CC BY
40
Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н.
Институт биологии УНЦ РАН, г Уфа ГУП «Опытный завод Академии наук Республики Башкортостан», г Уфа
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА ИНГИБИТОРОВ РОСТА ФИТОПАТОГЕНОВ ПСЕВДОМОНАДАМИ
Получены математические модели биосинтеза бактерий рода Pseudomonas, описывающие изменение фунгицидной активности и титра клеток в зависимости от концентраций компонентов питательных сред. Дан сравнительный анализ полученных математических моделей и представлены составы оптимизированных питательных сред.
Культуры Pseudomonas aureofasiens ИБ 51, Pseudomonas aureofasiens ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17 являются объектами биологического контроля почвенных фитопатогенов и обладают совокупностью полезных для растений свойств, таких как синтез антифунгальных антибиотиков и рост-стимулирующих веществ [1-3].
Для промышленного производства биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas с высоким титром клеток и наибольшей антигрибной активностью, как нами ранее было показано [4], нужно учитывать фактор наличия в питательной среде источников органического углерода и органического азота. Оптимальным источником углерода является глицерин, а в качестве источника азота предлагается использование автолизата отработанных пивных дрожжей, которые в настоящее время не находят квалифицированного применения и в то же время содержат все незаменимые аминокислоты и значительное количество витаминов различных групп.
Решение задачи оптимизации ферментационных сред и условий культивирования микроорганизмов с целью повышения выхода биомассы или (и) накопления определенных продуктов обмена веществ микроорганизмов, таких как антибиотики, практически всегда основывается на проведении многочисленных экспериментов. Применение же методов математического планирования эксперимента позволяет не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий нас процесс и количественно оценить степень этого влияния, но и решить задачу с проведением относительно малого количества экспериментов.
В настоящей работе представлены результаты оптимизации питательных сред
методом математического планирования с целью увеличения биомассы и антигрибной активности бактерий рода Pseudomonas и сравнительный анализ полученных моделей.
Материалы и методы
В работе использовали односуточные культуры Pseudomonas aureofasiens (= P. chlororaphis) ИБ 51, Pseudomonas aureofasiens ИБ 6, Pseudomonas putida ИБ 17, выращенные при 28°C и n = 180 мин-1 на качалке УВМТ-12-250 в жидкой питательной среде Кинг В [5], которые затем пересевали (1 мл) в колбы емкостью 250 мл со 100 мл среды, состоящей из следующих компонентов: глицерин, дрожжевой автолизат, Na2HPO4 • 12H2O, KH2PO4 • 2H2O, MgSO4 ■ 7H2O, FeCl3, в количестве согласно плане эксперимента, и культивировали в течение трех суток при температуре 28oC.
Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи подвергали термической обработке при 100 °С в течение часа.
Оптимизацию составов ферментационных питательных сред проводили с применением метода математического планирования эксперимента [6] в два этапа: построение адекватной математической модели процесса; нахождение собственно оптимального состава среды одним из известных способов.
Для получения простейшей адекватной модели требовалось связать выходной параметр системы (антигрибная активность, титр клеток) с входными - концентрациями компонентов ферментационной среды. В эксперименте единовременно проверяли серию вариантов ферментационных сред, в которых все компоненты (факторы) варьировались на двух количественных уровнях («верхнем +» и «нижнем -»). Для изучаемых штаммов были
проведены полные факторные эксперименты (ПФЭ) по плану 24.
В качестве 4 факторов варьирования были взяты глицерин (Х1), дрожжевой автолизат (Х2), №2НР04 • 12Н20(Х3), КН2Р04 • 2Н20(Х4), уровни варьирования представлены в таблице, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано на следующем уровне: М§804 ■ 7Н20 - 1,5 г/л, РеС13 - 0,01 г/л.
После соответствующей математической обработки экспериментальных данных зависимость антигрибной активности (титра клеток) Y1 (У2) штамма от концентрации в среде всех варьируемых компонентов представляется в виде многофакторного уравнения регрессии, являющегося по сути искомой математической моделью процесса:
У = Ъп + Ъ,Х, + Ъ2Х2 +... + Ь X ,
0 11 2 2 пи’
где Хп - содержание соответствующего компонента в среде в условных единицах («+1» -верхний уровень, «-1» - нижний уровень);
Y - активность штамма (ед/мл среды), титр клеток (КОЕ/мл среды)
Ъп - коэффициенты регрессии, отражающие степень влияния концентрации в среде п-го фактора на антигрибную активность (титр клеток) Y. Для их расчета использовалась формула Йейтса:
ъ = (XX у) / к,
п 4 п и 7
где Хп = 1 - значение фактора в соответствующем варианте факторного эксперимента;
У - величина активности штамма в соп
ответствующем варианте;
N - общее число вариантов в ПФЭ.
Определение оптимальных составов ферментационных сред проводили по схеме «крутого восхождения».
Титр жизнеспособных клеток устанавливали методом предельных разведений на ага-ризованной среде Кинг B.
Антигрибную активность проверяли известным методом [7], в качестве тест-объекта использовали фитопатогенный гриб Bipolaris sorokiniana (= Helminthosporium sativum).
Результаты и обсуждение
По результатам ПФЭ 24 были вычислены коэффициенты уравнений регрессии -математических моделей зависимости функций Y1 (антигрибная активность) и Y2 (титр клеток) от концентрации в ферментационной среде компонентов Хр Х2, Х3, Х4. Уравнения регрессии, с учетом значимости коэффициентов, выглядят следующим образом:
для штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 Y1 = 4,60 +0,15X1+ 1,46X3,
Y2 = 6,47 + 5,50X2 + 4,78X3; для штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 Y2 = 4,29+0,63X2+1,52X3+1,06X4,
Y2 = 3,41+1,89X2+1,39X3; для штамма Pseudomonas putida ИБ 27 Y2=3,99+0,93X2+0,62X3+1,48X4, Y2=2,11+0,64Xr1,59X2+0,49X3. Анализируя полученные уравнения регрессии, можно увидеть некоторые закономерности: основное положительное влияние на антигрибную активность двух штаммов вида P aureofasiens оказывает увеличение концентраций глицерина (X1) и Na2HPO4 • 12H2O (Х3), причем на штамм ИБ 6 дополнительное положительное влияние оказывает увеличение концентрации KH2PO4 • 2H2O (Х4), а концентрация дрожжевого автолизата (X2) соответствует опти-
Таблица. Компоненты питательной среды и их уровни варьирования в ПФЭ 24
Компонент среды Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования
Глицерин, г/л Xi 11,00 2,00 20,00 9,00
Дрожжевой автолизат, л/л X2 0,13 0,01 0,25 0,12
Na2HPO4 12H2O, г/л X3 5,50 1,00 10,00 4,50
KH2PO4 2H2O, г/л X4 1,50 0,50 2,50 1,00
MgSO4 7H2O, г/л Постоянный уровень - 1,50
FeCl3, г/л Постоянный уровень - 0,01
мальному значению для штамма этого вида (т.е. изменение его концентрации в выбранных пределах не вызывает заметное, статистически значимое изменение антигрибной активности). На прирост биомассы положительное влияние оказывает увеличение концентраций дрожжевого автолизата (Х2) и №2НР04 • 12Н20 (Х3).
Несколько иначе ведет себя штамм вида P. putida, где положительное влияние на увеличение антигрибной активности оказывает увеличение концентраций автолизата (Х2), №2НР04 • 12Н20 (Х3) и КН2Р04 • 2Н20 (Х4), а на прирост биомассы положительно влияет увеличение концентраций компонентов Х1 и Х3 при негативном воздействии увеличения концентрации дрожжевого автолизата (Х2).
На основании уравнений регрессии зависимости антигрибной активности и реализации плана крутого восхождения были установлены оптимальные составы питательных сред (в г/л):
для штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 глицерин - 11,30; дрожжевой автолизат - 0,11; Na2HPO4 - 6,96;
KH2PO4 - 1,58; MgSO4 ■ 7H2O - 1,5;
FeCl3 - 0,01; pH 7,4; для штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 глицерин - 11,53; дрожжевой автолизат -0,13; Na2HPO4 - 6,14;
KH2PO4 - 1,60; MgSO4 ■ 7H2O - 1,5;
FeCl3 - 0,01; pH 7,4; для штамма Psudomonas putida ИБ 17 глицерин - 11,00; дрожжевой автолизат - 0,16;
Na2HPO4 - 6,23;
KH2PO4 - 1,89; MgSO4 ■ 7H2O - 1,5;
FeCl3 - 0,01; pH 7,4. Антигрибная активность выращенных на данных средах штаммов Pseudomonas в 1,5 раза выше, чем в среднем варианте, в то же время титр клеток на данной среде составил 2,20* 1010, 1,46*1010 и 5,00 *109 КОЕ/мл КЖ соответственно для штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17, что вполне удовлетворяет условиям промышленного культивирования микроорганизмов.
Список использованной литературы:
1. Патент РФ №2203945, Б.И. №13, 2003. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев H.H., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.
2. Патент РФ №2260951, Б.И. №27, 2005. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 - продуцент цитокининов / Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H.
3. Патент РФ №2213774, Б.И. №28, 2003. Штамм бактерий Pseudomonasputida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев H.H., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф.
4. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 // Биотехнология. - 2003. - №5. - С. 22-25.
5. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - V. 44. - P. 301-307.
6. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М., 1969; 126 с.
7. Широков А.В., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 - ингиби-
торы роста фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, №2. - С. 161-165.
Статья рекомендована к публикации 07.03.08
