CC BY
22
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
исходит без физических повреждений. Использовали непредсказуемый мягкий стресс (НМС) включающий наклон клетки, лишение пищи или воды до 12 часов, ограничение подвижности на 1 час, тряска в вибрирующей установке 1 час, изъятие подстилки или мокрая подстилка. Ранее показано, что такой стресс провоцирует развитие депресивноподобного статуса у мышей и крыс. В результате было показано, что у мышей подвергшихся НМС, число метастазов опухоли Льюис в легких увеличено в 2 раза, по сравнению с контролем. Таким образом, сдвиг психоэмоционального состояния в негативную сторону оказывает влияние на процесс метастазирования. Это надо учитывать при ведении онкологических больных в клинике.
РОЛЬ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО р-ГЛИКОПРОТЕИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-КЛЕТОК ИММУННОЙ ПАМЯТИ
Раев М.Б.1, 3, Литвинова Л.С.2, Юрова К.А.2, Дунец Н.А.2, Хазиахматова О.Г.2, Тимганова В.П.1, Бочкова М.С.1, Храмцов П.В.1, 3, Заморина С.А.1, 3
1ФГБУН«Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия
2 ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия
3 ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», Пермь, Россия
Трофобластический pi-гликопротеин (ТБГ) является одним из наиболее информативных маркеров формирования и функционирования фетоплацентарной системы. Невзирая на очевидный иммунорегуляторный потенциал ТБГ, его роль в регуляции Т-клеток иммунной памяти остается неизвестной. В то же время, присутствие фетоплацентарных антигенов в период беременности, модулирует Т-клеточную память, что имеет значение для формирования иммунной толерантности, а также для последующей беременности (Keiffer T.E. et al., 2016). Можно предположить, что ТБГ регулирует функциональную активность циркулирующего пула T-клеток памяти, потенциально способных к осуществлению антиген-специфических цитотоксических реакций в отношении антигенов эмбрионального происхождения.
Цель. Оценка роли ТБГ в регуляции экспрессии маркеров активации (CD25, CD28, CD71) и продукции IL-2 изолированной субпопуляцией Т-клеток памяти в системе in vitro.
Материалы и методы. Аутентичный нативный ТБГ человека получали авторским методом (Патент РФ № 2367449, Раев М.Б.). Монокультуры Т-клеток памяти (CD45RO+) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием технологии MACS® ("Miltenyi Biotec", Германия) из суспензии МПК здоровых доноров (n = 8). Выделенные клетки с фенотипом CD45RO+ (1 х 106кл/мл) культивировали в 48-луночных планшетах в полной питательной среде в течение 48 ч при 37 °С, 5% С02. В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали T-Cell Activation/Expansion Kit human (анти-CD2/CD3/CD28 комплекс) (Miltenyi Biotec, Германия). Определение поверхностных молекул костимуляции и активации (CD71 FITC, CD8 PE, CD25 PE-Cy 5.5, CD28PE Cy7, CD4 APC, Miltenyi Biotec, Германия) на CD45RO+Т-клетках проводили на проточном цитофлуо-
риметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Содержание IL-2 в культуральных супернатантах оценивали иммуноферментным методом при помощи тест-систем «Вектор-Бест» (Россия). Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного ¿-критерия Стью-дента.
Результаты. Первым этапом анализа данных стала оценка дифференцировки Т-клеток памяти (CD45RO+) по субпопуляциям CD4+ и CD8+. Установлено, что изолированные СD45RA-клетки в контрольных пробах имели следующее соотношение: CD4+ 68,12±4,11; CD8+ 25,95±5,32; CD4+CD8+ 0,549±0,161. Установлено, что ТБГ (10, 100 мкг/мл) снижал экспрессию CD25 в гейте CD45RO+CD4+ лимфоцитов, активированных анти-CD2/CD3/CD28 комплексом, но не влиял на экспрессию CD28 и CD71 этими клетками. Как известно, CD25 (а-цепь рецептора для IL-2) представляет собой маркер активации и тесно связан с продукцией IL-2. Одновременно ТБГ стимулировал аутокринную продукцию IL-2 CD45RO+ клетками, но это не приводило к усилению экспрессии CD25. IL-2 необходим для развития Т-регуляторных лимфоцитов, увеличение количества которых ассоциировано с успешной беременностью (Shumacher A et.al., 2009) и, возможно, именно они являются «мишенью» для IL-2, продуцируемого CD45RO-клетками под воздействием ТБГ. Важно отметить, что депрессивные эффекты ТБГ реализовались только на уровне CD4+ лимфоцитов, не затрагивая субпопуляцию CD8+, что согласуется с данными Keiffer T.E. (2016).
Таким образом, впервые установлена роль ТБГ в регуляции активности Т-клеток иммунной памяти, ассоциированная с подавлением экспрессии активационного маркера CD25 и стимуляцией продукции этими клетками IL-2. Полученные данные расширяют представления о роли ТБГ в формировании иммунной толерантности в период беременности.
Исследование поддержано грантом РФФИ 16-44-0049 и программой повышения конкурентноспособности («дорожной карты») и субсидии «Организация проведения научных исследований 20.4986.2017/ВУ» БФУ им. И. Канта.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЛИКАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ПАТТЕРНА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА
Рапопорт Е.М., Моисеева Е.В., Хайдуков С.В., Аронов Д.А., Пазынина Г.В., Цыганкова С.В., Бовин Н.В.
ФГБУН «Институт биоорганической химии
им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова»
РАН, Москва, Россия
Введение. В последнее время все большее значение приобретают исследования по созданию универсальных вакцин, направленных на активацию дендритных клеток (ДК). Особенно привлекательно использовать ДК в качестве мишени в вакцинах для терапии инфекционных заболеваний, вызванных бактериями и вирусами, которые характеризуются высокой генетической изменчивостью. У вирусов и бактерий ДК распознают патоген-ассоции-рованные молекулярные структуры (ПАМС). Дополнительная нагрузка вакцин лигандами лектинов, связывание последних с соответствующими ПАМС может при-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
вести к активации эндоцитоза ДК чужеродного антигена (Lepenies et al., 2013; van Kooyk et al., 2013).
Недавно мы провели картирование клеток крови человека с помощью библиотеки флуоресцеин-меченых полиакриламидных гликоконъюгатов (гликопроб), синтезированных в Лаборатории углеводов ИБХ РАН. Из 230 исследованных гликопроб было выбрано восемь, с которыми связывалось более 15% популяции лейкоцитов крови человека, содержащей циркулирующие дендритные клетки (цДК) и «неклассические» моноциты (нМо). Дальнейшее исследование показало, что нМо связываются с 4-O-Su-GalNAcb1-4GlcNAcb (4'-O-Su-LacdiNAc), цДК — с Man-содержащими гликанами: Mana1-3(Mana1-6)Manb (Man)3, (Galb1-4GlcNAcb1-2Mana)23,6-Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb и Mana1-3(Mana1-6)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb, а также с три-сиалозидом (Neu5Aca-8)3 и дисахаридом GalNAca1-3Galb (Adi) (Rapoport et al., 2017). Анализ данных о локализации и специфичности лектинов позволил нам предположить, что мишенями выбранных гликанов в составе вакцин могут быть макрофагальный галактозосвязывающий лектин, MGL (Adi), сиглек-7 ((Neu5Aca2-8)3) и дектин-2 (Man-содержащие гликаны). Мы полагаем, что эти гли-каны могут быть использованы в качестве дополнительных векторов для улучшения доставки вакцины к ДК.
В экспериментах in vivo терапевтическое действие вакцин часто исследуется на мышиных моделях. В связи с этим целью данной работы было провести сравнительный анализ гликан-связывающего профиля популяции, содержащей цДК и нМо, в крови человека и мыши.
Методы. Сначала, используя боковое светорассеяние (SSC) и экспрессию CD45 на лейкоцитах, в периферической крови мыши были гейтированы моноциты, затем была локализована популяция клеток, экспрессирующая CD14low- to- negCD80+CD16+, содержащая цДК и нМо. Далее исследовалось связывание этих клеток с гликопробами, которые были выбраны нами при скрининге этой же популяции в крови человека (van Kooyk et al., 2013).
Результаты. 1) Из восьми гликопроб, с которыми связывалось более 15% популяции цДК+нМо человека, для четырех уровни связывания цДК+нМо мыши были тоже высокие, а именно для Аа
Mana1-3(Mana1-6)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb, (Neu5Aca-8)3 и 4'-O-Su-LacdiNAc, с последним связываются нМо, а не цДК (Rapoport et al., 2017). 2) Наиболее высокий уровень связывания (более 50%) популяции цДК+нМо человека выявлен с гликопробой Adi, цДК+нМо мыши связывались с этой гликопробой слабее. По-видимому, это объясняется различной углеводной специфичностью MGL человека и его мышиных гомологов MGL1 и MGL2.
Заключение. Гликан-связывающий профиль мыши и человека не идентичен, что должно учитываться при исследовании механизмов терапевтического действия вакцины, содержащей гликановый вектор, на мышах in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований — № 1604-01084 и гранта UniVaxA "Universal influenza vaccine through synthetic dendritic cell-targeted self-replicating RNA vaccines" (№ 601738).
РЕГУЛЯТОРНЫЕ КЛЕТКИ В КОНТРОЛЕ ИММУННОГО ОТВЕТА И ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ЛЕГКИХ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ
Рубакова Э.И., Капина М.А., Логунова H.H., Майоров К.Б., Апт А.С.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Считается, что Т-лимфоциты CD4+, вырабатывающие IFNy, и интерстициальные легочные макрофаги, активированные этим цитокином, играют главную роль в защите от хронической туберкулезной инфекции (ТБ), которая развивается в тех случаях, когда факторы естественной резистентности не справились с инфекцией в самой ранней фазе. В этих случаях инфекционный процесс в легких чаще всего сопровождается избыточным воспалением и разрушением легочной ткани. Контроль за этими угрожающими жизни процессами осуществляется разными типами клеток, среди которых следует отметить регуляторные клетки: дендритные клетки (DCreg) и Т-клетки (Treg). В многочисленных работах нашей группы было показано, что особой склонностью к воспалению легочной ткани и ее избыточной инфильтрации различными лимфоидными клетками отличаются генетически чувствительные к ТБ мыши линии I/St. Ранее мы охарактеризовали влияние DCreg на иммунный ответ резистентных и чувствительных к ТБ мышей в клеточных культурах in vitro, где DCreg получали из высоко очищенных клеток костного мозга Lin- после 6-дневного культивирования с клетками стромы легкого (Kapina et al., 2013). Нами было показано, что DCreg резистентных к туберкулезу мышей C57BL/6 подавляют пролифератив-ный ответ Т-клеток значительно сильнее, чем такие же клетки мышей линии I/St.
Получив результаты, указывающие на возможную связь между избыточным, плохо регулируемым воспалением у чувствительных к инфекции животных с количественным и функциональным недостатком регуля-торных клеток, мы попытались ограничить избыточный ответ в легких зараженных мышей I/St линии внутривенным введением регуляторных дендритных клеток (DCreg). Мышей I/St заражали аэрогенным введением микобактерий (M. tuberculosis H37Rv, 102/мышь), через 2-3 недели после заражения вводили выращенные in vitro клетки DCreg (1 х 106/мышь). Через 2 недели определяли в легких количество эффекторных T-клеток CD4+CD25+FoxP3- и регуляторных Т-клеток (Treg) с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+, продукцию цитокинов, гистологические изменения и количество микобактерий. Контрольными группами служили мыши, которым вводили выделенные из костного мозга и очищенные миело-идные клетки фенотипа CDllb+, и зараженные животные без введения клеток.
Введение DCreg мышам улучшало морфологическую картину в легких по сравнению с контрольными животными, на порядок снижало количество микобактерий в легких, в 2 раза увеличивало количество регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и уменьшало количество нейтрофилов в легких. При введении регуляторных дендритных клеток (DCreg) в легких этих мышей уменьшалась продукция IFNy и IL-10, в то время как продукция TGF-ß и IL-6 не изменялась. Продолжительность жизни животных при введении DCreg достоверно не увеличивалась.
