CC BY
163
Бурова Ю.А., Ибрагимова С.А., Ревин В.В.
Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева E-mail: Burova13@gmail.com
ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ СУСПЕНЗИИ PSEUDOMONAS AUREOFACIENS 2006 НА МЕЛАССЕ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ
ЕЕ СВОЙСТВ
Показана возможность использования мелассы в качестве основного компонента среды для культивирования бактерии Pseudomonas aureofaciens 2006. Подобраны оптимальные концентрации мелассы и источников азотного (NaNO3) и фосфорного (КН2РО4) питания, при которых прирост биомассы максимален. Полученная бактериальная суспензия оказывает положительное влияние на развитие семян пшеницы и обладает антифунгальным действием к ряду фитопатогенов.
Ключевые слова: Pseudomonas aureofaciens, меласса, культивирование, биомасса, фитопатогены, антифунгальные свойства.
За последнее время во всем мире, в том числе и в России, неизмеримо вырос интерес к проблемам микробиологии в сельском хозяйстве. Значительно расширилось представление о роли микроорганизмов в жизни растений [1] . Все большее значение отводится замене химических средств защиты биологическими. Широкое применение находит использование микробов-антагонистов, эффективных в малых концентрациях [2]. Стимуляцию роста и развития растений, а также их защиту от фитопатогенов можно усилить искусственным внесением в почву биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, синтезирующих большое количество различных метаболитов и являющихся наиболее изученными и применяемыми в области биометода. Флуоресцирующие псевдомонады синтезируют большое количество соединений, оказывающих ростостимулирующее действие на растения, либо угнетающих развитие фитопатогенных грибов [3, 4]. Для культивирования бактерий требуются богатые по составу питательные среды с дрожжевым экстрактом, глюкозой, пептоном. С целью снижения себестоимости конечного продукта возможно использование более дешевых субстратов, например, отходов пищевого производства -послеспиртовая барда [5], свекловичная меласса, молочная сыворотка. Однако нестандартное сырье имеет несбалансированный состав минеральных веществ, повышенную кислотность. Поэтому при использовании в качестве основы питательной среды необходимо оптимизировать его состав и условия культивирования микроорганизмов.
Цель работы
Изучение роста бактерии Pseudomonas aureofaciens 2006 на мелассной среде и определение ростостимулирующих и фунгицидных свойств полученной бактериальной суспензии.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать состав питательной среды на основе мелассы, обеспечивающий максимальный прирост биомассы бактерии в условиях глубинного культивирования.
2. Определить влияние полученной бактериальной суспензии на развитие семян пшеницы в лабораторных условиях и изучить ее ан-тифунгальные свойства.
Объект и методы исследования
Объектом исследования служила бактерия Pseudomonas aureofaciens 2006, выделенная из почвы и отселекционированная на кафедре биотехнологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (подана заявка на депонирование). В ходе эксперимента по оптимизации состава среды рассматривали варианты с концентрацией мелассы 10, 20, 30, 40, 50 и 60 г/л, полученной с Ромодановс-кого сахарного завода Республики Мордовия.
Известно, что бактерии используют как нитратный, так и аммонийный азот [6]. При оптимизации в раствор мелассы добавляли NaNO3, (NH4)2SO4 и NH4NO3 в концентрации 1, 2 и 3 г/л. В качестве источника фосфорного питания вносили КН2РО4 с содержанием 1; 1,5; 2 и 2,5 г/л. Культивирование микроорганизма проводили в термостатируемом шейкере-инкуба-торе ES-20/60 BioSan (Латвия) при 150 об/мин и 29 °С в течение 24 часов. Инокулят выращи-
вали на жидкой питательной среде Кинга. Начальный рН сред 6.8 - 7.0. Для создания условий, приближенных к промышленным, культивирование осуществляли в биореакторе фирмы Biostat A plus (Germany) при различных режимах работы мешалки (150, 180, 200 мин-1). В пробах периодически (каждые 2 часа) измеряли биомассу гравиметрическим методом (электронные лабораторные (аналитические) весы Shimadzu AUX 220, Japan), проводили микро-скопирование культуры.
Для оценки ростостимулирующего эффекта семена пшеницы сорта Тулайковская-10 (род Triticum L, относящийся к семейству злаковые -GramineaeJuss) коммерческой партии в количестве 100 штук обрабатывали бактериальной суспензией, разведенной водопроводной водой в соотношении 1:100. Контроль - обработка семян водой. На 3 и 7 сутки определяли энергию прорастания и всхожесть по ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести» [7]. Семена проращивали в климатической камере Sanyo MLR-351 H (Japan).
В качестве тест-объектов при исследовании антифунгальных свойств полученной бактериальной суспензии использовали следующие фитопатогены: Fusarium culmorum, Alternaria solani А7МУК3, Alternaria solani А7МУК4, Alternaria tennisima A7AxT11g*, Alternaria infectoria A7AkT1103/2, Alternaria alternata A7AxT1g11g, предоставленные сотрудниками кафедры микологии и альгологии ФГБОУ ВПО «МГУ имени М.В. Ломоносова». Совместное поверхностное культивирование проводили на картофельно-
глюкозном агаре при 25-27 °С в течение 7 суток в термостате электрическом суховоздушном ТС-1/80 СПУ (Россия). Фитопатогены засевали блочками, бактериальную суспензию наносили по краю чашки сплошной линией. Степень ингибирования определяли по зоне отсутствия роста грибов. Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали с использованием стандартных программ.
Результаты и их обсуждение
Уровень биомассы клеток при культивировании микроорганизмов зависит от ряда причин, одной из которых является доступность субстрата и его оптимальное количество. Полученные результаты показали прямую зависимость прироста биомассы от увеличения концентрации мелассы в среде. Максимальный уровень биомассы отмечен на 23 часы культивирования в вариантах с концентрацией субстрата 40, 50, 60 г/л и составил в среднем 10,1±0,3 г/л, что более чем в 1,5 раза выше значений при 10 и 20 г/л (рисунок 1).
В дальнейших исследованиях при подборе источников азота с экономической точки зрения использовали мелассу в концентрации 40 г/л.
В составе мелассы находится 1,1-1,5% азота, причем третья часть его находится в форме бетаина, использовать который в качестве источника азота микроорганизмы, как правило, не могут. Также в мелассной золе сравнительно мало фосфора [8]. Внесение азотных и фосфорных солей позволяет оптимизировать среды, приготовленные на нестандартном сырье.
Концентрация мелассы, г/л Рисунок 1. Максимальный прирост биомассы
Добавление в среду источника азота интенсифицировало рост культуры. Лучший результат отмечен в варианте с нитратной формой при концентрации 2 г/л (12,5 г/л). Титр активных клеток составил в среднем 109-1010 КОЕ/мл. При использовании аммонийного азота прирост биомассы составил в среднем на 9,5% меньше предыдущего варианта. В варианте с нитратом аммония максимум биомассы составил 11,4 г/л при концентрации 2 г/л (рисунок 2).
Дополнительное внесение фосфорнокислого калия также вызвало увеличение роста исследуемой культуры. При концентрации соли 2,5 г/л на 19 часы роста уровень биомассы составил 15,4 г/л с максимальным титром 7,1x10й КОЕ/мл. При уменьшении концентрации соли до 1,5 г/л содержание биомассы снизилось на 17,7% .
В следующей серии опытов культивирование Р. aureofaciens 2006 проводили в полупромышленных биореакторах на среде оптимального состава (меласса - 40 г/л, №N03 - 2 г/л, КН2РО4 - 2,5 г/л) при различных режимах работы мешалки. Во всех вариантах максимальное содержание микробной массы и высокий титр клеток наблюдался на 21 ч. роста (таблица 1). Микроскопические исследования показали наличие большого содержания грамотрица-тельных палочек в поле зрения.
При режиме 180 мин-1 уровень биомассы составил 15,1 г/л, что на 8,0 и 14,6% выше, чем в вариантах со 150 и 200 мин-1 соответственно.
В первые часы культивирования значения рН снизилось на 0,8 единиц и в дальнейшем оставалось на уровне 5,2 до конца процесса.
Таким образом, при использовании мелассы в качестве основы питательной среды для культивирования Р. аurеofaciens 2006 необходимо внесение минеральных солей NaN03 и КН2РО4, обеспечивающих увеличение прироста биомассы и количества жизнеспособных клеток. В процессе культивирования в биореакторе данный результат достигался при режиме работы мешалки 180 мин-1.
Известно, что различные штаммы бактерии P. aureofaciens способны синтезировать вещества гормональной природы, оказывающие положительное действие на развитие растений [3, 9, 10]. Для выявления ростостимулирующих свойств исследуемого штамма проводили обработку семян пшеницы сорта Тулайковская-10. Титр клеток бактериальной суспензии составлял 109-1010 КОЕ/мл.
Бактеризация семян псевдомонадами способствовала ускорению их развития. Значения энергии прорастания и всхожести опытных вариантов превысили контрольные на 20 и 18% соответственно. В опытном варианте наблюдалось увеличение вегетативной части растений и длины корня (рисунок 3).
Наличие фунгицидных свойств у бактерий обуславливает эффективность их использования в качестве агентов биоконтроля. В процессе роста растения подвергаются действию фитопатогенов, развивающих различного рода заболевания, приводящих к их гибели. Бактерии рода Pseudomonas синтезируют широкий спектр первичных и вторичных метаболитов, к которым можно отнести антибиотики (в-лактоны), аминогликозиды, моно-лактамы, сидерофоры, псевдомоновые кислоты [11, 12, 13, 14].
Исследования, проведенные при совместном культивировании P. aureofaciens 2006 с фитопа-
Таблица 1. Титр клеток бактериальной суспензии, КОЕ/мл
Количество оборотов мешалки, мин"1 Время культивирования, ч
17 19 21 23
150 1,2*108 9,0*108 1,0*1010 6,0*109
180 5,3*108 6,6*109 2,5*10° 4,0*1010
200 4,1 *108 1,0*1010 1,2*1010 9,0*109
■ I
NaNO3
(NH4)2SO4
NH4NO3
j 1 г/л ■ 2 г/л ■ 3 г/л
Рисунок 2. Максимальный прирост биомассы Р. аигео/аЫет 2006 на среде с разными источниками азота
тогенами, показали наличие антифунгальных свойств, степень проявления которых различна в отношении определенной тест-культуры. Наиболее выраженным антагонизмом бактерия обладала к Alternaria alternata A7AxT1g11g, которая является возбудителем заболеваний растений, относящихся к пасленовому семейству [15] (рисунок 4). Здесь зона ингибирования составила 26 мм. Меньшее воздействие отмечено на фитопатоген Alternaria infectoria A7AkT1103/2, рост гриба ингибировался при тесном контакте с P. aureofaciens 2006. По мере сближения микроорганизмов мицелий гриба становился рыхлым, стелящимся по поверхности агара.
Для фитопатогенов Fusarium culmorum, Alternaria solani А7МУК3, Alternaria solani
АМУК и Лквтапа tennisima АА Т. 1е* от-
7 4 7 x 1 °
мечено значимое снижение степени их развития. Зона ингибирования в среднем составляла 17-20 мм.
Можно предположить, что различия в антагонистическом действии нового штамма псевдомонад на тест-культуры обусловлено разной степенью восприимчивости микромицетов к бактериальным метаболитам.
Заключение
Таким образом, показана возможность использования мелассы в качестве основы питательной среды взамен дорогостоящего сахаросодержащего сырья, что позволяет снизить себестоимость технологического процесса полу-
опыт контроль
Рисунок 3. Проросшие семена пшеницы Тулайковская-10 (7 сутки)
Alternaria
solani
A7MУK3
Fusarium
culmorum
Alternaria
tennisima
AA^1g*
Alternaria
solani
A7MУK4
Alternaria
alternata
Alternaria
infectoria
A7AXTAI A7AJ1103/2
Рисунок 4. Рост культур при совместном культивировании
чения биопрепарата на основе бактерии Р. aureofaciens 2006. Полученная бактериальная суспензия оказывает выраженное стимулирующее действие на развитие семян пшеницы. Зоны ингибирования роста фитопатогенов
свидетельствуют о наличии антифунгальных свойств исследуемого штамма бактерии, степень действия которых различна в зависимости от тест-культуры.
10.04.2012
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К. 2011» (договор № 13168) и «Старт 11» (гос контракт № 9318 р/ 15161) в лаборатории «Промышленной биотехнологии»
НОЦ «Нанобиотехнологии»
Список литературы:
1. Тихонович И.А., Кожемяков А.П., Чеботарь В.К. и др. Биопрепараты в сельском хозяйстве (Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве). - М.: Россельхозакадемия, 2005. - 154 с.
2. Романенко, Н.Д. Перспективы использования бактерий-антогонистов против наиболее фитопатогенных видов нематод, вирусов и грибов / Н.Д. Романенко, И.О. Попов, С.Б. Таболин, Е.Н. Бугаева // АГРО XXI. - 2008. - №1-3. - С. 23-27.
3. Боронин, А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - №10. - С. 25-31.
4. Andrews J.H., Harris R.F. The ecology and microbiology of microorganisms on plant surface // Annu. Rev. Phytopathol. - 2000. -Vol. 38. - Р. 145-180.
5. Лукаткин, А.А. Культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде / А.А. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития: Матер. Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Киров, 27-29 ноября 2007 г. - Киров, 2007. - Вып. 5, Ч. 2. - С. 359-360.
6. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. Т. 2. / [Н. Криза, П. Смита]; под ред. Дж. Хоулта, перевод с англ. под ред. Г. А. Заварзина. - М.: Мир, 1997. - 430 с.
7. ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести - Взамен ГОСТ 12038-66; введ. 1986-07-01; с изм. 1990-06-01, 1995-03-01. - М.: Издательство стандартов, 2004.
8. Химический каталог. Введение в биотехнологию [Электронный ресурс] / Автор М.Е. Бекер. - Copyright ©, 2012. -Режим доступа: http://www.ximicat.com/ebook.php?file=becer_bio.djvu&page=26, свободный. - Загл. с экрана.
9. Costacurta A., VanderleydenJ. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria // Crit. Rev. Microbiol. - 1995. - Vol. 21. -№1. - P. 1-18.
10. Katsy, E. Participation of Auxins in Regulation of Bacterial and Plant Gene Expression // Russian Journal of Genetics. - 1997. -Vol. 33, №5. - P. 463-474.
11. Boruah H., Kumar B. Biological activity of secondary metabolites produced by a strain of Pseudomonas fluorescens II Folia Microbiol (Praha). - 2002. - Vol. 47. - P. 359-363.
12. Jousset A., Lara E., Wall L., Valverde C. Secondary metabolites helpbiocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHAO to escape protozoan grazing // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 72, №11. - P. 7083-7090.
13. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. - 2003. - V. 157. - P. 503-523.
14. Paulitz T., Nowak-Thompson B., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens // J. Chem. Ecol. - 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.
15. Дьяков, Ю.Т. Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. пособие / Ю.Т. Дьяков, О.Л. Озерецковская, В.Г. Джава-хия, С.Ф. Багирова. - М.: Изд-во Общество фитопатологов, 2001. - 302 с.
Сведения об авторах:
Бурова Юлия Александровна, аспирант кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева, е-mail: burova13@gmail.com Ибрагимова Светлана Александровна, доцент кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева, кандидат биологических наук,
е-mail: ibragimova-s@yandex.ru Ревин Виктор Васильевич, профессор кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева, доктор биологических наук, е-mail: biotesh@moris.ru
430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26б
UDC 579.841.11
Burova Y.A., Ibragimova S.A., Revin V.V.
Mordovian N.P Ogareva State University, е-mail: Burova13@gmail.com
PRODUCTION A BACTERIAL SUSРENSION PSEUDOMONAS AUREOFACIENS 2006 ON MOLASSES MEDIUM AND STUDY OF ITS SEVERAL PROPERTIES
The possibility of using molasses as the main component of the cultural medium of the bacteria Pseudomonas aureofaciens 2006. Optimal concentrations of molasses, nitrogen (NaNO3) and phosphorus (KH2PO4) sources at which the maximum increase in biomass were chosen. Bacterial cultural medium stimulates the growth of wheat and proсesses of antifungal effect.
Key words: Pseudomonas aureofaciens, molasses, cultivation, biomass, phytopathogens, antifungal effect.
