CC BY
16УДК 616-002.828:579.61:616-078
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO КОКЦИДИОИДОМИКОЗА И ГИСТОПЛАЗМОЗА: РАЗРАБОТКА, ИСПЫТАНИЕ, ГОСУДАРСТВЕННАЯ РЕГИСТРАЦИЯ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ
Прохватилова Е.В. (доцент, зав. отделом)*, Новицкая И.В. (доцент, зав. отделом), Кулаков М.Я. (с.н.с.), Савина Е.В. (н.с.), Пушкарь В.Г. (с.н.с.), Белицкая Л.И. (н.с.), Плеханова Н.Г. (зав. лаб.), Викторов Д.В. (доцент, зам. директора по научно-экспериментальной работе), Топорков А.В. (директор института)
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Волгоград, Россия
©Коллектив авторов, 2017
Разработан набор реагентов для клинической диагностики in vitro кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), проведены испытания, завершены этапы экспертизы и регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения как медицинских изделий. Оценена эффективность применения набора реагентов для обнаружения антигенов возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза в биологическом (клиническом) материале и выделенных культурах микромицетов методом РНГА. Критериями диагностической ценности набора реагентов являлись показатели чувствительности, специфичности (аналитической и диагностической). При проведении клинических испытаний установлено, что показатель диагностической чувствительности набора реагентов для выявления возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза методом РНГА составил не менее 99%, диагностической специфичности - не менее 98%, с доверительной вероятностью 90% при анализе каждого из показателей.
Ключевые слова: кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, иммунологические методы, набор реагентов, реакция непрямой гемагглюти-нации
REAGENT KIT FOR IN VITRO DIAGNOSTIC OF COCCIDIOIDOMYCOSIS AND HISTOPLASMOSIS: DEVELOPMENT, TESTING, STATE REGISTRATION, THE USE OF LABORATORY PRACTICE
Prokhvatilova E.V. (associate professor, head of the department), Novitskaya I.V. (associate professor, head of the department), Kulakov M.Ya. (senior scientific collaborator), Savina E.V. (scientific collaborator), Pushkar V.G. (senior scientific collaborator) , Belitskaya L.I. (scientific collaborator), Plekhanova N.G. (head of the laboratory),
Контактное лицо: Прохватилова Елена Валерьевна, e-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Viktorov D.V. (associate professor, deputy director of scientific and experimental programs), Toporkov A.V. (director of the institute)
Volgograd Plague Control Research Institute, Volgograd, Russia
©Collective of authors, 2017
The reagent kit for the clinical in vitro diagnostics of coccidioidomycosis and histoplasmosis using the reaction of indirect hemagglutination (IHA) has been constructed, tested and registrated in the Federal Service for Supervision in the sphere of health care as a medical devices. The effectiveness of application of the reagent kit for the detection of antigens of coccidioidomycosis and histoplasmosis agents in a biological (clinical) material and isolated cultures of micromycetes by the reaction of indirect hemagglutination have been evaluated. The criteria of the diagnostic value of the reagent kits were the sensitivity and specificity (analytical and diagnostic). When conducting clinical tests it has been determined that the rate of diagnostic sensitivity of the reagent kit for the detection of coccidioidomycosis and histoplasmosis agents by the reaction of indirect hemagglutination is not less than 99%, the diagnostic specificity - not less than 98%, with a confidence level of 90% in the analysis of each of the indicators.
Key words: coccidioidomycosis, histoplasmosis, immunological methods, reaction of indirect hemagglutination, reagents kit
ВВЕДЕНИЕ
Кокцидиоидомикоз и гистоплазмоз относят к особо опасным (глубоким) микозам, мало известным работникам здравоохранения нашей страны, поскольку достоверных случаев заболеваний, вызываемых данными возбудителями, в Российской Федерации не зарегистрировано. Эндемичными регионами данных микотических инфекций являются страны Северной, Южной, Центральной Америки, Юго-Восточной Азии и Африки, где инфицированность населения очень высокая [1]. Наибольшему риску инфицирования и развития различных форм гистоплазмоза и кокциди-оидомикоза подвержены лица, посещавшие эндемичные регионы, а также ВИЧ-инфицированные больные, пациенты, перенесшие операции по трансплантации органов, проходящие иммуносупрессивную терапию и другие иммунокомпрометированные лица [1-3].
Учитывая интенсивное развитие туристических, миграционных, торговых, транспортных связей между странами, весьма вероятна возможность завоза кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза на территорию Российской Федерации [2]. В связи с этим, с целью обеспечения готовности медицинских учреждений к проведению исследований по лабораторной диагностике особо опасных микозов необходимо внедрение в практику здравоохранения новых эффективных диагностических средств для обнаружения данных возбудителей [4].
Возбудители кокцидиоидомикоза и гистоплаз-моза - это диморфные грибы родов Coccidioides spp., Histoplasma spp. II группы патогенности (опасности). Общим для них является то, что они вызывают инфекции, относящиеся к категории «респираторных», т.е. основной путь инфицирования - аэрогенный [1, 2]. В настоящее время грибы рода Coccidioides разделены на два вида - Coccidioides immitis и Сoccidioides posadasii и включены в перечень потенциальных агентов биотерроризма в связи с высокой опасностью ингаляторного заражения человека артроспорами гриба, высокой устойчивостью артроконидий Coccidioides к факторам окружающей среды, сложностью терапии, диагностики и отсутствием средств специфической профилактики кокцидиоидомикоза [Онищенко Г.Г. и др. Лаборатор-
ная диагностика опасных инфекционных болезней. М., 2013]. Род Histoplasma включает 3 варианта: Histoplasma capsulatum var. capsulatum, Histoplasma capsulatum var. duboisii, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, отличающиеся преимущественно по географическому распространению и молекулярно-генетическим характеристикам возбудителя [1, 2].
При культивировании возбудители кокцидиоидо-микоза и гистоплазмоза в условиях роста на стандартных питательных средах (Сабуро, Чапека) развиваются в виде мицелиальной формы, а в организме человека и некоторых животных гриб конверсирует в тканевую форму, представленную сферулами Coccidioides sp. или дрожжеподобными клетками Histoplasma sp. [1, 2, 5, 6]. Реализация патогенных свойств диморфных грибов связана, прежде всего, с возможностью существовать внутри макроорганизма в виде паразитической (тканевой) формы [1, 5, 6]. Организм человека не обладает естественным иммунитетом к данным микромице-там, поэтому восприимчивость человека к ним считают всеобщей. Клиническая картина гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза имеет схожий между собой комплекс симптомов и синдромов, как правило, неспецифичный. Спектр клинических проявлений кок-цидиоидомикоза и гистоплазмоза широко варьирует от бессимптомной инфекции до форм заболеваний с первичным поражением дыхательной системы, а при диссеминированной форме - с вовлечением в инфекционный процесс разнообразных органов и систем и формированием очагов инфекции, что, в значительной мере, затрудняет их клиническую и дифференциальную диагностику [1].
В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем, 2003 г. (МКБ-10), кокцидиоидомикоз отнесен к разделу В38, который включает нозологические формы легочного микоза (острый, хронический), дис-семинированную, а также кожную и менингеальную. В отличие от кокцидиоидомикоза, гистоплазмоз помещен в отдельный раздел В39 (острая, хроническая легочная инфекция, диссеминированный гистоплазмоз, гистоплазмоз неуточненный, ВИЧ-ассоциированные инфекции и др.).
В Российской Федерации для осуществления эпидемиологического надзора за опасными инфекционными болезнями, в перечень которых входят гистоплазмоз и кокцидиоидомикоз, действует приказ Роспотребнад-зора №88 от 17.03.2008 г. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней». В соответствии с данным приказом были созданы национальные, региональные и референс-центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней с функциями и деятельностью, определенными требованиями международных медико-санитарных правил 2005 года. На базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора» функционирует референс-центр по мониторингу за возбудителями глубоких микозов (далее - референс-центр), который оказывает научную, консультативно-методическую и практическую помощь учреждениям Роспо-требнадзора и медицинским организациям.
Совершенствование методов диагностики особо опасных (глубоких) микозов является одним из важ-
ных направлений деятельности референс-центра, в задачи которого входит проведение научно-исследовательских работ по изучению структуры и биологических свойств микромицетов и разработке диагностических и индикационных наборов реагентов, обеспечивающих с высокой чувствительностью и специфичностью выявление возбудителей особо опасных микозов [2].
Цель настоящего исследования - разработка, испытание и внедрение в практику клинических лабораторий новых наборов реагентов для диагностики гисто-плазмоза и кокцидиоидомикоза с помощью РНГА.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали «Набор реагентов. Диа-гностикум эритроцитарный кокцидиоидомикозный и гистоплазмозный иммуноглобулиновый сухой». В состав медицинского изделия (МИ) входят следующие компоненты:
1. Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидо-микозный и гистоплазмозный иммуноглобулиновый сухой 10% - 5 ампул.
2. Взвесь инактивированной культуры возбудителя кокцидиоидомикоза 1-109 кл/мл - 1 ампула.
3. Эритроциты барана формалинизированные 50% - 2 ампулы.
4. Сыворотка кокцидиоидомикозная агглютинирующая козья сухая 1:10 - 1 ампула.
5. Сыворотка нормальная кроличья сухая - 1 ампула.
Область применения МИ - клиническая лабораторная диагностика, эпидемиологический мониторинг. «Набор реагентов. Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидомикозный и гистоплазмозный иммуно-глобулиновый сухой» (далее - «диагностикум») предназначен для обнаружения антигенов возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза в биологическом материале и выделенных культурах микромицетов методом РНГА.
Исследуемые культуры получали из лаборатории коллекционных штаммов микроорганизмов ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора».
Для постановки РНГА с диагностикумом использовали: 26 штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides sp. (8 штаммов С. posadasii и 18 штаммов C. immitis), 18 штаммов H. capsulatum, 4 штамма H. capsulatum var. duboisii, 1 штамм H. capsulatum var. farciminosum, 5 штаммов H. capsulatum в дрожжевой фазе роста, 5 штаммов дрожжеподоб-ных грибов (Candida guillermondii, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans 4N, Cryptococcus neoformans 9/22, Rhodotorula mucilaginosa), 17 штаммов плесневых грибов и дерматомицетов III-IV групп патоген-ности (Absidia (Mycocladus) hyalospora, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium sambucinum, Gibberella zeae, Geotrichum candidum, Malbranchea manginii, Paecilomyces variottii, Penicillium citreoviridae, Penicillium citrinum, Penicillium chrysogenum, Phialophora verrucosa, Rhizopus microsporus, Scopulariopsis brevicaulis, Trichophyton crateriforme), 1 штамм Brucella suis, 2 штамма Yersinia sp. (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis), 2 штамма Burkholderia pseudomallei, 2 штамма Burkholderia mallei.
При исследовании культур методом РНГА обеззараженные взвеси возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза разводили с помощью 0,9% стерильного раствора натрия хлорида, рН (7,2±0,2) до концентрации 1-108 кл/мл, взвеси гетерологичных микроорганизмов - до 4-108 кл/мл (в соответствии с отраслевым стандартом мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России), а затем применяли для постановки РНГА.
Имитацию проб клинического материала (сыворотки крови, мокроты, промывных вод бронхов), а также биологического материала (суспензии органов: легкие, печень и селезенка) мелких млекопитающих осуществляли путем их контаминирования суспензиями C. immitis, C. posadasii, H. capsulatum и гетероло-гичными микроорганизмами (Penicillium citreoviridae, Burkholderia mallei) с концентрацией 3,12-106 кл/мл и 5-107 кл/мл соответственно.
Подготовка проб клинического и биологического материала.
Пробы сыворотки крови человека отбирали по 0,9 мл в 7 центрифужных пробирок, в каждую из которых добавляли 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии P citreoviridae 51 с концентрацией 5-108 кл/мл соответственно. В подготовленные пробы добавляли мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (10 мкл 1%-го раствора мертиолята натрия на 1 мл сыворотки) и прогревали на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Затем пробы сывороток адсорбировали добавлением 50%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана (0,1 мл взвеси эритроцитов на 1 мл сыворотки крови) с инкубацией в течение 30 мин при температуре (37±1) °С. Эритроциты осаждали центрифугированием в режиме 2500-3000 об/мин - 5 мин. Полученную инак-тивированную и адсорбированную сыворотку разводили 1:5 с помощью 0,15 М раствора хлорида натрия (к 1,0 мл сыворотки добавляют 4 мл 0,15 М раствора хлорида натрия), после чего исследовали в РНГА.
Пробы мокроты. Мокроту забирали в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные стерильные пробирки с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Для разжижения мокроты применяли раствор «Муколизин» (Na2HPO4 0,0774 моль, NaH2PO4 0,0226 моль, бета-МЭ 0,094 моль, 5% азид натрия в конечной концентрации 0,05%). Пробу смешивали с пятикратным объемом раствора «Муколизин» (ООО «ИнтерЛабСервис). Пробы перемешивали покачиванием в течение 20-30 сек и инкубировали в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем отбирали по 0,9 мл разжиженной мокроты и помещали в 7 центрифужных пробирок, в каждую из которых добавляли 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum
6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 3,12-107 кл/ мл, 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии P citreoviridae 51 с концентрацией 5-108 кл/мл соответственно. Пробы центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мкл 0,15 М раствора натрия хлорида и исследовали в РНГА.
Пробы промывных вод бронхов. Полученные при бронхоскопии пробы лаважной жидкости переносили по 0,9 мл в 7 центрифужных пробирок, в каждую из которых добавляли 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 3,12-107 кл/ мл, 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии P citreoviridae 51 с концентрацией 5-108 кл/мл соответственно. Пробы центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мкл 0,15 М раствора натрия хлорида и исследовали в РНГА.
Суспензии органов. Кусочки печени и селезенки общей массой 1-2 г помещали в 3 стерильные ступки, растирали и добавляли 0,15 М раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирали по 0,9 мл с помощью пипетки через ватный тампон в 7 центрифужных пробирок, в каждую из которых добавляли 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 3,12-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 3,12-107 кл/ мл, 0,1 мл клеточной суспензии C. posadasii 36 S с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии C. immitis 158 с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл бактериальной суспензии H. capsulatum 6650 в дрожжевой фазе с концентрацией 6,25-107 кл/мл, 0,1 мл суспензии P citreoviridae 51 с концентрацией 5-108 кл/мл соответственно. Для исследования пробы дополнительно разводили 0,15 М раствором натрия хлорида с 4% формалина из соотношения 1:50 с последующей экспозицией в течение 24 ч при комнатной температуре или в течение 2 ч при (37±1) °C. После обеззараживания пробы адсорбировали добавлением 50% взвеси фор-малинизированных эритроцитов из расчета 0,1 мл на 1 мл пробы, инкубировали смесь 30 мин при (37±1) оС или 1-2 ч при (22±2) оС. Эритроциты осаждали центрифугированием в режиме 2500-3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость исследовали в РНГА.
В РНГА также исследовали образцы сывороток, суспензии органов (легкие, печень, селезенка) лабораторных животных, используемых в качестве биомоделей экспериментального кокцидиоидомикоза и ги-стопплазмоза. Заражение белых мышей линии BALB/c осуществляли клетками возбудителей особо опасных микозов в доз(ах) 5(10) LD50.
Подготовка проб зараженных экспериментально животных.
Пробы сыворотки крови. Сыворотку крови после образования сгустка отбирали пастеровской пипеткой в отдельную пробирку, консервировали добавлением мертиолята натрия в конечной концентрации 1:10000 (10 мкл 1%-ного раствора мертиолята натрия на 1 мл сыворотки) и прогревали на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Затем пробы сывороток адсорбировали добавлением 50%-ной взвеси формалинизирован-ных эритроцитов барана (0,1 мл взвеси эритроцитов на 1 мл сыворотки крови) с инкубацией в течение 30 мин при температуре (37±1) °С. Эритроциты осаждали центрифугированием в режиме 2500-3000 об/мин - 5 мин. Полученную инактивированную и адсорбированную сыворотку разводили 1:5 с помощью 0,15 М раствора хлорида натрия (к 1,0 мл сыворотки добавляли 4 мл 0,15 М раствора хлорида натрия), после чего исследовали в РНГА.
Суспензии органов от зараженных экспериментально животных. Кусочки печени и селезенки общей массой 1-2 г помещали в 3 стерильные ступки, растирали и добавляли 0,15 М раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирали через ватный тампон в отдельные пробирки по 0,9 мл.
Для исследования пробы дополнительно разводили в соотношении 1:50 0,15 М раствором натрия хлорида, содержащим 4% формалина, с последующей экспозицией в течение 24 ч при комнатной температуре или в течение 2 ч при (37±1) °C. После обеззараживания пробы адсорбировали добавлением 50% взвеси фор-малинизированных эритроцитов из расчета 0,1 мл на 1 мл пробы, инкубировали смесь 30 мин при (37±1) оС или 1-2 ч при (22±2) оС. Эритроциты осаждали центрифугированием в режиме 2500-3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость исследовали в РНГА.
Каждый образец исследуемой пробы был объемом не менее 0,5 мл. Все пробы до постановки опыта хранили при температуре минус 18 °С, во время опыта -при плюс 4 °С, но не более 3 суток. Все пробы одновременно исследовали методом РНГА с применением испытуемых наборов реагентов и микологическим методом. Обеззараживание проб проводили в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций».
Проведение РНГА. Постановку РНГА (в микро-или макроварианте) осуществляли в лунках микро-или макропланшета по 0,025 (0,05 мл) соответственно по стандартной методике. Результаты учитывали через 2-3 ч и окончательно - на следующие сутки. Для подтверждения специфичности РНГА использовали реакцию ее торможения (РТНГА).
Проведение исследований микологическим методом. Культивирование H. capsulatum, C. immitis, C. posadasii и других микромицетов выполняли в пробирках на плотной питательной среде Сабуро, содержащей 5% левомицетина (рН 6,8±0,2), и инкубировали при температуре (28±1) оС в течение 30-45 суток. Конверсию H. capsulatum в тканевую фазу осуществляли на питательной среде, предложенной Френсисом: мя-со-пептонном агаре, содержащем 5% цистеина и 5% дефибринированной крови, в течение 7 - 14 суток при
37 оС. Учет и интерпретацию результатов анализа при микологическом исследовании проводили визуально по появлению роста микромицетов.
Бактериальные культуры 11-1У групп патогенности рассевали на чашки Петри с агаром Хоттингера рН (7,2±0,1) и инкубировали в течение 24-48 ч при температуре (37+1) оС, после чего смывали и инактиви-ровали в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш-1У групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций».
Результаты клинических испытаний статистически обрабатывали в соответствии с «Методическими рекомендациями по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий», 2013 г. Статистическую достоверность полученных результатов испытаний оценивали в зависимости от числа параллельных опытов при доверительной вероятности 90%, используя формулу биноминального распределения Бернулли.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ввиду полиморфизма клинических проявлений в диагностике кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза лабораторным методам исследования отводят основную роль [1, 2]. Выделение культур Coccidioides зрр. и Histoplasma зрр. микологическим методом или гистологическая идентификация микромицетов в тканях являются традиционными, однако данные методы длительны и инвазивны, и для их постановки, в среднем, требуется 1-3 недели. Наиболее доступные для своевременной диагностики и определения тактики лечения больного кокцидиоидомикозом и гистоплаз-мозом - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и экспрессные иммунологические методы, предназначенные для обнаружения циркулирующих и клеточных антигенов в различных пробах клинического материала (кровь, моча, мокрота и др.) [2, 4]. Определение антигена в клинических образцах, в том числе с помощью РНГА, чаще всего проводят при диссеми-нированных формах, в остром периоде развития ми-котических инфекций, а также на этапе индикации и идентификации выделенных культур [4].
Поскольку Coccidioides зрр. и Histoplasma зрр. имеют близкое генетическое родство, обеспечивающее экспрессию антигенных комплексов, включающих множество общих детерминант, специалисты рефе-ренс-центра разработали группоспецифический набор реагентов для одномоментного выявления комплексного общего антигена возбудителей кокцидиоидоми-коза, гистоплазмоза с помощью РНГА [7]. Кроме того, при разработке диагностикума учитывали то, что оба патогенных биологических агента (Coccidioides зрр., Histoplasma зрр.) являются возбудителями особо опасных (глубоких) микозов, в ряде случаев, в условиях чрезвычайных ситуаций для их индикации и идентификации предпочтительно использование группоспе-цифического иммунодиагностического препарата [7].
Согласно конструкторской документации, диа-гностикум предназначен для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза в выделенных культурах микромицетов, а также в пробах биологического материала (сыворотка крови, мокрота,
промывные воды бронхов, суспензии органов - легкие, печень, селезенка). В микроварианте РНГА с использованием данного набора реагентов показатель аналитической чувствительности для возбудителей кокци-диоидомикоза и гистоплазмоза составил 3,12-106 кл/ мл, в макроварианте РНГА - 1,56-106 кл/мл. При определении показателя аналитической специфичности установлено, что диагностикум не должен выявлять в РНГА гетерологичные микромицеты в концентрации 5-107 кл/мл.
Для подтверждения нормированных технических характеристик медицинских изделий (спецификации) и согласования нормативно-эксплуатационных документов в 2013 году проведены технические испытания МИ испытательной лабораторией на базе кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России (Москва). В результате были согласованы вид, класс потенциального риска применения МИ в соответствии с их номенклатурной классификацией. В ходе испытаний выполнен анализ и доработка технической и эксплуатационной документации, оценка и анализ данных, относящихся к МИ, для проверки безопасности и оформлен акт технических испытаний. Полученные результаты эксперты оценили как положительные и подтвердили качество и безопасность применения диагностического набора реагентов. Установлено, что набор реагентов может быть использован для проведения клинической диагностики гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза.
В 2015 году «Набор реагентов. Диагностикум эри-троцитарный кокцидиоидомикозный и гистоплазмоз-ный иммуноглобулиновый сухой» был представлен к государственной регистрации Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения в качестве медицинского изделия. В соответствии с Правилами государственной регистрации медицинских изделий, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416, регистрацию МИ осуществляли на основании результатов технических и клинических испытаний, а также данных экспертизы представленных документов.
При проведении клинических испытаний с целью контроля чувствительности при анализе 264 проб (216 проб суспензий микромицетов и 48 проб биологического и клинического материала), содержащих возбудители кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, в концентрации 3,12-106 кл/мл в микроварианте РНГА получен положительный результат в 100% случаев, в концентрации 1,56-106 кл/мл в макроварианте РНГА - положительный результат в 100% случаев. Внутри-постановочную и межсерийную воспроизводимость оценивали в 2 повторах и на 2 сериях диагностикума. Результаты испытаний по оценке показателя чувствительности диагностикума представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Результаты исследований в РНГА чувствительности «Набора реагентов. Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидозный и гистоплазмозный иммуноглобулиновый сухой»
Наименование проб Число проб Положи результа Серия 98/15 гельный т в РНГА Серия 99/15
Положительные пробы, содержащие суспензии С. immitis, С. posadasii, Н. capsulatum в концентрациях 3,12Ю6 кл/мл, 1.56-106 кл/мл 108 108 (100%) 108 (100%)
Положительные пробы биологического (клинического) материала, содержащие C.immitis, С. posadasii, Н. capsulatum в концентрациях 3.12-106 кл/мл, 1.56-106 кл/мл 12 12 (100%) 12 (100%)
Положительные пробы биологического материала, содержащих С. immitis, С. posadasii, Н. capsulatum, полученного от экспериментальных лабораторных животных 12 12 (100%) 12 (100%)
Итого положительных проб, содержащих C.immitis, С. posadasii, Н. capsulatum 132 132 (100%) 132 (100%)
Примечание: «*» - образцы анализировали в 2 повторах; «**» - использовали микро- и макроварианты РНГА; «***» -результаты РНГА подтверждены микологическим методом выделения культур.
При проведении клинических испытаний с целью контроля показателя специфичности при анализе 128 проб, содержащих гетерологичные микроорганизмы, имеющих схожую морфологию клеток тканевой фазы, отрицательный результат получен в 100% случаев (табл. 2).
Таблица 2.
Результаты исследований в РНГА специфичности «Набора реагентов. Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидозный и гистоплазмозный иммуноглобулиновый сухой».
Наименование проб Число Отрицательный результат в РНГА
проб Серия 98/15 Серия 99/15
Пробы, содержащие суспензии гетерологичных микроорганизмов в концентрации неменеебЮ7 кл/мл (С. guillermondii, С. parapsilosis, С. neoformans 4N, С. neoformans 9/22, R. mucilaginosa, A. hyalospora, А. flavus, A. fumigatus, F. avenaceum, F. culmorum, F. sambucinum, G. zeae, G. candidum, M. manginii, P. variottii, P. citreoviridae, R citrinum, P.chrysogenum, P. verrucosa, R. microsporus, S. brevicaulis, T crateriforme, B. suis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, B. pseudomallei, B. mallei) 56 56 (100%) 55 (98,2%)
Пробы клинического материала, содержащие Р. citreoviridae в концентрации 3,12-106 кл/мл 4 4 (100%) 4 (100%)
Пробы биологического материала, содержащие Р. citreoviridae, полученного от экспериментальных лабораторных животных 4 4 (100%) 4 (100%)
Итого отрицательных проб 64 64 (100%) 63 (98,2%)
Примечание: «*» - образцы анализировали в 2 повторах.
«**» - использовали микро- и макроварианты РНГА; «***» -результаты РНГА подтверждены микологическим методом выделения культур
При проведении клинических испытаний доказана
эффективность применения набора реагентов: диагностическая чувствительность - не менее 99% с доверительной вероятностью 90%; диагностическая специфичность - не менее 98% с доверительной вероятностью 90%. Внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для положительных образцов составила 100%. В качестве контрольного использовали микологический метод.
Поскольку аналогов вышеназванным наборам реагентов, зарегистрированным на территории Российской Федерации, не существует, испытания проводили без использования препарата для сравнения.
После завершения регламентированной процедуры государственной регистрации Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения в 2016 г. принято решение о регистрации МИ, оформлено регистрационное удостоверение и разрешены производство, реализация и применение МИ в медицинской лабораторной практике.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработка и внедрение в практику здравоохранения новых диагностических и индикационных наборов реагентов, обеспечивающих с высокой чувстви-
тельностью и специфичностью выявление возбудителей особо опасных микозов в выделенных культурах и клиническом (биологическом) материале, развитие научно-производственной деятельности, ориентированной на выпуск эффективных и надежных диагностических наборов отечественного производства, а также своевременное информирование специалистов медицинских организаций о новых зарегистрированных микологических наборах, являются важными направлениями деятельности референс-центра по мониторингу за возбудителями глубоких микозов на базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора».
В настоящее время набор реагентов для экспресс-диагностики гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза с помощью РНГА выпускается на производственной базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора». В РНГА с использованием данного набора реагентов предварительный результат может быть получен через 2-3 ч от начала исследования, что особенно важно при верификации диагноза и определении тактики ведения больного на этапах клинической диагностики кокци-диоидомикоза и гистоплазмоза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов В.А., Липницкий А.В., Гришина М.А. и др. Особо опасные микозы. Под ред. академика РАМН В.В. Малеева. Волгоград: Волга-Паблишер, 2013:193 с. [Antonov V.A., Lipnitskiy A.V., Grishina M.A. i dr. Osobo opasnyie mikozyi. Pod red. akademika RAMN V.V. Maleeva. Volgograd: Volga-Pablisher, 2013:193 s. (In Russ)]
2. Попова А.Ю., Топорков А.В., Липницкий А.В. и др. Распространение в мире особо опасных микозов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 3: 120-6. [Popova A.Yu., Toporkov A.V., Lipnitskiy A.V. i dr. Rasprostranenie v mire osobo opasnyih mikozov. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2016; 3: 120-6. (In Russ)]
3. Ampel N.M. Coccidioidomycosis in persons infected with HIV-1. Ann. N-Y Acad. Sci. 2007; 1111: 336-342.
4. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. и др. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. Практическое руководство. 2-е изд. М.: ЗАО «Шико», 2013: 560 с. [Onischenko G.G., Kutyirev V.V. i dr. Laboratornaya diagnostika opasnyih infektsionnyih bolezney. Pod red. akad. RAMN G.G. Onischenko. Prakticheskoe rukovodstvo. 2-e izd. M.: ZAO «Shiko», 2013: 560 s. (In Russ)]
5. Di Caudo D. J. Coccidioidomycosis: a review and update. J. Am. Acad. Dermatol. 2006; 55 (6): 929-942.
6. Kaufman CA. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20 (1):115-132.
7. Kuberski T., Myers R., Wheat L.J., et al. Diagnosis of coccidioidomycosis by antigen detection using cross-reaction with a Histoplasma antigen. Clin. Infect. Dis. 2007; 44 (5): 50-54.
Поступила в редакцию журнала 10.06.2017
Рецензент: С.М. Игнатьева
