CC BY
142
УДК 579.264:579.261
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ БАКТЕРИИ BACILLUS SUBTILIS С ДЕРМАТОФИТНЫМИ ГРИБАМИ
© Г. Э. Актуганов1*, А. И. Мелентьев1, Н. Ф. Галимзянова1, К. А. Лукманова2, Л. Ю. Кузьмина1, Т. Ф. Бойко1
1Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, проспект Октября, 69.
Тел.: +7 (347) 235 57 04.
E-mail: gleakt@anrb.ru 2Башкирский государственный медицинский университет Россия, Республика Башкортостан, 450077 г. Уфа, ул. Ленина, 3.
Изучены особенности антагонистического взаимодействия in vitro штамма B. subtilis IB-54 с грибами-дерматофитами видов Microsporum canis, Trichophyton gypseum и Trichophyton rubrum. Влияние бактерий проявлялось в задержке или подавлении развития грибов на стадиях прорастания спор, формирования ростковых трубок и ветвления гиф. Устойчивость к действию антагониста возрастала в ряду M. сanis - T. gypseum - T. rubrum. В то же время, интенсивность развития бактерий и их эффект существенно снижались с увеличением возраста дерматомицетов в асинхронных культурах в связи с накоплением в среде антибактериальных метаболитов. Уровень антимикотической активности бактериальных метаболитов в значительной степени коррелировал с количественным содержанием циклических липопептидов в культуральной среде. Специфика взаимодействия B. subtilis IB-54 с дер-матомицетами проявлялась в колебаниях уровня относительной продуктивности штамма в биосинтезе антимикотических соединений.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, дерматомицеты, микробный антагонизм, циклические липопептиды, Trichophyton, Microsporum
Дерматомикозы занимают одно из ведущих мест среди микотических инфекций [1]. Основной проблемой в терапии дерматомикозов является длительность применения синтетических антими-котических средств и возникновение побочных эффектов с одной стороны, а также формирование резистентности у патогена, с другой стороны. Помимо этого новые эффективные препараты на основе аллиламинов и азолов имеют высокую стоимость, что ограничивает их широкое применение в медицинской практике. Применение бактерий-антагонистов и их соединений, может быть одним из биотехнологических решений этой проблемы, направленных на повышение эффективности в профилактике дерматомикозов и снижение побочного влияния от применения синтетических антимикотиков.
В последние годы появляются данные о биологической активности микробов-антагонистов в отношении грибов, вызывающих различные микозы. Описаны штаммы Bacillus, проявляющие антагонистическую активность к дрожжеподобным грибам Candida albicans [2]. По результатам [3], генофонд представителей Streptomyces и Bacillus является богатым источником антигрибных антибиотиков. Из 1050 выделенных из почвы штаммов стрептомицетов 22% активно подавляли рост 12 видов возбудителей грибковых заболеваний человека и ряда грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий. Kumar с соавторами обнаружили антимикотическую активность двух штаммов Bacillus subtilis МТСС 8114 и B. subtilis 2 в отношении Microsporum fulvum и Trichophyton sp. и показали пептидную природу образуемых ими активных ме-
таболитов [4, 5]. Изучена противогрибковая активность производственных штаммов Bacillus subtilis 3 и B. licheniformis 31, представляющих собой основу пробиотиков Бактерина SL и Биоспорина (ОАО «Днепрофарм») и коллекционных культур B. subtilis 68, 69, 70 КМВБ. Штаммы B. subtilis 3, B. licheniformis 31 и B. subtilis 70 в тесте отсроченного антагонизма проявили избирательную антифунгальную активность [6]. Антагонистическая активность в отношении дерматомицетов была выявлена у клинических штаммов и морских изолятов бактерий рода Pseudomonas [7].
Следует отметить ограниченный характер исследований, касающихся поиска микроорганизмов, подавляющих рост дерматомицетов, а также изучения механизмов их активности. Необходимость восполнения данного пробела обусловлена как проблематикой эффективной борьбы с дерматоми-козами, так и наличием большого количества данных об опыте применения бактерий-антагонистов в контроле фитопатогенных грибов. Целью настоящей работы являлось исследование потенциала и особенностей взаимодействия штамма Bacillus sub-tilis IB-54, первоначально выделенного как антагониста микромицетов - возбудителей болезней сельскохозяйственных растений.
Объекты и методы исследований
В качестве основного объекта исследований использовали штамм из коллекции Института биологии Уфимского научного центра РАН Bacillus subtilis IB-54, депонированный во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-9795. Тест-объектами слу-
* автор, ответственный за переписку
720
БИОЛОГИЯ
жили клинические штаммы дерматомицетов -Microsporum canis Bodin, выделенный в Уфимском городском кожно-венерологическом диспансере и любезно предоставленный к.м.н. О. Р. Мухамадее-вой, а также Trichophyton rubrum (Castell.) Sabour. и T. gypseum (Robin) Blanchard, предоставленные д.м.н., проф. Ю. А. Медеведевым. Культуры грибов поддерживали пересевами на агаризованной среде Сабуро и КГА.
Штамм B. subtilis IB-54 поддерживали на картофельном агаре (КА). Глубинное выращивание бактерий осуществляли в питательной среде следующего состава (г*л-1): KH2PO4 - 1.0; K2HPO4-3H2O - 0.5; (NH4)2HPO4 - 0.5; MgSO4-7H2O
- 0.5; пептон ферментативный - 2.0; дрожжевой экстракт - 5.0; кукурузный экстракт - 5.0; глицерин
- 5.0. Значение рН в среде перед автоклавировани-ем - 6.6-6.7. Культивирование проводили на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 при 170 об-1 и 36.0±0.5°С в течение 72 ч.
Рост и титр бактериальной культуры оценивали по оптической плотности при 630 нм и пересевами методом предельных разведений. Антагонистическую активность B. subtilis IB-54 определяли по диаметру зон подавления дерматомицетов вокруг колоний штамма на КГА [8]. Для изучения специфичности антимикотического действия штамм выращивали совместно с дерматомицетами в среде Сабуро при статических условиях и 28 °С в течение 7 суток. Вторичные метаболиты B. subtilis ИБ-54 выделяли методом кислотного осаждения и экстракции 60% (о/о) метанолом [9]. Восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах (5*10 см) модифицированного силикагеля Kieselgel 60 F254 («Merck») в системе растворителей н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (12:4:6).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ ORIGIN 7.0 PR0. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия между сравниваемыми выборками при уровне достоверной вероятности 95% (p < 0.05).
Результаты исследований и их обсуждение
Штамм проявлял высокую антагонистическую активность в отношении тестируемых видов дерматомицетов in vitro. При глубинном выращивании бактерий в синхронной культуре с дерматомицета-ми отмечалось полное подавление роста грибов. Высокие показатели активности B. subtilis IB-54 наблюдались и в условиях совместного роста с дерматомицетами на плотных питательных средах (рис. 1). Специфические особенности действия B. subtilis IB-54 заключались в задержке или подавлении развития M. canis и T. gypseum на стадии прорастания спор и формирования ростковых трубок, тогда как у T. rubrum - на стадии ветвления. При микроскопии отмечался сходный характер реакции грибов, заключающийся в нарушении про-
растания спор и ветвления гиф, апикальном и интеркалярном формировании сферопластоподоб ных структур, отсутствии спорообразования у развившихся гиф (рис. 2).
Microsporum Trichophyton Trichophyton
canis gypseum rubrum
Рис. 1. Антагонистическая активность B. subtilis ИБ-54 и
антибиотическая активность его экзометаболитов (су-пернатант КЖ) in vitro в отношении дерматомицетов. КЖ - культуральная жидкость.
Нами были изучены особенности роста B. subtilis IB-54 и биосинтеза им антимикотических соединений в бинарных культурах с рядом дерматомицетов (рис. 3). T. gypseum был более устойчив к действию антагониста по сравнению с M. canis, что выражалось в резком увеличении его роста в варианте, предварительно инкубированным в течение 48 ч перед внесением B. subtilis IB-54. Показатели роста самого штамма снижались 10-кратно с увеличением возраста и устойчивости дерматомицетов в асинхронных бинарных культурах (рис. 3А). В бинарных культурах штамма с дерматомицетами отмечалось некоторое повышение антимикотической активности метаболитов по сравнению с контролем, в особенности, против T. rubrum (рис. 3Б). Инокуляция антагониста в более зрелые культуры дерматомицетов (48-72 ч) сопровождалась резким снижением и элиминацией синтеза антимикотических экзометаболитов, несмотря на продолжающееся ингибирование роста дерматомицетов. Уровень антимикотической активности метаболитов, образуемых в бинарных культурах, в значительной степени коррелировал с количественным выходом фракций липопептидов, выделяемых из КЖ кислотным осаждением. В то же время, в бинарных культурах штамма с грибами, несмотря на снижение титра бактерий по сравнению с контролем, продукция активных метаболитов возрастала, что указывает на специфичность взаимодействия B. subtilis IB-54 с дерматомицетами. Резкое снижение роста и активности исследуемого штамма при взаимодействии со зрелыми культурами дерматомицетов может объясняться накоплением в среде активных грибных метаболитов.
Рис. 2. Влияние B. subtilis ИБ-54 на развитие дерматомицетов на границе зоны подавления их роста на КГА (7-е сутки). Увеличение ><200. А - M. canis, Б - T. gypseum, В - T. rubrum. Стрелками обозначены сферопластоподобные структуры на
гифах грибов.
А
ИБ-54, контроль
24 ч T. gypseum + ИБ-54
0 ч T. gypseum + ИБ-54
24 ч M. canis + ИБ-54
50 100 150 200
Титр B. subtilis ИБ-54, млн. КОЕ/мл
Б
0 ч T. gypseum + ИБ-54
T. rubrum T. gypseum M. canis
л 48 ч T. gypseum + ИБ-54
и ИБ-54, контроль
24 ч T. gypseum + ИБ-54
T. gypseum, контроль
72 ч M. canis + ИБ-54 48 ч M. canis + ИБ-54
24 ч M. canis + ИБ-54 0 ч M. canis + ИБ-54
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Степень ингибирования роста дерматомицетов, %
Рис. 3. А. Интенсивность роста В. subtilis ИБ-54 в монокультуре и в смешанных культурах с дерматомицетами при статическом выращивании. Начальный титр штамма -2,36* 107 КОЕ/мл среды. Б. Антимикотическая активность экзометаболи-тов в бинарных и монокультурах В. subtilis ИБ-54 и дерматомицетов.
Дерматомицеты в монокультуре продуцировали антибактериальные метаболиты, при этом М. canis показывал более слабую активность, чем Т. gypseum. Внесение В. subtШs 1В-54 на ранних стадиях развития Т. gypseum (0-24 ч) приводило к подавлению активности гриба; успевшая же развиться более зрелая культура (48 ч), по всей видимости, аккумулировала антибактериальные вещества, приводящие к частич-
ному подавлению роста и активности антагониста. Слабо выраженная активность M. canis полностью подавлялась в присутствии антагониста вне зависимости от времени его внесения. Полученные данные свидетельствуют о наличии слабой антибактериальной активности у T. gypseum и T. rubrum, что может обуславливать их более высокую устойчивость к действию B. subtilis 1В-54по сравнению с M. canis.
0
722
БИОЛОГИЯ
Рис. 4. ТСХ липопептидных фракций активных метаболитов, выделяемых из контрольных и бинарных культур B. sub-tilis ИБ-54 и дерматомицетов. 1 - контроль M. canis; 2-5 - соответственно 0, 24, 48 и 72 ч M. canis+ИБ-54; 6 - контроль ^ gypseum; 7-9 - соответственно 0, 24 и 48 ч ^ gypseum +ИБ-54; 10 - контроль B. subtilis ИБ-54.
Для сравнительной оценки состава активных вторичных метаболитов, осаждаемых кислотой из совместных культур, мы проводили их ТСХ (рис. 4). Совместные культуры штамма с M. canis характеризовались присутствием двух сходных пептид-содержащих компонентов со значениями коэффициентов относительной подвижности 0.600.63 и 0.54-0.56, соответственно. В совместных культурах B. subtilis IB-54 с T. gypseum, как и в контроле бактерий, обнаруживались аналогичные пеп-тид-содержащие компоненты, проявляемые в виде четко дифференцируемых пятен с соответствующими коэффициентами подвижности Rf~0.60-0.61 и 0.52-0.53 (рис. 4). Интенсивность и размер этих пятен были сопоставимы с уровнем продукции ан-тимикотических соединений бациллами в бинарных культурах.
При взаимодействии штамма с 48-ч культурой T. gypseum пептид-содержащие метаболиты не обнаруживались, как и в контроле гриба, что подтверждается отсутствием роста и активности B. subtilis IB-54 в этих условиях (рис. 4). Полученные результаты свидетельствовали о сходстве в природе активных метаболитов, образуемых B. subtilis IB-54 при росте в монокультуре и при взаимодействии с дерматомицетами.
Заключение
Обнаружено, что штамм B. subtilis IB-54 проявляет конститутивную способность к синтезу антимикотических соединений, специфически изменяющемуся при взаимодействии с различными видами дерматомицетов. Одним из факторов снижения чувствительности в ряду M. canis, T. gyp-seum и T. rubrum к B. subtilis ИБ-54 является их способность к продукции антибактериальных ве-
ществ. Основную роль в подавлении дерматомицетов играет комплекс амфифильных соединений
пептидной природы.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-04-97031-р-Поволжье_а
ЛИТЕРАТУРА
1. Сергеев А. Ю., Сергеев Ю. В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. М.: БИНОМ-Пресс. 2003. 440 с.
2. Орлова М. В., Смирнова Т. А., Азизбекян Р. Р. Штаммы Bacillus, обладающие антагонистической активностью в отношении дрожжеподобных грибов Candida albicans // Успехи медицинской микологии. 2003. Т. 1. С. 104-105.
3. Воейкова Т. А., Катруха Г. С., Федорова Г. Б., Звенигородский В. И., Курбатова И. В., Кузин А. И., Азизбекян Р. Р. Изучение биологических и физико-химических свойств нового фунгицидного комплекса, выделенного из штамма Streptomyces griseinus // Успехи медицинской микологии.-2004. Т. 3. С. 77-79.
4. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. Biological control of dermatophytic fungus Trichophyton species by Bacillus subtilis // Hindustan Antibiot. Bull. 2005. V. 47-48. P. 36-40.
5. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of B. subtilis // Ind. J. Exp. Biol. 2009. V. 47, №1. P. 57-62.
6. Харченко С. Н. Антифунгальная активность некоторых пробиотиков по отношению к грибам - возбудителям микозов и микотоксикозов // Успехи медицинской микологии. 2005. Т. 5. С. 315-317.
7. Cherif A., Sadfi-Zouaoui N., Eleuch D., ben Osman Dhahri A., Boudabous A. Pseudomonas isolates have in vitro antagonistic activity against the dermatophytes Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagraphytes var interdigitale and Microsporum canis // Jornal de Mycologie Medicale. 2009. V. 19. P. 178-184.
8. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. 528 с.
9. Шульга А. Н., Елисеев С. А., Карпенко Е. В., Кирчив А. Р., Туровский А. А. Биоэмульгатор, образуемый культурой Bacillus species, и его свойства // Микробиол. журн. 1990. Т. 52. №5. С. 78-82.
Поступила в редакцию 26.08.2013 г.
