Научная статья на тему 'Особенности взаимодействия бактерий Bacillus subtilis с дерматофитными грибами'

Особенности взаимодействия бактерий Bacillus subtilis с дерматофитными грибами Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
844
141
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ДЕРМАТОМИЦЕТЫ / МИКРОБНЫЙ АНТАГОНИЗМ / ЦИКЛИЧЕСКИЕ ЛИПОПЕПТИДЫ / BACILLUS SUBTILIS / DERMATOMYCETES / MICROBIAL ANTAGONISM / CYCLIC LIPOPEPTIDES / TRICHOPHYTON / MICROSPORUM

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Актуганов Г. Э., Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф., Лукманова К. А., Кузьмина Л. Ю.

Изучены особенности антагонистического взаимодействия in vitro штамма B. subtilis IB-54 с грибами-дерматофитами видов Microsporum canis, Trichophyton gypseum и Trichophyton rubrum. Влияние бактерий проявлялось в задержке или подавлении развития грибов на стадиях прорастания спор, формирования ростковых трубок и ветвления гиф. Устойчивость к действию антагониста возрастала в ряду M. сanis − T. gypseum − T. rubrum. В то же время, интенсивность развития бактерий и их эффект существенно снижались с увеличением возраста дерматомицетов в асинхронных культурах в связи с накоплением в среде антибактериальных метаболитов. Уровень антимикотической активности бактериальных метаболитов в значительной степени коррелировал с количественным содержанием циклических липопептидов в культуральной среде. Специфика взаимодействия B. subtilis IB-54 с дерматомицетами проявлялась в колебаниях уровня относительной продуктивности штамма в биосинтезе антимикотических соединений.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Актуганов Г. Э., Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф., Лукманова К. А., Кузьмина Л. Ю.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

SPECIFICS OF BACTERIAL-FUNGAL INTERATCION BETWEEN BACILLUS SUBTILIS AND DERMATOPHYTES

The traditional therapy of dermatomycoses is associated with a long period of exploitation of expensive antimycotic agents resulting to harmful side effects and formation of the pathogen tolerance. The application of antagonistic bacteria and their metabolites for control of dermatophyte fungi can be considered as a potential biotechnological alternative to using synthetic antimycotic drugs in combinative therapy and prevention of dermatomycoses. Examples of effective inhibition of dermatophytes by antagonistic bacteria and fungi are known, however these are rarely presented in current studies. Moreover, the mechanisms of interaction between dermatophyte fungi and antagonistic bacteria are not almost elucidated in literature. The present research studies antagonistic interactions between B. subtilis, strain IB-54 and dermatophyte fungi belonging to species of Microsporum canis, Trichophyton gypseum and Trichophyton rubrum. The studied strain displayed a constitutive ability to producing antimycotic compounds that were specifically changed depending on the target fungal species. Total suppression of fungal growth was registered in submerged dual synchronous culture of bacteria and dermatophytes. The main differences in antifungal influence of bacteria were concluded in retardation or inhibition of fungal development at different stages of spore germination, formation of growth tubes and hyphae branching. The tolerance to antagonistic action increased in series M. сanis − T. gypseum − T. rubrum. At the same time, bacterial density and activity decreased considerably with the increase of fungal culture age due to the fact of preliminary accumulation of antibacterial metabolites in the culture medium that was confirmed with additional tests. The antimycotic activity of metabolites produced in dual cultures considerably correlated with quantities of cyclic lipopeptides found in the culture medium that propose its key role in fungal growth inhibition. The obtained results propose diverse mechanisms of interaction between antagonistic bacteria and various groups of dermatophyte fungi that can be turned to account in development of novel strategy of dermatomycoses therapy used by biological antimycotic agents.

Текст научной работы на тему «Особенности взаимодействия бактерий Bacillus subtilis с дерматофитными грибами»

УДК 579.264:579.261

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ БАКТЕРИИ BACILLUS SUBTILIS С ДЕРМАТОФИТНЫМИ ГРИБАМИ

© Г. Э. Актуганов1*, А. И. Мелентьев1, Н. Ф. Галимзянова1, К. А. Лукманова2, Л. Ю. Кузьмина1, Т. Ф. Бойко1

1Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, проспект Октября, 69.

Тел.: +7 (347) 235 57 04.

E-mail: [email protected] 2Башкирский государственный медицинский университет Россия, Республика Башкортостан, 450077 г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Изучены особенности антагонистического взаимодействия in vitro штамма B. subtilis IB-54 с грибами-дерматофитами видов Microsporum canis, Trichophyton gypseum и Trichophyton rubrum. Влияние бактерий проявлялось в задержке или подавлении развития грибов на стадиях прорастания спор, формирования ростковых трубок и ветвления гиф. Устойчивость к действию антагониста возрастала в ряду M. сanis - T. gypseum - T. rubrum. В то же время, интенсивность развития бактерий и их эффект существенно снижались с увеличением возраста дерматомицетов в асинхронных культурах в связи с накоплением в среде антибактериальных метаболитов. Уровень антимикотической активности бактериальных метаболитов в значительной степени коррелировал с количественным содержанием циклических липопептидов в культуральной среде. Специфика взаимодействия B. subtilis IB-54 с дер-матомицетами проявлялась в колебаниях уровня относительной продуктивности штамма в биосинтезе антимикотических соединений.

Ключевые слова: Bacillus subtilis, дерматомицеты, микробный антагонизм, циклические липопептиды, Trichophyton, Microsporum

Дерматомикозы занимают одно из ведущих мест среди микотических инфекций [1]. Основной проблемой в терапии дерматомикозов является длительность применения синтетических антими-котических средств и возникновение побочных эффектов с одной стороны, а также формирование резистентности у патогена, с другой стороны. Помимо этого новые эффективные препараты на основе аллиламинов и азолов имеют высокую стоимость, что ограничивает их широкое применение в медицинской практике. Применение бактерий-антагонистов и их соединений, может быть одним из биотехнологических решений этой проблемы, направленных на повышение эффективности в профилактике дерматомикозов и снижение побочного влияния от применения синтетических антимикотиков.

В последние годы появляются данные о биологической активности микробов-антагонистов в отношении грибов, вызывающих различные микозы. Описаны штаммы Bacillus, проявляющие антагонистическую активность к дрожжеподобным грибам Candida albicans [2]. По результатам [3], генофонд представителей Streptomyces и Bacillus является богатым источником антигрибных антибиотиков. Из 1050 выделенных из почвы штаммов стрептомицетов 22% активно подавляли рост 12 видов возбудителей грибковых заболеваний человека и ряда грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий. Kumar с соавторами обнаружили антимикотическую активность двух штаммов Bacillus subtilis МТСС 8114 и B. subtilis 2 в отношении Microsporum fulvum и Trichophyton sp. и показали пептидную природу образуемых ими активных ме-

таболитов [4, 5]. Изучена противогрибковая активность производственных штаммов Bacillus subtilis 3 и B. licheniformis 31, представляющих собой основу пробиотиков Бактерина SL и Биоспорина (ОАО «Днепрофарм») и коллекционных культур B. subtilis 68, 69, 70 КМВБ. Штаммы B. subtilis 3, B. licheniformis 31 и B. subtilis 70 в тесте отсроченного антагонизма проявили избирательную антифунгальную активность [6]. Антагонистическая активность в отношении дерматомицетов была выявлена у клинических штаммов и морских изолятов бактерий рода Pseudomonas [7].

Следует отметить ограниченный характер исследований, касающихся поиска микроорганизмов, подавляющих рост дерматомицетов, а также изучения механизмов их активности. Необходимость восполнения данного пробела обусловлена как проблематикой эффективной борьбы с дерматоми-козами, так и наличием большого количества данных об опыте применения бактерий-антагонистов в контроле фитопатогенных грибов. Целью настоящей работы являлось исследование потенциала и особенностей взаимодействия штамма Bacillus sub-tilis IB-54, первоначально выделенного как антагониста микромицетов - возбудителей болезней сельскохозяйственных растений.

Объекты и методы исследований

В качестве основного объекта исследований использовали штамм из коллекции Института биологии Уфимского научного центра РАН Bacillus subtilis IB-54, депонированный во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-9795. Тест-объектами слу-

* автор, ответственный за переписку

720

БИОЛОГИЯ

жили клинические штаммы дерматомицетов -Microsporum canis Bodin, выделенный в Уфимском городском кожно-венерологическом диспансере и любезно предоставленный к.м.н. О. Р. Мухамадее-вой, а также Trichophyton rubrum (Castell.) Sabour. и T. gypseum (Robin) Blanchard, предоставленные д.м.н., проф. Ю. А. Медеведевым. Культуры грибов поддерживали пересевами на агаризованной среде Сабуро и КГА.

Штамм B. subtilis IB-54 поддерживали на картофельном агаре (КА). Глубинное выращивание бактерий осуществляли в питательной среде следующего состава (г*л-1): KH2PO4 - 1.0; K2HPO4-3H2O - 0.5; (NH4)2HPO4 - 0.5; MgSO4-7H2O

- 0.5; пептон ферментативный - 2.0; дрожжевой экстракт - 5.0; кукурузный экстракт - 5.0; глицерин

- 5.0. Значение рН в среде перед автоклавировани-ем - 6.6-6.7. Культивирование проводили на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 при 170 об-1 и 36.0±0.5°С в течение 72 ч.

Рост и титр бактериальной культуры оценивали по оптической плотности при 630 нм и пересевами методом предельных разведений. Антагонистическую активность B. subtilis IB-54 определяли по диаметру зон подавления дерматомицетов вокруг колоний штамма на КГА [8]. Для изучения специфичности антимикотического действия штамм выращивали совместно с дерматомицетами в среде Сабуро при статических условиях и 28 °С в течение 7 суток. Вторичные метаболиты B. subtilis ИБ-54 выделяли методом кислотного осаждения и экстракции 60% (о/о) метанолом [9]. Восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах (5*10 см) модифицированного силикагеля Kieselgel 60 F254 («Merck») в системе растворителей н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (12:4:6).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ ORIGIN 7.0 PR0. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия между сравниваемыми выборками при уровне достоверной вероятности 95% (p < 0.05).

Результаты исследований и их обсуждение

Штамм проявлял высокую антагонистическую активность в отношении тестируемых видов дерматомицетов in vitro. При глубинном выращивании бактерий в синхронной культуре с дерматомицета-ми отмечалось полное подавление роста грибов. Высокие показатели активности B. subtilis IB-54 наблюдались и в условиях совместного роста с дерматомицетами на плотных питательных средах (рис. 1). Специфические особенности действия B. subtilis IB-54 заключались в задержке или подавлении развития M. canis и T. gypseum на стадии прорастания спор и формирования ростковых трубок, тогда как у T. rubrum - на стадии ветвления. При микроскопии отмечался сходный характер реакции грибов, заключающийся в нарушении про-

растания спор и ветвления гиф, апикальном и интеркалярном формировании сферопластоподоб ных структур, отсутствии спорообразования у развившихся гиф (рис. 2).

Microsporum Trichophyton Trichophyton

canis gypseum rubrum

Рис. 1. Антагонистическая активность B. subtilis ИБ-54 и

антибиотическая активность его экзометаболитов (су-пернатант КЖ) in vitro в отношении дерматомицетов. КЖ - культуральная жидкость.

Нами были изучены особенности роста B. subtilis IB-54 и биосинтеза им антимикотических соединений в бинарных культурах с рядом дерматомицетов (рис. 3). T. gypseum был более устойчив к действию антагониста по сравнению с M. canis, что выражалось в резком увеличении его роста в варианте, предварительно инкубированным в течение 48 ч перед внесением B. subtilis IB-54. Показатели роста самого штамма снижались 10-кратно с увеличением возраста и устойчивости дерматомицетов в асинхронных бинарных культурах (рис. 3А). В бинарных культурах штамма с дерматомицетами отмечалось некоторое повышение антимикотической активности метаболитов по сравнению с контролем, в особенности, против T. rubrum (рис. 3Б). Инокуляция антагониста в более зрелые культуры дерматомицетов (48-72 ч) сопровождалась резким снижением и элиминацией синтеза антимикотических экзометаболитов, несмотря на продолжающееся ингибирование роста дерматомицетов. Уровень антимикотической активности метаболитов, образуемых в бинарных культурах, в значительной степени коррелировал с количественным выходом фракций липопептидов, выделяемых из КЖ кислотным осаждением. В то же время, в бинарных культурах штамма с грибами, несмотря на снижение титра бактерий по сравнению с контролем, продукция активных метаболитов возрастала, что указывает на специфичность взаимодействия B. subtilis IB-54 с дерматомицетами. Резкое снижение роста и активности исследуемого штамма при взаимодействии со зрелыми культурами дерматомицетов может объясняться накоплением в среде активных грибных метаболитов.

Рис. 2. Влияние B. subtilis ИБ-54 на развитие дерматомицетов на границе зоны подавления их роста на КГА (7-е сутки). Увеличение ><200. А - M. canis, Б - T. gypseum, В - T. rubrum. Стрелками обозначены сферопластоподобные структуры на

гифах грибов.

А

ИБ-54, контроль

24 ч T. gypseum + ИБ-54

0 ч T. gypseum + ИБ-54

24 ч M. canis + ИБ-54

50 100 150 200

Титр B. subtilis ИБ-54, млн. КОЕ/мл

Б

0 ч T. gypseum + ИБ-54

T. rubrum T. gypseum M. canis

л 48 ч T. gypseum + ИБ-54

и ИБ-54, контроль

24 ч T. gypseum + ИБ-54

T. gypseum, контроль

72 ч M. canis + ИБ-54 48 ч M. canis + ИБ-54

24 ч M. canis + ИБ-54 0 ч M. canis + ИБ-54

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Степень ингибирования роста дерматомицетов, %

Рис. 3. А. Интенсивность роста В. subtilis ИБ-54 в монокультуре и в смешанных культурах с дерматомицетами при статическом выращивании. Начальный титр штамма -2,36* 107 КОЕ/мл среды. Б. Антимикотическая активность экзометаболи-тов в бинарных и монокультурах В. subtilis ИБ-54 и дерматомицетов.

Дерматомицеты в монокультуре продуцировали антибактериальные метаболиты, при этом М. canis показывал более слабую активность, чем Т. gypseum. Внесение В. subtШs 1В-54 на ранних стадиях развития Т. gypseum (0-24 ч) приводило к подавлению активности гриба; успевшая же развиться более зрелая культура (48 ч), по всей видимости, аккумулировала антибактериальные вещества, приводящие к частич-

ному подавлению роста и активности антагониста. Слабо выраженная активность M. canis полностью подавлялась в присутствии антагониста вне зависимости от времени его внесения. Полученные данные свидетельствуют о наличии слабой антибактериальной активности у T. gypseum и T. rubrum, что может обуславливать их более высокую устойчивость к действию B. subtilis 1В-54по сравнению с M. canis.

0

722

БИОЛОГИЯ

Рис. 4. ТСХ липопептидных фракций активных метаболитов, выделяемых из контрольных и бинарных культур B. sub-tilis ИБ-54 и дерматомицетов. 1 - контроль M. canis; 2-5 - соответственно 0, 24, 48 и 72 ч M. canis+ИБ-54; 6 - контроль ^ gypseum; 7-9 - соответственно 0, 24 и 48 ч ^ gypseum +ИБ-54; 10 - контроль B. subtilis ИБ-54.

Для сравнительной оценки состава активных вторичных метаболитов, осаждаемых кислотой из совместных культур, мы проводили их ТСХ (рис. 4). Совместные культуры штамма с M. canis характеризовались присутствием двух сходных пептид-содержащих компонентов со значениями коэффициентов относительной подвижности 0.600.63 и 0.54-0.56, соответственно. В совместных культурах B. subtilis IB-54 с T. gypseum, как и в контроле бактерий, обнаруживались аналогичные пеп-тид-содержащие компоненты, проявляемые в виде четко дифференцируемых пятен с соответствующими коэффициентами подвижности Rf~0.60-0.61 и 0.52-0.53 (рис. 4). Интенсивность и размер этих пятен были сопоставимы с уровнем продукции ан-тимикотических соединений бациллами в бинарных культурах.

При взаимодействии штамма с 48-ч культурой T. gypseum пептид-содержащие метаболиты не обнаруживались, как и в контроле гриба, что подтверждается отсутствием роста и активности B. subtilis IB-54 в этих условиях (рис. 4). Полученные результаты свидетельствовали о сходстве в природе активных метаболитов, образуемых B. subtilis IB-54 при росте в монокультуре и при взаимодействии с дерматомицетами.

Заключение

Обнаружено, что штамм B. subtilis IB-54 проявляет конститутивную способность к синтезу антимикотических соединений, специфически изменяющемуся при взаимодействии с различными видами дерматомицетов. Одним из факторов снижения чувствительности в ряду M. canis, T. gyp-seum и T. rubrum к B. subtilis ИБ-54 является их способность к продукции антибактериальных ве-

ществ. Основную роль в подавлении дерматомицетов играет комплекс амфифильных соединений

пептидной природы.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-04-97031-р-Поволжье_а

ЛИТЕРАТУРА

1. Сергеев А. Ю., Сергеев Ю. В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. М.: БИНОМ-Пресс. 2003. 440 с.

2. Орлова М. В., Смирнова Т. А., Азизбекян Р. Р. Штаммы Bacillus, обладающие антагонистической активностью в отношении дрожжеподобных грибов Candida albicans // Успехи медицинской микологии. 2003. Т. 1. С. 104-105.

3. Воейкова Т. А., Катруха Г. С., Федорова Г. Б., Звенигородский В. И., Курбатова И. В., Кузин А. И., Азизбекян Р. Р. Изучение биологических и физико-химических свойств нового фунгицидного комплекса, выделенного из штамма Streptomyces griseinus // Успехи медицинской микологии.-2004. Т. 3. С. 77-79.

4. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. Biological control of dermatophytic fungus Trichophyton species by Bacillus subtilis // Hindustan Antibiot. Bull. 2005. V. 47-48. P. 36-40.

5. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of B. subtilis // Ind. J. Exp. Biol. 2009. V. 47, №1. P. 57-62.

6. Харченко С. Н. Антифунгальная активность некоторых пробиотиков по отношению к грибам - возбудителям микозов и микотоксикозов // Успехи медицинской микологии. 2005. Т. 5. С. 315-317.

7. Cherif A., Sadfi-Zouaoui N., Eleuch D., ben Osman Dhahri A., Boudabous A. Pseudomonas isolates have in vitro antagonistic activity against the dermatophytes Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagraphytes var interdigitale and Microsporum canis // Jornal de Mycologie Medicale. 2009. V. 19. P. 178-184.

8. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. 528 с.

9. Шульга А. Н., Елисеев С. А., Карпенко Е. В., Кирчив А. Р., Туровский А. А. Биоэмульгатор, образуемый культурой Bacillus species, и его свойства // Микробиол. журн. 1990. Т. 52. №5. С. 78-82.

Поступила в редакцию 26.08.2013 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.