена, кодирующего WI-1 адгезии В. dermatitidis, специфический фрагмент амплификации был выявлен и при анализе ДНК Р. brasiliensis. Этим подтверждаем наличие нуклеотидных последовательностей данного гена у
Р. brasiliensis (Рис.З).
Видоспецифические фрагменты ДНК в реакции амплификации были получены при идентификации H. capsulatum с помощью праймеров, фланкирующих участки гена 100 kDa белка //. capsulatum. В «nested»-ПЦР специфические ампликоны выявлены при анализе штаммов H. capsulatum и H. duboisii. Полученный результат является доказательством наличия гена 100 kDa белка в геноме И. duboisii и, учитывая высокую таксономическую близость данных патогенных грибов, он вполне объясним (Рис. 4),
При использовании праймеров, специфичных для csa гена C. immitis, кодирующего белок в 19 kDa, в реакции амплификации детектировались лишь штаммы C. immitis, а с гетерологичными микроорганизмами, включая возбудителей особо опасных микозов, получены отрицательные результаты амплификации (Рис. 5).
Для определения диагностической информативности исследуемых праймеров была изучена возможность их использования для выявления C. immitis и
H. capsulatum при работе с материалом, полученным от зараженных данными возбудителями животных. Исследовали кровь и внутренние органы (печень, селезенку, легкие) на 7, 10 и 14 сутки после заражения для C. immitis и 45 сут - для H. capsulatum. В результате исследований ДНК возбудителей обнаружена в пробах суспензий печени, селезенки, легких, что указывало на развитие генерализованного процесса заболевания у животных. В 50% случаев ДНК была обнаружена в крови. Выделение возбудителей во всех исследуемых пробах было подтверждено культуральным методом.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о принципиальной возможности использования как данных праймеров для ускоренной идентификации первичных грибных патогенов, так и методов экстракции и очистки ДНК для проведения реакции амплификации. Причем, используемый набор олигонуклеотидных затравок обеспечивает возможность детектировать все виды возбудителей особо опасных микозов, а использование метода кипячения при выделении ДНК значительно сокращает время проведения ПЦР. Известно, что ПЦР является лишь одним из методов лабораторной диагностики, и для установления окончательного диагноза необходим комплексный подход с обязательным клинико-эпидемиологическим анализом. Однако при подозрении на применение изучаемых возбудителей микозов в качестве агентов биотерроризма результаты ПЦР будут являться доминирующими и определяющими для проведения противоэпидемических мероприятий. Выделение данных возбудителей из организма больного и, тем более, из крови - достаточно сложная задача. Учитывая положительные результаты ПЦР при анализе крови больных животных, кроме вышесказанного, можно сделать заключение о преимуществе и достоинстве данного методического подхода для диагностики особо опасных микозов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pappagianis D. Epidemiology of coccidioidomycosis Ч ли г. Тор. Med. Mycol.-1988.-№2.-P.199-238.
2. Saubolle M.A. Life cycle and epidemiology of Coccidioides immitis I In: H.E, Einstein and A. Catanzaro (ed.), Coccidioidomycosis. National Foundation for Infectious Diseases, Washington, I).(1996.
3. Arsura E., Caldwell J., Johnson R. et all. Coccidioidomycosis epidemic of 1991: epi-demiologic features //H. E, Einstein, and A. Catanzaro (ed.), Coccidioidomycosis. National Foundation for Infectious Diseases, Washington, D.C., 1996.
4. Ajello L. Histoplasmosis—a dual entity: histoplasmosis capsulati and histoplasmosis duboisii // Ig. Mod.- 1983,.? №79.? P.3-30.
6. Rippon J. W. Medical mycology. W. B. Saunders Company, Philadelphia, Pa., 1988.
6. Gueho E., Leclerc М.С., Hoog G.S., Dupont B. Molecular taxonomy and epidemiology of Blastomyces and Histoplasma species //Mycoses.- 1997.- №40.- P.69-81.
7. Вальков Б. Г. В кн.: Материалы Всесоювн. совещания по вопросам глубоких микозов. -Волгоград, 1970.- С 42.
8. Kwon-Chung К. /., Bennett J.E. 1992. Medical mycology. Lea and Febiger, Phil. London, 1992.
9. Pappagiannis D., Zimmer B.L. Serology of coccidioidomycosis // Clin.Microbiol.-1990.-Vol.3.-P. 247-268.
10. Stockman L., Clark K.A., Hunt J.M., Roberts G.D. Evaluation of commercially available acridinium ester-labeled chemilumineseent DNA probes for culture identification of Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum II J. Clin. Microbiol.- 1993.- Vol.31- P.845-850.
11. Reed J. A., Hemann B.A., Alexander J.L., Brigati D.J. Immunomycology: rapid and specific immunocytochemical identification of fungi in formalin-fixed, paraffin-embedded material//J. Histochem. Cytochem.-1993,- Vol. 41.- P. 12171221.
12. СП L3.128S-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила.- М., 2003.
13ч Hayden R. Т., Qian X., Roberts G.D., Lloyd R.V. In situ hybridization for the identification of yeastlike organisms in tissue section // Diagn. Mol. Pathol.- 2001.- №10.-P. 15-23.
14. Sandin R.L., Hall G.S., Longwortli D.L., Washington A.J. Unpredictability of commercially available exoantigen culture confirmation test in confirming the identity of five Blastomyces dermatitidis isolates // Am. J. Clin. Pathol.- 1993.? Vol.99.-P.542-545.
15:. Pan S., Cole G.T. Molecular and Biochemical Characterization of a Coccidioides /wira/ft's-Specific Antigen//Infect. Immun.-1995,- Vol63, № 10.-P.3994-4002.
16. Reid Т. М., Schafer M.P. Direct detection of Histoplasma capsulatum in soil suspensions by two-stage PCR // Mol. Cell. Probes.- 1999,- №13,- P.269-273.
17. Bialek R., Fischer J., Feucht A., et al. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39.- P.1506-1509.
18. Bialek R., Feucht A., Aepinus C., et al. Evaluation of two nested PCR assays for the detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40.- P.1644-1647.
19. Bialek R., Cirera A.C., Herrmann T. et al. Nested PCR Assays for Detection of Blastomyces dermatitidis DNA in Paraffin-Embedded Canine Tissue// J. Clin. Microbiol.-2003,? Vol.41, №1. - P.205-208.
20. Bracca A., Tosello M.E., Girardini J.E. et al. Molecular detection of Histoplsasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples ff J.Clin. Microbiol.- 2003.-Vol.41, №4, P. 17.':-!-17.":".
21. Guedes H. L. M., Guimaraes A.J., Muniz M-M. et al. PCR assay for Identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen // J. Clin. Microbiol.- 2003, Vol.41, №2.- P. 535-539.
22. Шелохович А.И., Черченко И.И., Бондарев И.Н. и др. Методические рекомендации по получению из виноградных улиток препарата, лизирующего клеточную стенку дрожжей и грибов.- Волгоград, 1984.- 9 с.
23. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. // J.Clin. Microbiol.- 1990.- Vol.28, №3.-R495-503.
24. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual second edition. P.M.- Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
25:. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.- 1987.- Vol.162., №1.-P.156-159.
Поступила в редакцию журнала 24.02.05
Рецензент: Нарекая О.В.
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Злектрофореграмма ПЦР с использованием различных пар праймеров
1—маркер размеров фрагментов ДНК (pUC19, гидролизованная эндонуклеазой Hpall)
2—внешние праймеры, сконструированные на основе гена, кодирующего 100 kDa белок H. capsulatum
3—внутренние праймеры, сконструированные на основе гена, кодирующего 100 kDa белок H. capsulatum
4—внешние праймеры, полученные на основе гена 18S РНК Л, capsulatum
5—внутренние праймеры, полученные на основе гена 18S РНК H. capsulatum
6—праймеры, фланкирующие фрагмент csa гена C. immitis
7 —внешние праймеры, специфичные для гена WI-1 адгезина В. dermatitidis 8—внутренние праймеры, специфичные для гена W'I-1 адгезина В. dermatitidis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
'-------------------------------_______________________________________'
А Б
Рис. 2. Злектрофореграмма «гнездовой» ПЦР при использовании олигонуклеотидных затравок, фланкирующих фрагмент гена 18S РНК Я. capsulatum
А — «внешняя» пара праймеров Б — «внутренняя» пара праймеров
/. H. capsulatum 12. H. capsulatum
2. H. duboisii 13. H. duboisii
3. В. dermatitidis 14. В. dermatitidis
4. P. brasiliensis 15. Р. brasiliensis
5. C. immitis 16. C. immitis
6. C. neoformans 17. C. neoformans
7. S. cerevisiae 18. S. cerevisiae
8. C. albicans 19. C. albicans
9. Mucor sp. 20. Mucor sp.
10. Aspergillus sp. 21. Aspergillus sp.
11. Маркер размеров 22. Маркер размеров
363 п.п.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
266 п.п.
TT“
Рис. 3. Электрофореграмма «гнездовой» ПЦР при использовании олигонуклеотидных затравок, фланкирующих фрагмент гена \XT-1 адгезина В. с1егта1ШсИя
А — «внешняя» пара праймеров Б — «внутренняя» пара праймеров
/. H. capsulatum 11. H. capsulatum
2. H. duboisii 12. H. duboisii
3. В. dermatitidis 13. В. dermatitidis
4. P. brasiliensis 14. Р. brasiliensis
5. C. immitis 15. C. immitis
6. C. neoformans 16. C. neoformans
7. S. cerevisiae 17. S. cerevisiae
8. C. albicans 18. C. albicans
9. Mucor sp. 19. Mucor sp.
10. Aspergillus sp. 20. Aspergillus sp.
11. Маркер размеров 21. Маркер размеров
123456789 10 1112 13 14 15 16 17 18 1920 2122
щ mm "9®* :л -t
Штт
391 п.п.
210 п.п.
Рис. 4. ^Электрофореграмма «гнездовой» ПЦР при использовании олигонуклеотидных затравок, фланкирующих фрагмент гена 100 kDa белка Н, capsulatum
А — «внешняя» пара праймеров Б — «внутренняя» пара праймеров
1. H. capsulatum 11. H. capsulatum
2. H. duboisii 12. H. duboisii
3. В. dermatitidis 13. В. dermatitidis
4. Р. brasiliensis 14. Р. brasiliensis
5. C. immitis 15. C. immitis
6. C. neoformans 16. C. neoformans
7. S. cerevisiae 17. S. cerevisiae
8. C. albicans 18. C. albicans
9. Mucor sp. 19. Mucor sp.
10. Aspergillus sp. 20. Aspergillus sp.
11. Маркер размеров 21. Маркер размеров
1234 5678 9 10 И
Рис. 5» Электрофореграмма ПЦР с использованием олигонуклеотидных затравок, являющихся фрагментами гена, кодирующего 19 k Da Csa-протеиназу C. immitis
А - «внешняя» пара праймеров
1. H. capsulatum
2. H. duboisii
3. В. dermatitidis
4. P. brasiliensis
5. C. immitis
6. C. neoformans
Б — «внутренняя» пара праймеров
7. S. cerevisiae
8. C. albicans
9. Mucor sp.
10. Aspergillus sp.
11. Маркер размеров
