CC BY
311
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №4,2015
удк 615.074 Денисова Е. В. [Denisov E.V.],
Андрусенко С. Ф. [Andrusenko S. F.J, Брыцина И. Е. [Bryksiria I. Е.], Супрунчук В. Е. [Suprunchuk V. Е,]
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭТИЛОВОГО СПИРТА И СУРРОГАТОВ АЛКОГОЛЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБАХ
Comparative analysis of methods
for the detection of ethyl alcohol and alcohol
substitutes in biological samples
В статье рассмотрены вопросы оптимизации методов определения уровня концентрации этанола и его суррогатов в сочетании с отдельными биохимическими показателями, необходимые для диагностики алкогольной интоксикации в таких биологических пробах, как кровь, моча, ткани мозга, легкие, печень, почки, мышцы, слюна с помощью биохимических, хроматографических, спектрофотометрических методов анализа. Установлено, что наиболее близко к концентрации алкоголя в крови приближается его концентрация в слюнных железах, легких, почках и яичках.
Ключевые слова: этанол, суррогаты алкоголя, оптимизация методов контроля в биологических объектах.
In the article the questions of optimization methods to determine concentrations of ethanol and its surrogates in combination with selected biochemical variables required for the diagnosis of alcohol intoxication in such biological samples as blood, urine, brain tissue, lungs, liver, kidneys, muscles, saliva, by using biochemical, chromatographic, spectrophotometric methods of analysis. Found that the most close to the concentration of alcohol in the blood is approaching its concentration in the salivary glands, lungs, kidneys and testes.
Keywords: ethanol, the alcohol surrogate, optimization of control methods In biological objects.
Алкоголь наносит значительный ущерб здоровью людей.
Злоупотребление им приводит к поражению различных систем организма, способствует развитию заболеваний, отягощает их течение, а среди смертельных отравлений острая алкогольная интоксикация занимает ведущее место. Кроме того, существуют случаи приема суррогатов алкоголя и технических жидкостей внутрь по ошибке или преднамеренно, нередко с целью опьянения.
К спиртам и жидкостям на основе спиртов, помимо гликолей (двухатомных), относятся: метанол, тетрагидрофурфуриловый спирт (ТГФ), тормозная жидкость БСК, противооткатная жидкость «Стеол-М». Токсичность жидкостей на основе спиртов обусловлена наличием в их составе тетрогидрофурфурилового, бутилового спиртов. В состав жидкости «Сте-ол-М» входит калий хромовокислый. Жидкости на основе спиртов могут приниматься внутрь с целью опьянения и вызывать тяжелые отравления. Наиболее часто встречаются и тяжело протекают острые отравления эти-ленгликолем и его производными, хлорированными углеводородами, метиловым спиртом, средними и высшими спиртами [3, 13].
Жидкости, изготовленные на основе гликолей и их производных, обладают характерным алкогольным запахом и сладковатым вкусом и могут быть приняты за спиртные напитки. При нарушении техники безопасности и при приеме их внутрь они вызывают тяжелые отравления и даже смерть [12].
Самым распространенным вариантом суррогатного алкоголизма является самогонный. Самогон является высокотоксичным продуктом, который вызывает стойкие необратимые изменения во всем организме. Наиболее вредное действие на человеческий организм оказывает сивушное масло, которое является побочным продуктом спиртового брожения. Выделенное из спирта, оно действительно представляет собой маслянистую жидкость различного цвета (от светло-желтого до буро-красного) с резким неприятным запахом. Сивушное масло содержит различные ядовитые примеси: изопропиловый алкоголь, ацетальдегид, уксусно-этиловый эфир, пропиловый алкогольацетил, ацетил, амиловый алкоголь, изобути-ловый алкоголь, пиридин, бутиловый алкоголь, масляно-этиловый эфир, фурфурол [11].
Судебно-медицинская экспертная оценка острых алкогольных интоксикаций затруднена в связи с недостаточностью объективных критериев, характеризующих индивидуальную толерантность к этанолу. В качестве основного критерия диагностики острого смертельного отравления этанолом предлагается использовать показатели концентрации этилового
алкоголя в крови и моче. Количество поступившего извне алкоголя, от чего зависит концентрация его в крови, само по себе не может точно отражать степень токсического влияния без учета ответной реакции самого организма, следовательно, для экспертной оценки влияния алкогольной интоксикации на наступление смерти только определения концентрации этанола в крови и моче трупа недостаточно. Для подтверждения диагноза острого алкогольного отравления рекомендуется также учитывать некоторые морфофункциональные изменения во внутренних органах и тканях. Для этих целей рекомендуется использовать отдельные виды биохимических исследований, например: показатели сахара в крови, гликогена в печени и других органах [8].
Разработка набора критериев морфофункциональных изменений с учетом уровня концентрации этанола в крови и в отдельных органах в сочетании с отдельными биохимическими показателями, которые в комплексной оценке приобретают специфический характер для диагностики алкогольной интоксикации является одной из актуальных проблем судебной медицины. В зависимости от того, насколько быстро и правильно будет оказана медицинская помощь, зависит исход отравления. Современной целенаправленной и энергичной терапией можно спасти человека даже при отравлениях большими дозами ядов, и, наоборот, запоздалая или неправильная терапия даже при менее тяжелых интоксикациях может оказаться безуспешной. В связи с этим целью исследования являлась оптимизация методов контроля этилового спирта и суррогатов алкоголя в биологических объектах [1].
Наиболее важными объектами исследования для судебно-химичес-кой экспертизы служат кровь, моча, реже - ткани мозга, легких, печени, почек, редко - глубокие мышцы бедра. Желудок не может быть взят в качестве объекта исследования, так как возможно образование спирта естественным путем при брожении углеводов или гнилостных процессах его содержимого [5].
Методами изолирования суррогатов алкоголя из биоматериала являются: перегонка с водяным паром, микроперегонка, микродиффузия. Ко-
личественное определение этилового спирта производится несколькими методами: а) этилнитритным; б) методом Видмарка в модификации Шой-моша; в) фотометрическим; г) биохимическим; д) хроматографическим [3, 4, 9, 10].
При проведении исследования учитывалось, что этанол может образовываться не только при гнилостных разложениях тканей трупа, что приводит к увеличению его концентрации до 2,4 г/л, но и при хранении исследуемых проб, особенно проб мочи. Концентрация этанола в ней может возрастать от 2 до 4,5 г/л за счет его образования из глюкозы, а также под воздействием ферментов некоторых микроорганизмов при комнатной температуре Для устранения этанолпродуцирующего действия микроорганизмов пробы мочи стабилизировали 1 %-ным раствором КаР [2].
После сравнительного анализа методов извлечения суррогатов алкоголя использовали дистилляцию с водяным паром, а при исследовании биообъектов на наличие в них этиленгликоля применяли специальную методику, так как из биологического материала перегонкой с водяным паром извлекается незначительное количество этиленгликоля [7].
Так как этиленгликоль в организме человека быстро мстаболизиру-ется при проведении исследования методом тонкослойной хроматографии на пластинку наносили и некоторые его метаболиты. Тонкослойную хроматографию проводили в различных камерах: хлороформ-этанол 4:1; эфир-этанол 1:1; ацетон; бензол-этанол-ацетон 7:2: 13, после пропускания пластинок в соответствующих камерах и просушивания при комнатной температуре до полного испарения органических растворителей их опрыскивали последовательно 0,05% раствором перйодата калия и раствором бензидина солянокислого. В результате проведенного исследования определи, что выше всего этиленгликоль поднимается от линии старта в камере эфир-этанол 1 : 1, а ниже всего в камере насыщенной системой бензол-этанол-ацетон (табл. 1).
Со всеми образцами, в которых в результате качественных методов исследования был обнаружен этиленгликоль, проводили количественное
Таблица 1. Результаты тонкослойной хроматографии
Исследуемый образец Значение
Система растворителей
хлороформ -этанол 4 :1 ацетон эфир-этанол 1 : 1 бензол - этанол -ацетон 7 :2 :13
Извлечение из внутренних органов 0,67 0,58 0,69 0,50
Этиленгликоль 0,67 0,59 0,69 0,60
Щавелевая кислота 0,17 - 0,13 -
Диэтиленгликоль 0,44 - - 0,57
Глицерин 0,55 - 0,60 -
Антифризная жидкость 0,57 0,65 - -
исследование, в результате которого получены следующие результаты: этиленгликоль содержится в моче в 8-10 раз, в поджелудочной железе в 5-9 раз, в крови в 3-4 раза, в печени и почках в 1,5-2 раза больше, чем в легких и мозге.
Определение чистых «летучих» веществ, а также биологических объектов взятых после отравления техническими жидкостями исследовали газохроматографи-ческим и спектрофотометрическим методами.
Спектрофотометрическое исследование проводили на спектрофотометре СФ-56, в интервале длин волн от 220-300 нм. Идентифицировали пики поглощения в УФ-области: толуол - 259 нм; этиленгликоль - 255 нм; тосол - 265 нм и 273 нм; растворитель - 261 нм и 268 нм. После исследования контрольных образцов, исследовали извлечения из биологических объектов.
Слюну исследовали методом газовой хроматографии. Исследование проводили на газовом хроматографе с ДИП. Для повышения надежности и улучшения метрологических параметров использовали автоматические пробоотборники равновесной паровой фазы. При этом происходит нагрев виалы с пробкой до 60-80 °С. Новым подходом явилось применение анализа равновесной паровой фазы при комнатной температуре с использованием стандартного автоинжектора, снабженного газоплотным шприцом. Для улучшения надежности идентифицировать по времени удерживания применили метод Фиксации Времени Удерживания. Методом газовой хроматографии определили времена выхода «летучих» веществ: эфир - 29 секунд; гексан - 37 секунд; ацетон - 54 секунды; гептан - 1 минута 22 секунды; хлороформ - 2 минуты 20 секунд; бензол - 2 минуты 18 секунд; четырех-хлористый углерод - 2 минуты 47 секунд; дихлорэтан - 3 минуты 19 секунд: толуол - 5 минут 37 секунд; этилацетат (два пика) - 29 секунд и 1 минута 35 секунд. Сопоставив времена выхода исследуемых «летучих» веществ методом газовой хроматографии, определили, что для получения достоверного результата при введении в хроматограф биологической пробы время выхода всех исследуемых отравляющих компонентов составляет 6 минут.
Описанными методами проводились исследования на определение этилового спирта в различных органах и биологических жидкостях.
При постмортальном перераспределении в периферических венах обнаруживают меньшие концентрации этанола по сравнению с центральными венами, при этом диапазон концентраций, выявленных в одном и том же трупе, может быть очень большим - от 1,8 до 4,28 г/л. После проведения исследований различных органов и биологических жидкостей был установлен диапазон концентраций (табл. 2).
Таблица 2. Диапазон концентраций этилового спирта
в различных органах и биологических жидкостях
Кровь, г/л Головной Спинно- Печень, Почки, Моча,
МОЗГ, мозговая г/на 100 г г/на 100 г г/л
г/на 100 г жидкость, органа органа
органа г/л
0,74 0,44 0,58 0,45 0,48 0,62
(0,42-1,77) (0,31-0,91) (0,40-0,82) (0,25-2,16) (0,29-1,04) (0,49-0,94)
Проводились сравнительные исследования концентрации этилового алкоголя в крови, в отдельных органах и тканях. В каждом случае брались на исследование навески органов и тканей по 0,5 г, из которых готовился гомогенат. Определяя фотометрическим методом концентрацию алкоголя в крови и других объектах, выражали соотношение концентрации алкоголя в отдельных объектах и крови числовым коэффициентом.
Таким образом, в ходе работы был проведен сравнительный анализ методов количественного определения этилового спирта и суррогатов алкоголя в биологических пробах и установлено, что наиболее близко к концентрации алкоголя в крови приближается концентрация его в слюнных железах, легких, почках и яичках. Наибольший индивидуальный разброс наблюдается в соотношениях «печень / кровь», что может быть объяснено посмертным разрушением алкоголя в печени алко-гольдегидрогеназой.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ
список
1. Андрусенко С. Ф., Денисова Е. В., Брыцина И. Е. Оптимизация методов контроля алкоголя в биологических пробах // Материалы Всероссийской научной Интернет-конференции с международным участием «Фармакологическая наука - от теории к практике». Казань: Сервис виртуальных конференций Pax Grid, 2014. С. 12-15.
2. Афанасьев В. В., РубительЛ. Г., Афанасьев А. В. Острая интоксикация этиловым алкоголем. Оперативное руководство. СПб.: Интермедика, 2002.
3. Бережной В. В. Судебно-медицинская экспертиза отравлений техническими жидкостями. М.: Медицина, 1988.
4. Бережной Р. В. Руководство по судебно-медицинской экспертизе отравлений / Р. В. Бережной, Я. С. Смусин, В. В. Томилин, П. П. Ширинской. М.: Медицина, 1980.
5. Виноградов И. В., Гуреев А. С. Лабораторные исследования в практике судебно-медицинской экспертизы. М.: Медицина, 1986.
6. Крохин И. П., Малкова Т. Л. Идентификация спиртсодержащих жидкостей методом ПЖХ // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований. М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава». 2007. С. 236-238.
7. Лабораторные и специальные методы исследования в судебной медицине: руководство / под ред. В. И. Пашковой, В. В. Та-милина. М.: Медицина, 1985.
8. Лужников Е. А. Клиническая токсикология: учебное пособие. М.: Медицина, 1982.
9. Методические указания о судебно-медицинской диагностике смертельных отравлений этиловым алкоголем и допускаемых при этом ошибках. М., 1974.
10. Новиков П. И. Экспертиза алкогольной интоксикации на трупе. М.: Медицина, 1967.
11. Острые отравления этанолом и его суррогатами / под общ. ред. проф. Ю. Ю. Бонитенко. СПб.: ЭЛБИ, 2005.
12. Резников А. Б., Кисель А. А., Шилова А. П. Материалы по клинике отравлений антифризом. М., 1984.
13. Рожков В. М. Патология, клиника и терапия отравлений техническими жидкостями (метиловый спирт, антифриз и тетраэтил-свинец). Л., 1989.
