CC BY
85
■ МЕТОДИКИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СПИРТОВ И ТОКСИЧЕСКИХ ВЕШЕСТВВБИОЖИПКОСТЯХ
Е. В. Степанов, В. А. Степанов • Бюро судебно-медицинской экспертизы Республики Марий Эл (нач. - А. Ш. Невмятулин)
• Аннотация: Судебно-химическое отделение ГБУ РМЭ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» является экспериментальной базой
в Российской Федерации по внедрению новых хроматографических аппаратно-программных комплексов и технологий, разрабатываемых ЗАО СКБ «Хроматэк» (г. Йошкар-Ола), в практику судебно-химических экспертиз, химико-токсикологических исследований для бюро СМЭ, наркодиспансеров, УВД, МВД, ФСБ, ФСКН, МО, центров санэпиднадзора.
• Ключевые слова: аппаратно-программный комплекс, хроматограф, алкилнитритный метод анализа, парофазный анализ
В докладе изложены методики, разработанные судеб-но-химическим отделением Бюро СМЭ Республики Марий Эл на базе аппаратно-программных комплексов серии «Хроматэк-Кристалл».
1. Обнаружение и количественное определение спиртов (С1-С5) алкилнитритным методом на приборе с ДТП/ ДТП.
2. Обнаружение и количественное определение летучих токсических веществ методом парофазного анализа на приборе с ПИД/ПИД/ПИД.
Методики аттестованы Центром «Сертимет» УрО РАН (г. Екатеринбург) и зарегистрированы в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений.
Отличительной особенностью первой методики является возможность одновременного определения этилового и метилового спиртов алкилнитритным методом в одной пробе биологической жидкости.
Подавляющее количество определений алифатических спиртов в биологических жидкостях выполняется с применением газового хроматографа и вводом образцов методом равновесной паровой фазы. Для реализации этого метода в СКБ «Хроматэк» был разработан шприцевой дозатор равновесного пара.
Вторая методика позволяет проводить одновременное определение растворителей и спиртов на трех колонках с двумя испарителями и тремя детекторами без перекоммутации газовых схем в ручном режиме или с использованием автоматического ЭБ-дозатора, разработанного в СКБ «Хроматэк».
Судебно-химическая экспертиза биологических проб на наличие растворителей производится на детекторах ПИД1-ПИД2, судебно-химическая экспертиза биологических проб на наличие алкоголя и его суррогатов - на детекторе ПИДЭ.
Расчет массовой концентрации летучих токсических веществ (ацетона, метанола, этанола и др.) в обеих методиках проводится автоматически по соответствующему градуировочному графику, построенному с помощью «Программы сбора и обработки хроматографической информации «Хроматэк Аналитик"».
ВЫВОДЫ
Методика обнаружения и количественного определения спиртов алкилнитритным методом позволяет:
• идентифицировать до 8 спиртов;
• измерять концентрацию спиртов (этанола, метанола) в диапазоне от 0,2 до 6 %% в биологических жидкостях.
Данная методика позволяет получить:
• предел повторяемости - 9,7 %;
• предел воспроизводимости - 11 %.
Методика обнаружения и количественного определения летучих токсических веществ парофазным методом позволяет:
• определить растворители, являющиеся причиной отравлений, и исключить их применение;
• идентифицировать до 10 алифатических спиртов и измерять их концентрации в биологических жидкостях и тканях.
Данная методика позволяет получить:
• предел повторяемости - 13 % как для спиртов, так и для ацетона;
• предел воспроизводимости - 16 % для спиртов и 13 % для ацетона.
К ВОПРОСУ О СОХРАНЯЕМОСТИ ЭТАНОЛА В ПРОБАХ КРОВИ
к.фарм.н. Т. В. Горбачева, к.б.н. Е. С. Бушуев • Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Бюро судебно-медицинской экспертизы» (нач. - д.м.н. И. Е. Лобан)
• Аннотация: Материал посвящен вопросу сохраняемости и новообразования этанола
в пробах постмортальной крови при длительном хранении. Проведен анализ литературных данных и представлены результаты собственных исследований.
• Ключевые слова: постмортальная кровь, этанол, сохраняемость
ВВЕДЕНИЕ
Вопрос сохраняемости токсикологически значимых веществ в пробах биологических объектов является одним из самых сложных при интерпретации результатов судебно-химических или химико-токсикологических исследований. Согласно Приказе МЗиСР от 12.05.2010 № 346 «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях РФ», биологические объекты, доставленные для проведения судебно-химического исследования, хранятся в течение года после окончания исследования. Теоретически в течение данного периода возможно назначение повторного исследования, как с целью подтверждения результата, так и с целью определения других ксенобиотиков. Наиболее сложными случаями являются повторные исследования с целью определения этанола. В практике работы нашего отделения был случай повторного анализа образца крови с целью количественного определения этанола после 11 месяцев хранения. В доступной литературе практически отсутствовали данные по сохраняемости этанола при столь длительных сроках хранения, что и послужило поводом для данной работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы постмортальной крови (102 образца) и мочи (21 образец) после первичного анализа хранились в полиэтиленовых флаконах, емкостью 50 мл, плотно закрытых навинчивающейся крышкой в условиях морозильной камеры. Определение концентрации этанола проводили согласно «Методике выполнения измерений массовой концентрации этанола в крови, моче и слюне», Москва,
2012 год. Анализы проводили при поступлении объектов в отделение и через 12 месяцев хранения.
По результатам наших исследований установлено, что в 72 % проб крови после 12 месяцев хранения этиловый спирт не обнаруживается, в то время как при первичном анализе данных проб этиловый спирт в них был обнаружен в концентрациях от 0,1 до 7,4 %%. Аналогичная картина изменения концентрации этилового спирта отмечена и при исследовании мочи.
Многочисленные публикации результатов исследований по вопросам посмертного изменения содержания этанола в трупном материале содержат весьма противоречивые данные. Известно, что концентрация этилового спирта в изолированных объектах трупа может как повышаться, так и снижаться, вплоть до полного исчезновения, что зависит от многих факторов: соблюдения правил забора биоматериала, характера микробного загрязнения (особенно грибками рода Candida), уровня глюкозы, сроков проведения анализа, условий хранения (наличия воздушной прослойки во флаконах с объектами), герметичность закрытия флаконов, наличие или отсутствие консерванта. Таким образом, сохраняемость этилового спирта в биологических объектах является процессом, на который влияют одномоментно многие факторы, и вывести простую зависимость между сроком хранения и сохраняемостью этанола практически невозможно.
ВЫВОДЫ
При оценке результатов повторного количественного определения этанола в биологических пробах необходимо учитывать все факторы, влияющие на сохраняемость этанола в каждой конкретной лаборатории. Только при таком подходе возможно достоверно оценить (подтвердить или опровергнуть) первичный результат анализа.
■ ЭКСТРАКЦИЯ, ДЕРИВАТИЗАЦИЯ И ГХ-МС АНАЛИЗ ГЛИКОЛЕЙ В ОБЪЕКТАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Р.Р. Краснова1, Е.П. Кириченко1, Н.В. Коблова1, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Изучена методика анализа гликолей и их метаболитов в объектах биологического происхождения методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) с предварительной дериватизацией тримети-луксусным ангидридом (ТМУА).
• Ключевые слова: этиленгликоль, органические кислоты, дериватизация гликолей
ВВЕДЕНИЕ
Определение компонентов технических жидкостей в биологических объектах по-прежнему является распространенным видом анализа при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований. Московская область не является исключением. Ежегодно встречаются случайные и суицидальные отравления техническими жидкостями, в состав которых входят глико-ли, в т.ч. этиленгликоль - основной компонент различных рецептур антифризов, гидравлических, тормозных жидкостей и жидкостей, используемых в системах отопления и автомобильных кондиционерах.
В газохроматографическом анализе полярных соединений низкой летучести для повышения чувствительности и воспроизводимости полярные функциональные группы подвергают превращению в неполярные группы дериватизацией без изменения основной структуры молекулы. Это улучшает хроматографические возможности, улучшает разделение структурно похожих соединений, повышает их летучесть и термическую стабильность, снижает потери при экстракции и в процессе анализа. За счет образования ионов с более высокими массами повышается чувствительность.
Сложность представляют также органические кислоты, являющиеся токсичными метаболитами гликолей (гликолевая, муравьиная и щавелевая кислоты), которые необходимо определять помимо гликолей в пробах биологического происхождения.
Кроме технологии с использованием метилирования с помощью диметилсульфата (ДМС), которая позволяет получить летучие эфиры непосредственно в водных пробах и исследовать парогазовую фазу при ГХ-МС анализе, была изучена и внедрена технология экстракции гликолей из биологических жидкостей и тканей внутренних органов после ферментативного разрушения и дериватизация ТМУА (пивалевым ангидридом).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Стандарты гликолей и их производных, LGC Reference Standarts. Триметилуксусный ангидрид,[(СН3)3СС0]20, CAS 1538-75-6 SIGMA-ALDRICH. Триэтиламин, (C2H5)3N, CAS 131-44-8 ACROS ORGANICS. Трипсин-фермент (Trypsin - EC 3.4.31.4 From Porcine Pancreas), тип IX-S, CAS 9003-07-7, кат. № Т 0303, 10 г/упак., Sigma Chemical Co.
Подготовка проб
Экстракция этиленгликоля и других гликолей из крови, мочи, внутриглазной жидкости, содержимого желудка и дериватизация ТМУА. Пробу жидкостей биологического происхождения (300 мкл) смешать в пробирке с 40 мкл водного раствора пропандиола-1,3 (1,3-пропиленгликоль) (6 г/л) в качестве внутреннего стандарта. Для осаждения белка и экстракции аналита к пробе добавить 1 мл ацетона, встряхивать и центрифугировать. Надосадочную жидкость перенести в виалу и выпарить при 70 °C. Остаток растворить в 40 мкл смеси ТМУА - триэтиламина -метанола (30:1:1) и нагреть при 70 °C в течение 15 минут. Охлажденный раствор смешать с 300 мкл метанола.
Ферментативное разрушение ткани печени (почки). В колбу Эрленмейера емкостью 100 мл поместить через пластмассовую воронку 5 г пробы печени (почки) (средняя проба), нарезанной кусочками. Добавить 8 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 1 мл свежеприготовленного раствора трипсина (5 мг/мл) в фосфатном буфере и стеклянные бусинки, закрыть пластмассовой пробкой, поместить в водяную баню со встряхиванием при температуре 57 °C на 3 часа. Оставить на ночь в холодильнике. Профильтровать через нейлоновую сетку. Водную фазу довести фосфатным буфером (рН 7,5) до 10 мл. 300 мкл водной фазы (аликвота 0,1 г ткани) исследовать, как биожидкости.
ГХ-МС анализ: Газовый хроматограф серии АТ МАЭСТРО 7830 c масс-селективным детектором АТ 5975 (Agilent Technologies). Тип ионизации: электронный удар (70 эВ). Диапазон масс 40-500 а.е.м. Колонка капиллярная Agilent 19091 S-433 HP-5MS 0,35 мм х 30 м х 0,35 мкм. Температурный режим колонки: начальная температура колонки 100 °C, время выдержки - 3 минуты, скорость подъема температуры в диапазоне 100-300 °C - 10 °Смин, время выдержки при 300 °C - 10 минут. Скорость газа-носителя (гелий) - 1 мл/мин. Температура испарителя 370 °C,
