CC BY
465
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 3. С. 198-206
Биология
УДК 577.15:579.83
Действие культуральной жидкости бактерии Pseudomonas aureofaciens на развитие семян пшеницы и фитопатогенных грибов *
Ю. А. Бурова, С. А. Ибрагимова, В. В. Ревин
Аннотация. В бактериальной суспензии Pseudomonas aureofaciens обнаружены вещества фитогормональной (индолил-3-уксусной кислоты) и антибиотической (феназин-1-карбоновая кислота, 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота, 2-гидроксифеназин) природы. Данные соединения в культуральной жидкости в условиях отсутствия живых клеток обеспечивают положительный эффект на развитие семян пшеницы и оказывают ингибирующее действие на рост фитопатогенов.
Ключевые слова: Pseudomonas aureofaciens, культуральная
жидкость, биологически активные вещества, фитогормоны, семена, антибиотики, фитопатогены.
Введение
Для защиты растений наиболее часто используют химический метод, в связи с этим в почве происходит накопление вредных веществ и снижение ее плодородности. Разработка биопрепаратов, а также расширение их ассортимента дает возможность для создания беспестицидных технологий. Обработка посевного материала, а также корней и проростков растений некоторыми штаммами бактериями рода Pseudomonas может существенно увеличивать урожайность целого ряда сельскохозяйственных культур. Использование биопрепаратов на основе псевдомонад может преследовать различные цели: защиту растений и урожая от фитопатогенов, стимуляцию прорастания семян и роста растений за счет биологически активных веществ, синтезируемых микроорганизмами [1-3]. Стимуляторы роста растений представлены у бактерии данного рода фитогормонами (индолил-3-уксусная
* Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программам «У.М.Н.И.К. 2011» (договор № 13168) и «СТАРТ 2011» (гос. контракт № 9318р/15161), гранта Минобрнауки РФ (гос. контракт № 11.519.11.5019).
кислота (ИУК), цитокинины, гиберрелины) [4, 5]. Использование природных фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве весьма перспективно ввиду простоты их получения, сравнительной дешевизны, высокой способности их к детоксикации в растительном организме, а также способности легко связываться в клетке и катаболизироваться. Известно, что антифунгальный эффект ризосферных микроорганизмов обусловлен синтезом антибиотических веществ. У бактерий р. Pseudomonas обнаружено около 100 антибиотических веществ самого разнообразного строения и только не более 20% из них играют роль в подавлении фитопатогенных грибов при незначительных концентрациях [6-8]. Наиболее хорошо изучены феназин-1-карбоновая кислота, феназин-1-карбоксамид, 2,4-диацетилфлороглюцин, пиолютеорин, пирролнитрин и цианид водорода.
Анализ литературных источников свидетельствует о различной способности микроорганизмов к продукции активных метаболитов, зависящей от вида, штамма, среды и условий культивирования. Поиск и изучение новых штаммов ризосферных микроорганизмов позволит расширить спектр используемых на рынке биопрепаратов.
Целью данной работы явилось изучение активных метаболитов в культуральной жидкости бактерии Pseudomonas aureofaciens, выращенной на мелассной среде, обеспечивающие ростостимулирующий эффект на растения и антифунгальное действие.
Материалы и методы
На биологическом факультете Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева ведутся исследования по созданию биопрепарата для защиты и стимуляции роста растений на основе нового штамма бактерии Pseudomonas aureofaciens, выделенной из почвы и отселекционированной сотрудниками кафедры биотехнологии. Ранее показано, что данная культура обладает антифунгальными свойствами и стимулирует рост растений [9].
Культивирование бактерии осуществляли на мелассной среде оптимизированного состава в биореакторе Sartorius A plus (Германия) при 180 об/мин в течение 3 суток. Хранение бактериальной суспензии (БС) осуществляли при 4° С в течение 30 суток. Каждые сутки контролировали уровень продукции фитогормона — индолил-3-уксусной кислоты колориметрическим методом [10]. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут. К 1 объему супернатанта добавляли 0,5 объема реактива Сальковского (0,05 М FeCl3 в 35%-й хлорной кислоте). Оптическую плотность определяли через 1 час при длине волны 540 нм на спектрофотометре Shimadzu (Япония). Определение уровня ИУК в супернатанте проводили с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием раствора синтетической ИУК. Для определения ростостимулирующего эффекта полученным супертанантом культуральной
жидкости (КЖ) обрабатывали семена пшеницы сорта «Тулайковская 10». Для этого семена в количестве 100 штук погружали в раствор супернатанта, разведенного водой в соотношении 1:100 и помещали на чашки Петри. На
3 и 7 сутки определяли энергию прорастания и всхожесть согласно ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести» [11]. Семена инкубировали в климатической камере Sanyo MLR-351 H (Japan) при константных условиях.
КЖ бактерий исследовали на наличие в ней веществ феназиновой природы. Разделение данных пигментов проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии [12] на 3, 5, 10 и 14 сутки хранения бактериальной суспензии. Пигменты экстрагировали хлороформом, разделение осуществляли с использованием пластинок «Силуфол» 20х20 см (Чехия) в системе хлороформ: метанол: 25% водный раствор аммиака (90:25:1). Окрашенные соединения анализировали по хроматографической подвижности Rf.
Для оценки антагонистических свойств бактериальных метаболитов бактерии Ps. aureofaciens проводили культивирование исследуемого штамма совместно с фитопатогенами Alternaria solani А7МУК3, Al-ternaria solani А7МУК4, Fusarium culmorum, Alternaria tenuissima методом двойной агаризованной среды, в качестве которой использовался картофельно-глюкозный агар. В чашки Петри последовательно заливали питательную среду, накладывали на застывший агар стерильный бумажный фильтр, равный внутреннему диаметру чашки, поверх вносили второй слой вышеназванной среды. Культуру бактерий высевали на поверхность верхнего слоя питательной среды. После инкубирования в течение трех суток в термостате ТС — 1/80 СПУ (Россия) при 28±2°С верхний слой среды вместе с бумажным фильтром стерильно извлекали. На оставшийся слой агара высевали тест-культуры фитопатогенов по одному на Чашку методом блочков в модификации М.В. Соколовой (1995) и Г.В. Калько (1996) [13, 14]. В контроле грибы выращивали на чистом картофельно-глюкозном агаре одновременно с опытным вариантом. Диаметр колонии измеряли через 7 суток, оценивали ингибирование роста фитопатогена. Расчет ингибирующей активности бактериальных метаболитов проводили по формуле Эббота как процент ингибирования роста колонии гриба, равный
100(Дк - До)/Дк, (1)
где Дк — диаметр колонии гриба в контроле, см; До - диаметр колонии гриба в опыте, см.
Результаты и обсуждение
Как видно из данных, представленных на рис. 1, в процессе хранения БС наблюдается существенные изменения уровня ИУК. Кривая накопления фитогормона характеризовалась наличием двух пиков. Первый максимум
отмечен на 12 сутки хранения БС, второй — на 19-е сутки (0,38 мкг/мл). Оба максимума имели равные значения и были непродолжительными во времени. Определение титра в культуральной жидкости на данный период показал наличие большого количества колоний бактерии (109 КОЕ/мл). При увеличении сроков хранения наблюдалось снижение концентрации ИУК в среднем на 54%. С 22 по 30 сутки хранения БС уровень ИУК оставался на постоянном уровне.
Концентрация 0,4 ИУК, мкг/мл 035
0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05
0 +—г-1—т—1—1—1—1—1—г-1—г-1—г-1—1—1—г—1—1—I—1—1-т—1—1—1—1—1-1
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
время хранения КЖ, сут.
Рис. 1. Динамика содержания ИУК в супернатанте Ps. aureofaciens 2006 в
процессе хранения
Способность ряда бактерий к синтезу ИУК в фазе замедления роста установлена ранее [15]. В данном случае причиной наличия двух пиков может быть связано с замедлением роста бактерии, обусловленного температурным стрессом при хранении, а также лимитирование питательных субстратов. На наш взгляд выделение ИУК бактериями в неблагоприятных условиях может иметь большое значение для сохранения ростостимулирующих свойств БС, что позволит использовать ее для обработки семян растений в течение длительного периода времени хранения.
Для подтверждения вышесказанного исследовалось влияние супернатанта БС (после 12 суток хранения) на ростовые показатели семян пшеницы. Как видно из данных, представленных в табл. 1 и на рис. 2, значения энергии прорастания в опытных вариантах превышали контрольные значения в среднем на 15%, а всхожесть — на 14%. При этом отмечено лучшее развитие ростков и корневой системы у опытных семян.
Таким образом, ростостимулирующий эффект исследуемой суспензии при отделении клеток сохраняется. На наш взгляд, это обусловлено наличием активных метаболитов в КЖ, в частности ИУК. Ранее было показано положительное влияние бактерий Рз. А'.погвзсвиз АР-33, Рз. аитво/асгвиз ББ 1393 на развитие растений картофеля, пшеницы, овса [16].
Основная роль в микопаразитическом эффекте псевдомонад отводится веществам антибиотической природы [6]. Для подтверждения антагонистических свойств оценивалась способность исследуемой культуры
Таблица 1
Ростовые показатели семян пшеницы сорта «Тулайковская 10»
Варианты обработки семян Энергия прорастания, % Всхожесть, % Высота ростков, см
Контроль 80±3 83±2 5,5±1,2
Супернатант 95±1 97±3 9,5±2,0
Культуральная жидкость Рэ. aureofaciens 96±2 96±3 11,0±1,7
контроль супернатант
Рис. 2. Вид семян пшеницы (3 сутки прорастания)
к образованию антибиотических веществ, используя метод тонкослойной хроматографии.
Полученные результаты показали, что на 3-е сутки хранения в КЖ обнаруживается антибиотик феназинового ряда — 2-гидроксифеназин-
1-карбоновая кислота (И! 30), с увеличением сроков хранения число антибиотических веществ увеличивается. Так, на 5-е сутки дополнительно обнаружена феназин-1-карбоновая кислота. На 10-е сутки хранения выявлен только 2-гидроксифеназин, но, уже на 14-е сутки — все три антибиотических вещества (табл. 2).
Таким образом, в процессе хранения БС Рз. аптво/асівиз (штамм 2006) отмечено наличие антибиотиков феназинового ряда, состав которых не постоянен, что возможно, связано с их взаимным превращением друг в друга.
Для выявления антифунгальных свойств метаболитов Рз. аптво/асіепз в отсутствии живых клеток использовали метод двойной агаризованной среды. Установлено, что рост исследуемых грибов сдерживается в течение всего периода наблюдения. Максимальный антагонистический эффект отмечен для А. зоїаиі А7МУК4 (рис. 3). При этом рост гриба практически отсутствовал, процент ингибирования роста составил 96 %.
Таблица 2
Хроматографическая подвижность феназиновых пигментов
Время хранения БС, сутки Rf х 100 Структура
3 30 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота
5 15 Феназин-1-карбоновая кислота
30 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота
10 51 2-гидроксифеназин
14 14 Феназин-1-карбоновая кислота
28 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота
46 2-гидроксифеназин
в г
Рис. 3. Рост фитопатогенов в опытном варианте (а — Alternaria solani А7МУК3; б — Alternaria solani А7МУК4; в — Alternaria tenuissima; г —
Fusarium culmorum)
Рост A. solani А7МУК3 и F. culmorum был незначительным и наблюдался лишь в первые сутки, процент ингибирования роста составил 86 и 89 % соответственно. Диаметр колонии гриба A. tenuissima был максимальным (процент ингибирования роста гриба — 74%), однако мицелий был
представлен тонкими гифами, стелящимися по поверхности агара. На рис.
4 видно, что в контрольном варианте все грибы имели плотную структуру мицелия с хорошо разветвленными гифами по всей поверхности питательной среды.
Рис. 4. Рост фитопатогенов в контроле (7-е сутки) (а — Alternaria solani А7МУК4; б — Alternaria solani А7МУК3; в — Alternaria tenuissima; г —
Fusarium culmorum)
Таким образом, антагонистическое действие бактерии отмечено и при отделении живых клеток. Уменьшение степени ингибирования роста фитопатогенов проявлялось в следующем ряду: Fusarium culmorum,
Alternaria solani А7МУК4, Alternaria solani А7МУК3 и Alternaria tenuissima.
Заключение
Из проведенных исследований можно заключить:
1. Ростостимулирующий эффект БС обусловлен синтезом фитогормона — индолилуксусной кислоты (ИУК). При отделении клеток бактерии от культуральной жидкости данное свойство сохраняется.
2. Антифунгальные свойства бактериальной суспензии объясняются способностью исследуемого штамма к синтезу антибиотических веществ, максимальное количество которых приходится на более поздние сроки хранения. Антифунгальные вещества бактерии Ps. aureofaciens способны к диффузии в питательную среду.
Список литературы
1. Brodhagen M, Henkels M.D., Loper J.E. Positive autoregulation and signaling
properties of pyoluteorin, an antibiotic produced by the biological control organism Pseudomonas fluorescens Pf-5 // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70, №3.
P.1758-1766.
2. Бурова Ю. А., Бабакина Т.М., Ибрагимова С.А. Влияние сроков хранения бактериальной суспензии Pseudomonas aureofaciens на ростостимулирующие свойства // Достижения и перспективы развития биотехнологии: матер. Междунар. науч. конф. / Типография ООО ««Мордовия-Экспо». Саранск, 2012. С.46-47.
3. Акимова Е.Е. Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения: дисс. .. .канд. биол. наук. М., 2007. 134 с.
4. Suzukil S., Hel Y., Oyaizul H. Indole-3-acetic acid production in Pseudomonas fluorescens HP72 and its association with suppression of creeping bentgrass brown patch // Current Microbiol. 2003. V.47, №2. P.138-143.
5. Aromatic amino acid aminotransferase activity and indole-3-acetic acid production by associativenitrogen-fixing bacteria / R. Pedraza [et al.] // FEMS Microbiol. Let. 2004. V.233. P.15-21.
6. Логинов О.Н. Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды: дисс. .. .д-ра биол. наук. Уфа, 2004. 296 c.
7. Haas D, Défago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads // Nature Reviews Microbiology. 2005. V.3, №4. P.307-319.
8. Lugtenberg B., Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2009. V.63. P.541-556.
9. Развитие фитопатогенных грибов при совместном культивировании с Pseudomonas aureofaciens 2006 / Ю.А. Бурова [и др.] // Проблемы лесной фитопатологии и микологии: матер. Междун. конф. / УлГУ. Ульяновск, 2012. С.120-124.
10. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indolacetic acid // Plant Physiology. 1951. V.26. P.192-195.
11. ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести, введ. 1986.07.01. М.: Изд-во стандартов. 2004. 62 с.
12. Власова Е.П. Салицилатгидроксилаза Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142): свойства и роль в гидроксилировании феназинов: дисс. .. .канд. биол. наук. М., 2011. 116 с.
13. Соколова М.В. Хитинолитическая активность трех штаммов бактерий рода Serratia // Современная биотехнология в решении проблем защиты растений: сб. науч. тр. СПб., 1995. С.214-224.
14. Калько Г.В, Новикова И.И., Павлюшин В.А. Испытание биопрепаратов алирина Б и алирина С в борьбе с фузариозными заболеваниями растений // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: тез. докл. конф. М., 1994. С.45-46.
15. Олюнина Л.Н. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста / Л.Н. Олюнина, В.П. Шабаев // Микробиология. 1996. Т.65, №5. С.813-817.
16. Саламатова Ю.А, Минаева О.М., Акимова Е.Е. Эффективности хранения ряда бактериальных препаратов в жидкой форме // Вестник Томского государственного университета. 2010. №1(9). С.20-25.
Бурова Юлия Александровна (burova13@gmail.com), аспирант, кафедра биотехнологии, Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва, Саранск.
Ибрагимова Светлана Александровна (ibragimova-s@yandex.ru), к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии, Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва, Саранск.
Ревин Виктор Васильевич (biotesh@moris.ru), д.б.н., профессор, заведующий кафедрой, кафедра биотехнологии, Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва, Саранск.
The study of the culture fluid of bacteria Pseudomonas aureofaciens on the development seeds of wheat and phytopathogens
Yu. A. Burova, S. A. Ibragimova, V. V. Revin
Abstract. In bacterial suspension Pseudomonas aureofaciens detected substances phytohormonal (indole-3-acetic acid) and antibiotic (phenazine-1-carboxylic acid, 2-gidroksifenazin-1-carboxylic acid,
2-gidroksifenazin) nature. These compounds in culture medium in the absence of living cells provide a positive effect on the development of wheat and have a negative effect on the growth of pathogens.
Keywords : Pseudomonas aureofaciens, bacteria, culture fluid, biologically active substances, phytohormones, seed, antibiotics, phytopathogens.
Burova Yulia (burova13@gmail.com), postgraduate, department of biotechnology, Ogarev Mordovia State University, Saransk.
Ibragimova Svetlana (ibragimova-s@yandex.ru), candidate of biological sciences, assistant professor, department of biotechnology, Ogarev Mordovia State University, Saransk.
Revin Viktor (biotesh@moris.ru), doctor of biological sciences, professor, head of the department, department of biotechnology, Ogarev Mordovia State University, Saransk.
Поступила 10.09.2012
