CC BY
356
УДК 579.841.11:519.242.7
С. П. Четвериков, Е. А. Асабина, О. Н. Логинов
Оптимизация состава питательной среды для промышленного производства биопрепарата «Елена»
Институт биологии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел. (3472) 35-57-83 ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан 450079, г. Уфа, ул. Ульяновых, 65; тел. (3472) 42-92-52
С помощью метода полного факторного эксперимента ПФЭ 2 4 разработана питательная среда для промышленного производства биопрепарата — фунгицида «Елена» с высоким титром клеток и наибольшей антигрибной активностью.
Ключевые слова: биопрепарат, питательная среда, математическое моделирование, антигрибная активность.
Основой биопрепарата сельскохозяйственного назначения «Елена» является выделенный в Институте биологии УНЦ РАН штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens (= P. chlororaphis) ИБ 51 1 2, обладающий антигрибной активностью.
При промышленном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в растениеводстве, высокая стоимость питательной среды неизбежно приведет к удорожанию целевого продукта.
С одной стороны, все известные среды для культивирования псевдомонад, такие как среда LB 3, среда Кинга 4, содержат в своем составе пептон — ингредиент, высокая стоимость которого отрицательно сказывается для использования этих сред при промышленном производстве биопрепаратов.
С другой стороны, для получения культур Pseudomonas с высоким титром клеток и наибольшей антигрибной активностью, как нами ранее было показано 5, нужно учитывать фактор наличия в питательной среде источника органического азота.
Выходом из сложившейся ситуации является использование питательной среды, где в качестве источника азота используется автолизат отработанных пивных дрожжей, который содержит все незаменимые аминокислоты, а также в значительном количестве витамины группы В, РР и Е, но в настоящее время не находит квалифицированного применения.
Дата поступления 24.01.06
Микробные культуры при их культивировании высоко чувствительны к составу питательной среды. При удачном подборе всех компонентов по качественному и количественному составу, среда обеспечивает достаточно быстрый рост и развитие популяции микроорганизмов и считается сбалансированной.
При подборе питательных сред с целью повышения выхода биомассы или накопления определенных продуктов обмена веществ микроорганизмов, таких как антибиотики или ростстимулирующие вещества, широкое применение нашли методы математического планирования эксперимента, которые позволяют не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий нас процесс, но и количественно оценить степень этого влияния.
Цель настоящей работы — оптимизация состава питательной среды для промышленного производства биопрепарата — фунгицида «Елена» с высоким титром клеток и наибольшей антигрибной активностью с помощью методов математического планирования эксперимента.
Условия эксперимента
В настоящей работе использовали односу-точную культуру Pseudomonas aureofasiens (=P. chlororaphis) ИБ 51, выращенную при 28 оС и n = 180 мин-1 на качалке УВМТ-12-250 в жидкой питательной среде Кинг В 4, которую затем пересевали (1 мл) в колбы емкостью 250 мл со 100 мл среды, состоящей из следующих компонентов: глицерин, дрожжевой автолизат, Na2HPO4-12H2O, KH2PO4-2H2O, MgSO4-7H2O, FeCl3, в количестве, необходимом согласно плану эксперимента, и культивировали в течение трех суток при температуре 28 оС.
Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи подвергали термической обработке при 100 оС в течение часа.
Оптимизацию состава ферментационной питательной среды проводили с применением метода математического планирования эксперимента 6 в два этапа: построение адекватной математической модели процесса; нахождение собственно оптимального состава среды одним из известных способов.
Для получения простейшей адекватной модели требовалось связать выходной параметр системы (антигрибная активность, титр клеток) с входными — концентрациями компонентов ферментационной среды. В эксперименте единовременно проверяли серию вариантов ферментационных сред, в которых все компоненты (факторы) варьировались на двух количественных уровнях («верхнем +» и «нижнем —»). Таким образом, число вариантов так называемого «полного факторного эксперимента» (ПФЭ) соответствовало числу всех возможных сочетаний варьируемых компонентов среды. Для п факторов, каждый из которых был взят на 2-х уровнях концентрации, число вариантов состава сред — 2п. Такой факторный эксперимент обозначается как ПФЭ-2п.
В качестве четырех факторов варьирования были взяты глицерин (Х1), дрожжевой автолизат (Х2), Ма2НР0442Н20(Х3), КН2Р04-2Н20 (Х4), уровни варьирования представлены в табл. 1, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано на следующем уровне: М^804-7Н20 - 1.5 г/л, FeClз - 0.01 г/л.
После соответствующей математической обработки экспериментальных данных, зависимость антигрибной активности (титра клеток) У1 (У2) штамма от концентрации в среде всех варьируемых компонентов представляется в виде многофакторного уравнения регрессии,
являющегося, по сути, искомой математической моделью процесса:
У = Ьи + Ь,х, + Ь2х2 + ... + Ь х ,
и 11 2 2 п п 7
где хп — содержание соответствующего компонента в среде в условных единицах («+1» — верхний уровень, «—1» — нижний уровень); У — активность штамма (ед/мл среды), титр клеток (КОЕ/мл среды); Ьп — коэффициенты регрессии, отражающие степень влияния концентрации в среде п-го фактора на антигрибную активность (титр клеток) У.
Для расчета Ьп использовалась формула Йейтса:
(X х Уп)
N
где
Хп = 1 — значение фактора в соответствующем варианте факторного эксперимента; Уп — величина активности штамма в соответствующем варианте; N — общее число вариантов в ПФЭ.
Следующий этап — определение оптимального состава ферментационной среды в эксперименте по схеме «крутого восхождения», в вариантах которого последовательно, с определенным шагом X*, изменяли концентрации компонентов в среде. Основой для расчета X* являются величины Ьп. В серии вариантов одновременно увеличивали или уменьшали дозы тех факторов, коэффициенты регрессии при которых имели соответсвенно знаки «+» или «—».
Титр жизнеспособных клеток устанавливали методом предельных разведений на ага-ризованной среде Кинг В 4.
Компоненты питательной среды и их уровни варьирования в ПФЭ 24
Таблица 1
Компонент среды Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «—» Верхний уровень «+» Единица зарьированш
Глицерин, г/л XI 11.00 2.00 20.00 9.00
Дрожжевой автолизат, г/л Х2 0.13 0.01 0.25 0.12
Ыа2ИР04 • 12Н20, г/л Хз 5.50 1.00 10.00 4.50
КН2Р04 • 2Н20, г/л Х4 1.50 0.50 2.50 1.00
Мя504 • 7Н20, г/л Постоянный уровень — 1.50
БеС13, г/л Постоянный уровень — 0.01
Таблица 2
Схема ПФЭ-24 по оптимизации ферментационной среды
Вариант X1 X2 X3 X4 Y1 Антигрибная активность, ед/мл КЖ y2 Титр клеток, млрд КОЕ/мл КЖ
1 - - - - 2.0 0.79
2 + - - - 2.0 0.95
3 - + - - 2.0 1.42
4 + + - - 2.0 0.55
5 - - + - 5.0 1.00
6 + - + - 9.0 0.95
7 - + + - 4.8 24.70
8 + + + - 7.0 17.57
9 - - - + 5.8 0.97
10 + - - + 7.0 1.27
11 - + - + 2.0 2.80
12 + + - + 2.3 4.72
13 - - + + 8.0 0.94
14 + - + + 3.7 0.84
15 - + + + 6.0 23.33
16 + + + + 5.0 20.67
17 0 0 0 0 7.0 16.40
Антигрибную активность проверяли известным методом 7, в качестве тест-объекта использовали фитопатогенный гриб Bipolaris sorokiniana (= Helminthosporium sativum).
Результаты и обсуждение
Согласно существующей матрице планирования, проведено 16 экспериментов с различным варьированием изучаемых факторов (табл. 2).
В результате эксперимента удалось вычислить коэффициенты уравнений регрессии — математических моделей зависимости функций Y1 (антигрибная активность) и Y2 (титр клеток) от концентрации в ферментационной среде компонентов Х1, Х2, Х3, Х4:
для антигрибной активности
b0 = 4.60, b1 = +0.15, b2 = -0.71, b3 = +1.46, b4 = +0.38;
для титра клеток
b0 = 6.47, b1 = -0.53, b2 = +5.50, b3 = +4.78, b4 = +0.47;
Соответственно, уравнения регрессии выглядят следующим образом:
У1 = 4.6 + 0.15X7 — 0.71X2 + + 1.46X3 + 0.38X4, У2 = 6.47 — 0.53X7 + + 5.5X2 + 4.78X3 + 0.47X4 .
Из уравнений следует, что зависимости для антигрибной активности и титра клеток различны. В обоих случаях увеличение относительно среднего уровня (вариант 17) содержания в среде факторов Х3 и Х4 (т. е. минеральной составляющей питательной среды) должно дать положительный эффект, и, соответственно, снижение содержания фактора Х2 и увеличение фактора Х1 должно дать значимый положительный эффект для увеличения антигрибной активности, в противоположном случае идет увеличение титра с пониженинм антигрибной активности.
Проведенный в дальнейшем эксперимент, в котором в серии вариантов ферментационной среды одновременно и с определенным шагом, снижались концентрации «отрицательных» компонентов и увеличивались концентрации
«положительных», привел к решению поставленной задачи — получению оптимальной по составу среды для наибольшей антигрибной активности. Величина шага Л* движения по градиенту концентраций факторов в среде рассчитывалась по стандартной методике, исходя из значений коэффициентов регрессии 6 (табл. 3).
Таблица 3 Расчет Л* для «крутого восхождения» для антигрибной активности
Показатель Х1 Х2 Х3 Х4
b n 0.15 - 0.71 1.46 0.38
Àn 9.00 0.12 4.50 1.00
b xÀ n n 1.35 - 0.09 6.57 0.38
Основной уровень 11.00 0.13 5.50 1.50
K 15.00 - 1.00 73.00 4.22
À* 0.15 - 0.01 0.73 0.04
В результате эксперимента по плану «крутого восхождения» была разработана ферментационная среда следующего состава (в г/л): глицерин — 11.30; дрожжевой автолизат - 0.11; Na2HPO4 — 6.96; KH2PO4 — 1.58; MgSO4 Ч 7H2O — 1.5; FeCl3 — 0.01; pH 7.4. На данной среде антигрибная активность штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 составила 12 ед/мл КЖ, что более чем в 1.5 раза выше, чем в среднем варианте, в то же время титр клеток на данной среде составил 22 млрд КОЕ/мл КЖ, что вполне удовлетворяет условиям промышленного культивирования микроорганизмов.
Таким образом, при помощи метода математического планирования эксперимента разработана питательная среда для промышленного производства биопрепарата -фунгицида «Елена» с высоким титром клеток и наибольшей антигрибной активностью.
Литература
1. Пат. 2203945 РФ Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами / Логинов О. H., Свешникова Е. В., Силищев H. H., Мелентьев А. И., Галимзянова H. Ф., Бойко Т. Ф. // Б. И.- 2003.- №13.
2. Логинов О. H., Свешникова Е. В., Четвериков С. П., Пугачева Е. Г., Васильева H. С., Силищев H. H. ^вые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды // Тез. докл. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (24-25 ноября 2003 г., г.Пущино, ИБФМ).-Пущино, 2003.- С. 74.
3. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Press; 1989.- Р. A1.
4. King E. O., Ward M. K., Raney D. E. // J. Lab. Clin. Med.- 1954.- V.44.- P. 301.
5. Логинов О. H., Четвериков С. П. // Биотехнология.- 2003.- №5.- С. 22.
6. Максимов В. H., Федоров В. Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов.- М., 1969.- 126 с.
7. Широков А. В., Логинов О. H., Мелентьев А. И., Актуганов Г. Э. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Т.38, № 2.- С. 161.
