CC BY
203
УДК 57.083.132
UDC 57.083.132
ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ОПТИМИЗАЦИИ НЕКОТОРЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ PSEUDOMONAS SP114
Петенко Александр Иванович д.с-х.н., профессор
Гнеуш Анна Николаевна аспирант
Дмитриев Владимир Игоревич Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Представлены материалы по изучению питательных сред и подбору режимов культивирования
Ключевые слова: РЕЖИМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, Pseudomonassp 114 , ФЕРМЕНТАЦИОННЫЙ КОМПЛЕКС
INCREASING THE EFFICIENCY OF OBTAINING A BIOLOGICAL PRODUCT BASED ON OPTIMIZATION OF CERTAIN CULTIVATION CONDITIONS OF
PSEUDOMONAS SP114
Petenko Alexander Ivanovich Dr.Sci.Agr., professor
Gneush Anna Nikolaevna postgraduate student
Dmitriev Vladimir Igorevich
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
The article presents the materials of the study of nutrient medium and selection modes of cultivations
Keywords: CULTIVATING ENVIRONMENT, Pseudomonassp 114, POLYSACCHARIDES, BATCH FERMENTATION
Получение высококачественных биопрепаратов напрямую зависит от организации процесса культивирования микроорганизмов, а при его оптимизации, в первую очередь от состава культуральной среды. Процесс ферментации, в свою очередь, является основным по биотехнологическим параметрам фактором оказывающим влияние на качество и эффективность биопрепарата.
Задачами настоящего исследования является:
- Подбор условий ферментации, обеспечивающих оптимизацию получения культуральной жидкости обладающей протеолитической активностью (высоким содержанием комплекса кислых протеаз);
- Удешевление питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas;
- Изучение динамики потребления основных источников углерода, азота, протеолитических ферментов при выращивании Pseudomonas sp114.
Объектом исследования является культура Pseudomonassp 114, депонированная во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под № В-5060. Культура представляет собой подвижные мелкие палочки 0,5-1,0*1,5-5,0 мкм расположенные по одиночке, парами, очень редко в виде цепочки по 3-4 клетки, Грамм-положительные, спор и капсул не образует, приделы роста +10°С —+35°С. Гидролизует желатин, не гидролизует крахмал. В качестве источника углерода использует глюкозу, трегалозу, кетоглюконат, мезо-инозит, Ь-валин, Ь-аргинин, Ь-арабинозу, сахарозу, сорбит, пропионат, не использует бутират. Обладает аргининдегидролазной и лецитиназной активностью, способна к денитрификации нитрата и выступает в качестве антагониста широкого спектра фитопатогенных грибов. Исследуемая культура изображена на рисунке 1.
Рисунок 1 - Культура Pseudomonassp 114
Культура Pseudomonassp 114 выступает как активный продуцент высокоактивного протеолитического комплекса, не является патогенной, вирулентной, относится к сапрофитам (микроорганизмам живущих в естественных, природных условиях и принимающим участие в разложении органических остатков).
На первом этапе наших исследований произведен подбор и анализ состава питательных сред для культивирования Pseudomonassp 114. в колбах объемом 250 мл на орбитальном термостатируемом шейкере таких как:ЬБ, Кинг В, глюкозо-пептонная среда (среда Голубева), мелассно-автолизатная (МАС) питательная среда.
Отмечено, что незначительные изменения состава среды меняют не только уровни накопления гидролитических ферментов, но и соотношение протеаз и амилаз на разных стадиях развития культуры [5].
Поскольку синтез некоторых ферментов, в частности протеазы, а также многих вторичных метаболитов подвержен азотной репрессии, продукция этих соединений может быть увеличена в результате замены аммония в питательной среде на менее эффективные источники азота.
Часто в биопрепаративных формах протеаз присутствует целый комплекс ферментов с различными свойствами и одновременно комплексы ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами (изоферменты). Изоферменты идентичны по своему каталитическому действию, но различаются биофизическими константам. Биосинтез ферментов микроорганизмами тесным образом связан с основными условиями, влияющими на рост и развитие культур, и в первую очередь с составом питательной среды. Источники азота и углерода в питательной среде оказывают влияние, как на конструктивный обмен культур, так и на синтез ферментов. Относительно влияния различных источников азотистого питания в среде на рост микроорганизмов и образование протеолитических ферментов имеются различные мнения. Одни авторы считают, что белки являются единственным благоприятным источником азота для лучшего роста микроорганизмов и синтеза ферментов, другие же утверждают, что в
качестве лучшего источника азота необходимо использовать сочетание минерального и белкового субстратов и, наконец, ряд авторов полагают, что только минеральные соединения могут быть единственным источником азота [4].
Следующим этапом наших исследований являлся подбор питательной среды для культивирования Pseudomonassp 114 с целью её удешевления и как следствие снижение себестоимости конечного продукта.
Известные питательные среды LB и Кинг В, являющиеся основными для культивирования бактерий рода Pseudomonas., имеют такой недостаток как высокая стоимость, из-за дорогостоящего пептона входящего в состав основных сред. Использование на первом этапе глюкозопептонной среды (ГПС) было обусловлено универсальностью этой среды и хорошим ростом бактерий Pseudomonassp. 114. Достигнутый титр клеток Pseudomonassp. при выращивании на этой среде на качалочных колбах составлял 107 -108 КОЕ.
При промышленном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в микробиологическом производстве, высокая стоимость питательной среды неизбежно приведет к удорожанию целевого продукта.
Поставленная техническая задача удешевления стоимости питательной среды и увеличения выхода биомассы решается использованием ме-лассно-автолизатной (МАС) питательной средыв который в качестве углеродного субстрата входит кормовая меласса, являющаяся отходом свеклосахарного производства и содержащая до 45% сахарозы при низкой стоимости, что наглядно продемонстрировано в таблице 1. В дальнейшем, эта
среда использовалась как основа производственной среды для получения культуры Pseudomonassp.
Таблице 1 - Сравнительная оценка стоимости компонентов исследуемых сред
Наименование среды Компоненты Расход реактива в среде, кг/л Стоимость реактивов за 1 кг/руб Стоимость на 1 литр среды.руб.
LB Пептон (ферментативный) 0,010 2304,13 23,05
Дрожжевой экстракт 0,05 2665,38 133,21
NaCl 0,010 118,0 1,18
Итого 151,4
Кинг В Пептон 0,020 2304,13 46,09
Г лицерин 0,010 352,98 3,53
К2НРО4 0.0015 649,31 0,91
MgS04XlН20 0,0015 152,45 0,23
Итого 50,82
Г люкозо-пептонная среда Г олубе-ва ^НРО4 0,0032 262,99 0.84
К2НРО4 0,0003 649,31 1,95
MgS04XlН20 0,0005 152,45 0,08
NaCl 0,0005 118,0 0,06
Пептон (ферментативный) 0,002 2304,13 4,61
Дрожжевой экстракт 0,0005 2665,38 1,33
Г люкоза 0,025 262,45 6,56
Итого 15,43
Мелассно-автолизатная среда (МСА) Меласса кормовая 0,045 4,0 0,18
К2НРО4 0,002 649,31 1,30
MgS04Xl^0 0,0015 152,45 0,23
Дрожжевой автолизат 0,000268 11594,39 3,11
Итого 4,82
Культивирование маточной культуры на орбитальной качалке про-
водилось в следующем режиме:
Аэрация - 200 об/мин, температура культивирования - 30°С, время
культивирования - 24 часа до достижения титра клеток - 106 КОЕ. http://ej.kubagro.ru/2014/06/pdf/53.pdf
Затем в питательную среду (МАС) засевали 40 мл маточной культуры бактерий Pseudomonassp 114. Ферментацию осуществляли в течение 48 часов при 30°С при постоянной аэрации. Титр клеток в культуральной
8
жидкости в конце ферментации составлял 10 КОЕ.
Подготовленная таким образом культура Pseudomonassp. являлась маточной для засева ферментер Ока-01-05К «Каскад» предназначенного для реализации способа культивирования микроорганизмов, основанного на циклическом перемещении фиксированного объема культивационной среды через каскад ферментеров, в каждом из которых находятся микроорганизмы или клетки, имеющие заданную и периодически восстанавливаемую стадию роста.
Ферментер обеспечивает ускоренное проведение поисковых научноисследовательских и технологических работ, направленных на интенсификацию, в первую очередь непрерывных методов культивирования микроорганизмов, использование которых позволит значительно снизить стоимость получаемых продуктов.
Установка Ока-01-05К «Каскад» представленная на рисунке 2, является устройством лабораторного типа, обеспечивающим проведение исследовательских работ в области биотехнологии, культивационной гидродинамики, стерилизации ферментационного оборудования, жидких и газовых сред и интерактивного управления многостадийными процессами.
Комплекс представляет собой модульное биотехнологическое оборудование, позволяющее производить в периодическом и непрерывном режиме широкий спектр биотехнологических продуктов, причем переход с выпуска одного продукта к другому осуществляется по программе под управлением компьютера.
Модульное построение биотехнологических агрегатов и систем управления, а также их принцип действия, обеспечивают полную автоматизацию и интерактивный контроль многостадийных процессов.
Установка имеет набор методик и компьютерных программ, обеспечивающих режимы периодического и «каскадного» (отъемно-доливного, непрерывного) культивирования микроорганизмов.
Рисунок 2 - Ферментер 0ка-01-05К «Каскад»
Для культуры Pseudomonas sp.114 на мелассно-автолизатной среде как оптимальными были подобраны следующие условия выращивания: температура культивирования 30-32°С; аэрация 1,0-1,5 л/л/мин, скорость вращения мешалки 150-200 об/мин; рН среды 6,8-7,2; подтитровка- 5% КОН, пеногаситель - адеканоль; время культивирования - 48-72 часа. До-
8
стигнутый титр клеток составлял 10 кл/мл.
Дальнейшие работы по подбору режима культивирования микроорганизмов Pseudomonassp. 114 проводили на ферментационном оборудовании ОКА-100 с объемом 100 л представленной на рисунке 3, предназначенном для реализации процессов культивирования микроорганизмов, биосинтеза, биокатализа и биотрансформации биологически активных веществ по энергосберегающей технологии с использовании в качестве продуцентов бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, микроводорослей и тканей.
Рисунок 3 - Ферментер ОКА-100
После отработки режимов культивирования на установке ОКА-100 по показателям аэрации, температурного режима, объема протока культуральной жидкости были установлены оптимальные величины этих показателей.
Для культуры Pseudomonassp. 114 на мелассно-автолизатной среде в ферментере ОКА-100 оптимальными условиями выращивания являлись: температура культивирования 30-32°С, аэрация 1,0-1,5 л/л/мин, скорость мешалки 150-200 об/мин, рН 6,8-7,2 , подтитровка 5% КОН, пеногашение с помощью адеканоля, время культивирования - 8-72 часа. Достигнутый
титр клеток составлял 10° КОЕ. Динамика роста культурыPseudomonassp. 114 при выращивании на в ферментёре ОКА МФ-100 на МАС представлена на рисунке 4.
Время культивирования, час
Рисунок 4 - Динамика роста кyльтyрыPseudomonassp. 114 при выращивании на ферментёре ОКА МФ-100 на МАС
При выращивании культуры Pseudomonassp. 114 в ферментерах двух типов ОКА МФ-05 и ОКА МФ-100, отмечено, что результаты подбора режимов культивирования показали хорошую повторяемость, независимо от объема применяемого ферментера, что позволяет говорить о возможности дальнейшего масштабирования ферментационных процессов на установках большего объема (от 1000 л и более), что важно при получении этого компонента биопрепарата в промышленных условиях.
При культивировании Pseudomonassp. 114 на среде с мелассой в качестве источника углерода отмечено, что 4% по редуцирующим веществам (Рв) давало эффект прироста биомассы в течение 72 часов и не приводило к переходу культуры в стационарную фазу роста.
Установлены их оптимальные значения, посевная доза - 106кл/мл и насыщение среды кислородом - 70-90%.
Таким образом, выращивание маточных культур для дальнейшей разработки биопрепарата производили в колбах объемом 250 мл на глю-
козо-пептонной среде на ротационном шейкере при оптимальных температурах и аэрации для каждого вида.
Режим культивирования маточной культуры Рзепйошопаззр. 114 на орбитальной качалке:
- обороты качалки - 200 об/мин
- температура культивирования - 30°С
- время культивирования - 24 часа
- до достижения титра клеток - 106кл/мл.
Засевная биомасса культуры составляет 1 % от рабочего объема ферментера.
Режим выращивания культурыРзеийотопаъър. 114 в ферментере:
- температура культивирования - 30-32°С;
- аэрация 1,0-1,5 л/л/мин;
- обороты мешалки 150-200 об/мин;
- рН 6,8-7,2;
- подтитровка 5% КОН;
- пеногашение-адеканоль;
- время культивирования - 48-72 часа;
Достигнутый титр клеток составляет 109кл/мл.
Действие препарата основано как на дальнейшем развитии культуры на объекте применения, так и на непосредственном действии КЖ с ферментами на побочные продукты перерабатывающих предприятий основными из которых являются отходы животноводства.
После получения в ферментере биомассы клеток с заданным титром производится асептическая расфасовка культуральной жидкости с клетками в подготовленные асептические емкости. До применения биопрепарата хранение производят при температуре - + 5°
Список литературы:
1. Роуз.Э. Химическая микробиология. - Изд. «Мир», М.1971, С.259-265. УДК 576.8
2. Перт.С.Дж Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - Изд. «Мир»,М. 1978, С.144-165, 249-258. УДК 576.8.093.3+578.085.23.
3. Методы практической биохимии. Под ред. Б.Уильямса и К.Уилсона. -Изд. «Мир», М. 1978, С. 18-30. УДК 541.1+577.1
4. Хусид С. Б. Биохимические аспекты консервирования витаминного растительного сырья минеральными и биологическими консервантами/С.Б. Хусид, А.И. Петенко. И.С. Жолобова// Научный журнал КубГАУ, № 96(02), 2014 г.
5. Кощаев А. Г. Кормовая добавка на основе ассоциативной микрофлоры: технология получения и использование / А. Г. Кощаев, А. И. Петенко // Биотехнология. - 2007. - №
2. - С. 57-62.
6. Кощаев А. Г. Кормовые добавки на основе живых культур микроорганизмов / Кощаев, А. Г., Петенко, А. И. // Птицеводство. - 2006. - № 11. - С. 43-45.
8. Матреничева В.В. Химико-ферментативная обработка пищевых волокон растительного сырья/Матреничева В.В., Иванова А.А., Волкова О.Б // Пищевая промышленность, 2004. №8. С 7-12.
9. Пат. 2437864, Российская Федерация, МПКС05Б3/00, A01C3/00, C05F11/08.Способ микробиологической переработки птичьего помета/ В.И. Дмитриев, И.В.Мартынова. Л.И. Кочкина. Опубл. 27.12.2011. Бюл. № 7.
10. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология»/3. А. Аркадьева, А. М. Безбородов, И. Н. Блохина и др.; Под ред. Н.С.Егорова. - М. Высш. шк. 1989. 688 с. ISBN 5-06-001482-7, ББК 28.4 П 81, УДК 663.18
11. Андреева А.П. Микробиологическая трансформация анабазина микроорганизмами
родаРвеиёотопавБр. Вестник Новосибирского государственного университета.
Биология, клиническая медицина. 2010. Т. 8. № 4. С. 150-154.
12. SiddiquiI.A. ,HaasD.,Heeb S. Ех1гасе11и1агрго1еа8ео1Р8еиёотопа8Йиоге8сеп8снаоаЫосоп-trollfactorwithactivityagainsttheroot-knotnematodeMeloidogyneincognita // Appl. Envitor. Microbe. 2005. Vol. 71, № 9. P. 5646-5649.
13. Spiruchostatins a and b, novel gene expression-enhancingsubstances produced by Pseudomonas sp. Masuoka Y., Nagai A., Shinya K., Furihata K., Nagai K., Suzuki K.I., Hayakawa Y., Seto H. Tetrahedron Letters. 2001. Т. 42. № 1. С. 41-44
References
1. Rouz.Je. Himicheskaja mikrobiologija. - Izd. «Mir», M.1971, S.259-265. UDK 576.8
2. Pert.S.Dzh Osnovy kul'tivirovanija mikroorganizmov i kletok. - Izd. «Mir»,M. 1978, S.144-165, 249-258. UDK 576.8.093.3+578.085.23.
3. Metody prakticheskoj biohimii. Pod red. B.Uil'jamsa i K.Uilsona. -Izd. «Mir», M. 1978, S. 18-30. UDK 541.1+577.1
4. Husid S. B. Biohimicheskie aspekty konservirovanija vitaminnogo rastitel'nogo syr'ja min-eral'nymi i biologicheskimi konservantami/S.B. Husid, A.I. Petenko. I.S. Zholobova// Nauch-nyj zhurnal KubGAU, № 96(02), 2014 g.
5. Koshhaev A. G. Kormovaja dobavka na osnove associativnoj mikroflory: tehnologija polu-chenija i ispol'zovanie / A. G. Koshhaev, A. I. Petenko // Biotehnologija. - 2007. - № 2. - S. 57-62.
6. Koshhaev A. G. Kormovye dobavki na osnove zhivyh kul'tur mikroorganizmov / Koshhaev, A. G., Petenko, A. I. // Pticevodstvo. - 2006. - № 11. - S. 43-45.
8. Matrenicheva V.V. Himiko-fermentativnaja obrabotka pishhevyh volokon rastitel'-nogo syr'ja/Matrenicheva V.V., Ivanova A.A., Volkova O.B // Pishhevaja promyshlennost', 2004. №8. S 7-12.
9. Pat. 2437864, Rossijskaja Federacija, MPKC05F3/00, A01C3/00, C05F11/08.Sposob mikrobiologicheskoj pererabotki ptich'ego pometa/ V.I. Dmitriev, I.V.Martynova. L.I. Kochkina. Opubl. 27.12.2011. Bjul. № 7.
10. Promyshlennaja mikrobiologija: Ucheb. posobie dlja vuzov po spec. «Mikrobiologija» i «Biologija»/3. A. Arkad'eva, A. M. Bezborodov, I. N. Blohina i dr.; Pod red. N.S.Egorova. -M. Vyssh. shk. 1989. 688 s. ISBN 5-06-001482-7, BBK 28.4 P 81, UDK 663.18
11. Andreeva A.P. Mikrobiologicheskaja transformacija anabazina mikroorganizmami rodaPseudomonassp. Vestnik Novosibirskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologija, klinicheskaja medicina. 2010. T. 8. № 4. S. 150-154.
12. SiddiquiI.A.,HaasD., HeebS. ExtracellularproteaseofPseudomonasfluorescenssnaoabio-con- trollfactorwithactivityagainsttheroot-knotnematodeMeloidogyneincognita // Appl. Envi-tor. Microbiol. 2005. Vol. 71, № 9. P. 5646-5649.
13. Spiruchostatins a and b, novel gene expression-enhancingsubstances produced by Pseudomonas sp. Masuoka Y., Nagai A., Shinya K., Furihata K., Nagai K., Suzuki K.I., Hayakawa Y., Seto H. Tetrahedron Letters. 2001. T. 42. № 1. S. 41-44
