CC BY
193
577.153.2:576.809.53
Н. В. Паканещикова, Н. Н. Силищев, О. Н. Логинов
Влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы
Институт биологии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел.: (3472) 35-57-83 ГУП «Опытный завод Академии наук Республики Башкортостан» 450079, г. Уфа, ул. Ульяновых, 65; тел.: (3472) 42-92-52
В ходе скрининга выделены новые микроорганизмы, обладающие липолитической активностью, и изучено влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы на примере изолята Илб 2-1.
Ключевые слова: липолитическая активность, фермент, питательная среда.
Одним из промышленно важных ферментов, продуцируемых микроорганизмами, являются липазы. Эти ферменты представляют как теоретический, так и практический интерес в связи с возможностью использования их в различных отраслях народного хозяйства. Особенно важную роль липазы играют в пищевой промышленности, клинической медицине, аналитической и препаративной химии, сельском и коммунально-бытовом хозяйствах, в том числе и для очистки сточных вод '.
Несмотря на то, что сферы практического использования липаз очень обширны и, несомненно, будут расширяться, эти ферменты находят ограниченное применение в основном из-за высокой стоимости препаратов и, следовательно, высокой себестоимости вырабатываемой с их помощью продукции. В этой связи большое значение обретает поиск новых высокоактивных культур, разработка совершенной технологии их ферментации, создание эффективных методов выделения и очистки ферментов.
Нами была поставлена задача поиска новых перспективных бактерий, обладающих высокой липолитической активностью, и подбора для них условий культивирования, обеспечивающих максимальный выход липолити-ческих ферментов.
Условия эксперимента
Для исследования липолитической активности использовались микроорганизмы,
выделенные в ходе скрининга почвенных образцов и образцов активного ила.
Накопительные культуры получали на жидкой среде Раймонда с добавлением 1.0% бараньего и свиного жиров в качестве единственного источника углерода.
Первичный скрининг проводили на твердых жирах (бараньем и свином), окрашенных нильским голубым сернокислым 2. На чашки Петри с агаризованной средой наносили куль-туральную жидкость исследуемых микроорганизмов, а затем каплями вносили окрашенный жир. В качестве положительной реакции рассматривали изменение цвета окрашенного жира с розового на сине-фиолетовый в процессе термостатирования чашек Петри при 27 оС. За процессом наблюдали в течение семи суток.
Липолитическую активность определяли в культуральной жидкости в динамике через 24, 48, 72, 96 ч культивирования по модифицированному методу Ота и Ямада 3. Культуры выращивали в колбах объемом 250 мл с 100 мл среды на качалке со скоростью вращения 160 об/мин при 28—29 оС. В качестве субстрата использовали 40% эмульсию оливкового масла в 2% растворе поливинилового спирта. Реакционная смесь включала следующие компоненты: 1 мл культуральной жидкости, 4.5 мл 0.05 М фосфатного буфера рН 8.0, 5 мл эмульсии оливкового масла. Гидролиз проводили в течение часа при 37 оС, после чего добавляли 10 мл этанола и продукты гидролиза оттитровывали 0.025 М раствором ЫаОН в присутствии 1% раствора тимолфталеина. Контрольные образцы титровали сразу же без выдерживания в термостате, добавив этанол. Активность липазы выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 ч при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости. Составы питательных сред, используемых при культивировании микроорганизмов, приведены в табл.
Дата поступления 16.12.05 16 Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. №2
Таблица
Состав питательных сред, %
Среда 1 Среда 2
Соевая мука 5.0 Соевая мука 5.0
Мочевина 0.1 Мочевина 0.1
к2иро4 0.2 К2НРО4 0.2
MgS04•7H20 0.1 MgSO4•7H2O 0.1
СаСО, 0.5 СаСО, 0.5
Среда 3 Среда 4
Мочевина 5.0 Пептон 1.0
№2НР04 0.4 Питательный агар 0.3
к2нро4 0.2 №С1 0.5
№С1 0.05
MgSO4•7H2O 0.1
СаСО 0.
Дрожжевой экстракт 2.0
Крахмал 2.0
Среда 5 Среда 6
Соевая мука 2.5 Соевая мука 0.5
К2НРО4 0.5 К2НРО4 0.5
0.1 0.1
Среда 7 Среда 8
Соевая мука 2.5 Соевая мука 0.5
Дрожжевой экстракт 2.0 Дрожжевой экстракт 2.0
К2НРО4 0.5 К2НРО4 0.5
0.1 0.1
Среда 9 Среда 10
Соевая мука 2.5 Соевая мука 0.5
Дрожжевой экстракт 4.0 Дрожжевой экстракт 4.0
К2НРО4 0.5 К2НРО4 0.5
0.1 (N^^04 0.1
Среда 11
Дрожжевой экстракт 2.0
К2НРО4 0.5
0.1
Результаты и обсуждение
В ходе первичного скрининга были выделены 34 изолята: 16 из почвенных образцов, отобранных в различных областях Российской Федерации, и 18 из биологических очистных сооружений пермского мясокомбината. В результате исследований изолятов, выделенных в ходе первичного скрининга, были отобраны 14 культур микроорганизмов, обладающих ли-политической активностью. Нужно отметить, что среди изолятов, выделенных из биологических очистных сооружений, липолитически активных культур оказалось в два раза больше, чем среди почвенных изолятов. Пять из них обладают сравнительно высокой липоли-тической активностью как на свином, так и на бараньем жирах. Это выражается в изменении цвета всей массы окрашенного жира с розового на сине-фиолетовый уже на 2—3 сутки, в то время, как для других изолятов полное изменение окраски наступало только на 5—6 сутки термостатирования, либо наблюдалось частичное изменение окраски жира.
Дальнейшие исследования проводили с изолятом Илб 2-1, показавшим высокую ли-политическую активность при первичном скрининге.
Известно, что состав среды оказывает большое влияние на уровень биосинтеза липаз микроорганизмами 4 5. Высокая липолитичес-кая активность наблюдается на средах, богатых сложными органическими веществами, в частности, на средах, содержащих кукурузную муку, соевую муку, пептон, мочевину. Поэтому для подбора среды, оптимальной для биосинтеза липазы, изучаемым изолятом Илб 2-1, были использованы в первую очередь питательные среды 1—6 (табл.). Хотя в составе этих шести питательных сред содержатся компоненты сложного органического состава, изо-лят Илб 2-1 проявил липолитическую активность лишь на средах, содержащих соевую муку. Нужно отметить, что активность фермента возрастала с увеличением концентрации соевой муки. В то же время другие компоненты питательной среды также оказывают влия-
162,5 й
'с г
100 80 60 40 20 0
0
48 72
Время культивирования, ч
Среда 8 л Среда 9 а Среда 10
■ Среда 7 -
Рис. Липолитическая активность изолята Илб 2-1 на разных средах
ние на синтез липазы. Так, максимальная липолитическая активность (23.3 мкМ олеиновой кислоты мл-1 • ч-1) наблюдалась на среде 5 в первые сутки культивирования несмотря на то, что среда 1 содержит несколько большую концентрацию соевой муки. В связи с этим можно предположить, что такие компоненты питательной среды, как мочевина и мел, оказывают на фермент ингибирующее действие. В пользу этого довода свидетельствует и то, что на среде 3 с достаточно высокой концентрацией мочевины изолят не синтезировал липазу и рост микроорганизмов на этой среде не проявлялся.
Представляло интерес максимальное повышение синтеза липазы исследуемым изоля-том. В качестве дополнительного компонента питательной среды мы решили использовать дрожжевой экстракт. Он содержит многие витамины группы В и имеет высокую физиологическую и питательную ценность, поэтому часто применяется в качестве компонента питательных сред, например, при культивировании Pseudomonas 6. Для дальнейших исследований на основе сред 5 и 6 было составлено несколько вариантов питательных сред (среды 7-10).
Первоначальные исследования показали, что наивысшая липолитическая активность наблюдалась на среде 5 с 2.5% соевой муки. Как видно из рис., добавление 2% дрожжевого экстракта на фоне 2.5% соевой муки (среда 7) привело к увеличению липолитической активности изолята Илб 2-1 с 23.3 до 47.5 мкМ оле-
иновой кислоты мл-1 • ч-1. При дальнейшем повышении концентрации дрожжевого экстракта до 4 % (среда 9) ферментативная активность изолята возросла уже почти в 7 раз по сравнению с активностью на среде 5 без дрожжевого экстракта и составила 155 мкМ олеиновой кислоты мл-1 • ч-1.
Аналогичным образом дрожжевой экстракт повлиял на липолитическую активность изолята Илб 2-1 при его культивировании на средах 6, 8, 10 с 0.5 % соевой муки. Если при культивировании изолята на среде 6 с 0.5 % соевой муки без дрожжевого экстракта липолитическая активность не наблюдалась, то уже при добавлении 2 % дрожжевого экстракта на фоне 0.5% соевой муки (среда 8) фермент проявил активность, хотя и незначительную - 10 мкМ олеиновой кислоты мл-1 • ч-1. Увеличение количества дрожжевого экстракта с 2 % до 4 % на фоне 0.5% соевой муки (среда 10) в 16 раз повысило активность фермента, и величина липолитической активности составила 162.5 мкМ олеиновой кислоты мл-1 • ч-1.
Следует отметить, что дрожжевой экстракт оказывает влияние не только на величину липолитической активности, но и на скорость синтеза фермента. Так, при увеличении концентрации дрожжевого экстракта с 2 до 4 % скорость синтеза фермента на фоне 2.5% соевой муки снизилась на 24 ч (рис.).
В своих исследованиях Ю. Я. Свириденко отмечает, что снижение количества дрожжевого экстракта с 4 до 0.5 % на фоне 2.5% соевой
муки не оказало значительного влияния на ли-политическую активность грибов 7. В нашем случае видно, что повышение концентрации дрожжевого экстракта не просто повышает синтез фермента, а на порядок увеличивает липолитическую активность изолята Илб 2-1.Однако, при культивировании изолята на среде 11, содержащий дрожжевой экстракт без соевой муки, активность фермента оказалась нулевой. Это свидетельствует о том, что на синтез липазы исследуемым изолятом большое влияние оказывают оба компонента питательной среды.
Таким образом, в ходе проделанной работы был получен ряд липолитически активных изолятов, а также изучено влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы изолятом Илб 2-1. Из представленных данных видно, что активность и свойства липазы, продуцируемой исследуемым изолятом, в большой степени зависит от таких компонентов питательной среды, как соевая мука и дрожжевой экстракт. Наивысшая липолитическая активность была получена на среде, содержащей не менее, чем 4% дрожжевого экстракта на фоне 0.5 и 2 % соевой муки.
Литература
1. Глазунова Л. М., Гончаров Ю. И., Минина В. С. Липазы микроорганизмов.— М.: ОНТИТЭИ-микробиопром, 1984.— 36 с.
2. Герхардт Ф и др. Методы общей бактериологии.- М.: Мир, 1984.- 264 с.
3. Ota Y. a. Yamada K. // Agric. and Biol. Chem.-1966.- № 30.- С. 351.
4. Аренде И. М., Дорохов В. В., Турочкина Т. М. // Прикл. биохим. и микробиол.- 1975.- № 11.-С. 691.
5. Borgstrom B. А. Brockman H. L. Lipases.-Amsterdam: Elsevier Science Publishers B. V., 1984.- 527 c.
6. Патент РФ № 2203945 Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами / Логинов О. Н., Свешникова Е. В., Силищев Н. Н., Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф., Бойко Т. Ф. // Изобретения.- 2003.- №13.
7. Свириденко Ю. Я., Лобырева Л. Б., Марченкова А. И., Рубан Е. Л., Усманский М. С. // Прикл. биохим. и микробиол.- 1978. — № 5.- С. 677.
