CC BY
30
18. Guan J.L., Shalloway D. Regulation of focal adhesion-associated protein tyrosine kinase by both cellular adhesion and oncogenic transformation, Nature. 1992; 358: 690—2.
19. Wang H.B., Dembo M., Hanks S.K., Wang Y. Focal adhesion kinase is involved in mechanosensing during fibroblast migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001; 98: 11295— 300.
20. Webb D.J., Brown C.M. Epi-Fluorescence Microscopy. Meth. Mol. Boil. (Clifton, NJ). 2013; 931: 29—59.
21. Costa M., Marchi M., Cardarelli F., Roy A., Beltram F., Maffei L., Michele G. Ratto Dynamic regulation of ERK2 nuclear translocation and mobility in living cells. J. Cell Sci. 2006; 119: 4952—63.
22. Bustin S.A., Benes V., Nolan T., and Pfaffl M.W. Quantitative realtime RT-PCR — a perspective. J. Mol. Endocrinol. 2005; 34(3): 597—601.
23. Hinz B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. J. Invest. Dermatol. 2007; 127(3): 526—37.
24. Wang J.H., Thampatty B.P., Lin J.S., Im H.J. Mechanoregulation of gene expression in fibroblasts. Gene. 2007; 391(1-2): 1—15.
25. Ghosh A.K., Yuan W., Mori Y., Chen S., Varga J. Antagonistic regulation of type I collagen gene expression by interferon-gamma and transforming growth factor-beta. Integration at the level of p300/CBP transcriptional coactivators. J. Biol. Chem. 2001; 276: 11041—8.
26. Blanchette F., Day R., Dong W., Laprise M.-H., Dubois C.M. TGF-
ORIGINAL ARTICLE
beta-1 regulates gene expression of its own converting enzyme furin. J. Clin. Invest. 1997; 99: 1974-83.
27. D'Ambrosio D.N., Walewski J.L., Clugston R.D., Berk P.D., Rippe R.A., Blaner W.S. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 2011; 6(9): e24993.
28. Grotendorst G.R., Duncan M.R. Individual domains of connective tissue growth factor regulate fibroblast proliferation and myofibroblast differentiation. FASEB J. 2005; 19(7): 729—38.
29. Simmons J.G., Pucilowska J.B., Keku T.O., Lund P.K. IGF-I and TGF-beta1 have distinct effects on phenotype and proliferation of intestinal fibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002; 283(3): 809—18.
30. Chuderland D., Seger R. Protein-protein interactions in the regulation of the extracellular signal-regulated kinase. Mol. Biotechnol. 2005; 29: 57—74.
31. Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C.J. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell. 1994; 77: 841—52.
32. Conner S.R., Scott G., Aplin A.E. Adhesion-dependent activation of the ERK1/2 cascade is by-passed in melanoma cells. J. Biol. Chem. 2003; 278(36): 34548—54.
Поступила 19.12.16 Принята в печать 14.04.17
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 612.018.2:577.175.327].08
Заморина С.А.1-3, Литвинова Л.С.2, Юрова К.А.2, Дунец НА.2, Хазиахматова О.Г.2, Тимгано-ва В.П.1, Бочкова М.С.1, Храмцов П.В.13, Раев М.Б.13
ХОРИОНИЧЕСКИЙ ГОНАДОТРОПИН КАК ФАКТОР, РЕГУЛИРУЮЩИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т-КЛЕТОК ИММУННОЙ ПАМЯТИ
1 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» Уральского отделения Российской Академии наук, 614081, г Пермь, Россия;
2 ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет им. И. Канта», 236016, г Калининград, Россия
3 ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», 614990, г Пермь, Россия
Изучали роль хорионического гонадотропина (ХГ) в регуляции процессов, определяющих функциональную активность наивных Т-клеток, и Т-клетки памяти в системе in vitro. Показано, что ХГ в концентрациях, соответствующих физиологической беременности (10 и 100 МЕ/мл), угнетал экспрессию активационных маркеров CD28 и CD25 как наивными Т-клетками (CD45RA+), так и Т-клетками памяти (CD45RO+). Депрессивные эффекты ХГ реализовались только на уровне CD4+-лимфоцитов, не затрагивая субпопуляцию CD8+. В то же время ХГ не влиял на экспрессию маркера пролиферации CD71 наивными Т-клетками и Т-клетками памяти. Таким образом, впервые установлена роль ХГ в регуляции активности Т-клеток иммунной памяти, ассоциированная с подавлением экспрессии акти-вационных маркеров CD28 и CD25. Полученные данные расширяют представления о роли ХГ в формировании иммунной толерантности в период беременности.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин; иммунная толерантность; Т-клетки памяти; беременность. Для цитирования: Заморина С.А., Литвинова Л.С., Юрова К.А., Дунец Н.А., Хазиахматова О.Г., Тимганова В.П., Бочкова М.С., Храмцов П.В., Раев М.Б. Хорионический гонадотропин как фактор, регулирующий функциональную активность Т-клеток иммунной памяти. Иммунология. 2017; 38(4): 179-184. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-179-184
Zamorina S.A. 13, Litvinova L.S.2, Yurova K.A.2, Dunets N.A.2, Khaziakhmatova O.G.2, Timganova V.P.1, Bochkova M.S.1, Khramtsov P. V.2, Rayev M.B.1,3.
HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN AS A FACTOR REGULATING FUNCTIONAL ACTIVITY OF IMMUNE MEMORY T-CELLS
Для корреспонденции: Заморина Светлана Анатольевна, д-р биол. наук, вед. научн. сотр. лаборатории экологической иммунологии, E-mail: mantissa7@mail.ru.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS, 614081, Perm;
2 Immanuel Kant Baltic Federal University, 236016, Kaliningrad;
3 Perm State National Research University, 614990, Perm
The role of human chorionic gonadotropin (hCG) was analyzed in regulation the processes determining the functional activity of naïve T-cells and memory T-cells in in vitro system. It was demonstrated that hCG in concentrations equivalent to those in physiological pregnancy (10 and 100 IU/ml) suppressed the expression of CD28 and CD25 activation markers by both naïve T-cells (CD45RA+) and memory T-cells (CD45RO+). hCG depressive effects were only realized at the level of CD4+-lymphocytes, but not at CD8+ subset. In doing so hCG did not affect the expression of CD71 proliferation marker by naïve T-cells and memory T-cells. Therefore, it is established for the first time the hCG role in regulation of immune memory T-cells and it is associated with the suppression of the CD28 and CD25 activation marker expression. The data obtained widen the view on the hCG role in the formation of immune tolerance in pregnancy.
Keywords: chorionic gonadotropin; immune tolerance; T-cells memory; pregnancy.
For citation: Zamorina S.A., Litvinova L.S., Yurova K.A., Dunets N.A., Khaziakhmatova O.G., Timganova V.P., Bochkova M.S., Khramtsov P. V., Rayev M.B. Human chorionic gonadotropin as a factor regulating functional activity of immune memory T-cells. Immunologiya. 2017; 38(4): 179-184. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-179-184 For correspondence: Zamorina Svetlana A., Dr. Biol. Sci., leading researcher of laboratory of ecological immunology, E-mail: mantissa7@mail.ru.
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 16.02.17 Accepted 14.04.17
введение
Во время беременности иммунная система женщины претерпевает изменения, направленные на формирование иммунной толерантности к полуаллогенному эмбриону. Неадекватная регуляция иммунного ответа матери приводит к патологическим состояниям во время беременности — от бесплодия и рекуррентных самопроизвольных абортов до преждевременных родов и преэклампсии [1]. Очевидно, что не только доминирование Т-хелперов 2-го типа (ТЬ2) над ТЫ, но и регуляторные Т-лимфоциты (Т^) играют важную роль во время беременности. Хотя количество и функциональная активность повышены во время нормальной беременности, — не единственная популяция клеток, выполняющая супрессорную функцию на периферии и в децидуальной оболочке. В частности, регуляторные В-лимфоциты вносят свой вклад в развитие иммунной толерантности посредством секреции ГЬ-10 [2]. Помимо этого, ^-17-продуцирующие лимфоциты (ТЫ7), моноциты/макрофаги, 1Ж- и 1ЖТ-клетки также рассматриваются с точки зрения факторов, формирующих иммунную толерантность в период беременности [2]. Тем не менее, влияние беременности на Т-клетки иммунной памяти до сих пор недостаточно изучены. Очевидно, что постоянное воздействие фетоплацентарных антигенов модулирует Т-клеточную память, что может играть важную роль в формировании иммунной толерантности и иметь значение для последующей беременности [3].
В литературе имеются единичные работы по диффе-ренцировке Т-клеток памяти в период беременности [3, 4], а данные о функциональной активности Т-клеток памяти под воздействием белков зоны беременности отсутствуют. В то же время вполне логично предположить, что в период беременности в периферической крови действуют факторы, приводящие к снижению активности циркулирующего пула Т-клеток памяти, способных к осуществлению антиген-специфических цитотоксических реакций в отношении антигенов эмбрионального происхождения.
Известно, что уровень функциональной активности Т-клеток определяется стадией их дифференцировки, которая характеризуется экспрессией широкого спектра функциональных и адгезионных молекул [5]. Изучение диффе-ренцировки Т-клеток памяти прежде всего связано с оценкой экспрессии различных изоформ молекулы CD45. Молекула CD45 — трансмембранная тирозиновая протеинфосфатаза, а ее экспрессия на иммунокомпетентных клетках — критический регулятор сигнализации, опосредованной Т-клеточным
рецептором (TCR) [6]. Дифференцировка Т-клеток затрагивает структуру внеклеточного домена CD45: в наивных клетках это полная форма (CD45RA, 220 кДа) по мере ан-тигензависимой дифференцировки ряд доменов теряется, а продукт конечной модификации обозначают как CD45RO (180 кДа). Т-лимфоциты, экспрессирующие CD45RA+, позиционируются как «наивные» Т-клетки, а экспрессирующие CD45RO+ — как antigen experience, т. е. клетки после контакта с антигеном, которые также называют «примированными» Т-клетками памяти [7].
Наивные Т-клетки, экспрессирующие высокомолекулярные изоформы CD45, имеют высокую фосфатазную активность и поддерживают Т-клеточный рецептор (TCR) в активном состоянии для распознавания антигена [6]. Помимо этого, одна из функций CD45 — связывание TCR с корецеп-торами, CD4 или CD8, и участие таким образом в клеточной сигнализации [8]. В целом активация наивных Т-клеток требует вовлечения TCR и ряда костимулирующих молекул и сопровождается переходом к низкомолекулярным изоформам CD45—CD45RO. Низкомолекулярная модификация CD45RO имеет относительно низкую фосфатазную активность и предположительно способствует ослаблению Т-клеточной сигнализации [8]. Быстрый и усиленный ответ CD45RO+-клеток памяти на специфический антиген — их важнейшее функциональное отличие от «наивных» Т-клеток [9].
Плацентарный гормон хорионический гонадотропин (ХГ) обладает плейотропными эффектами, реализуемыми эндокринным, аутокринным и паракринным путем. ХГ регулирует стероидогенез плаценты и плода, инвазию трофобласта [10], запускает процессы ангиогенеза [11] и децидуализацию эндометрия [12].
Максимальная концентрация ХГ в период гестации (~100 МЕ/мл) совпадает с экспрессией антигенов MHC I класса на клеточной поверхности эмбриона (I триместр), распознавание которых, как правило, приводит к процессам иммунного отторжения [13]. Известно, что полиморфизмы в структуре генов (CGB5 и CGB8) — субъединицы ХГ ассоциированы с рекуррентными самопроизвольными абортами [14]. Относительно недавно стало известно, что некоторые миссенс-мутации в структуре этих генов приводят к неадекватной сборке субъединиц гормона с последующей потерей его биологической активности, вследствие чего у носительниц таких миссенс-мутаций в анамнезе верифицируются рекуррентные самопроизвольные аборты [15].
ХГ считается одним из основных факторов, формирую-
щих иммунную толерантность во время беременности [16, 17]. Известно, что ХГ участвует в формировании необходимого баланса между субпопуляциями Th1/Th2 [18] и Treg/ Th17 [19] в период беременности, модулируя также активность NK-, NKT-клеток [20], B-лимфоцитов [21] и клеток моноцитарно-макрофагального ряда [22]. При этом роль ХГ в процессах дифференцировки Т-клеток памяти не исследована.
Цель работы — изучение влияния ХГ на экспрессию маркеров активации изолированными наивными Т-клетками и Т-клетками иммунной памяти в системе in vitro.
Материал и методы
Исследование проводилось согласно Хельсинкской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г., получено разрешение этического комитета ИЭГМ УрО РАН (Пермь) от 12.06.2016.
Объекты исследования. В работе использовали фракционированные мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) практически здоровых доноров, небеременных женщин репродуктивного возраста (n = 13). МПК получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) (Pharmacia, Швеция). Экспериментальная модель, используемая в работе, представляет собой получение изолированных фракций наивных Т-клеток и Т-клеток памяти и культивирование их с исследуемым гормоном в условиях активации с последующей оценкой экспрессии активационных маркеров [23].
Сепарирование CD45RA+ и CD45RO+-клеток. Для получения монокультур наивных Т-клеток (CD45RA+) из суспензии МПК, был использован метод иммуномагнитной сепарации, в основе которого лежит технология MACS (Miltenyi Biotec, Германия), основанная на суперпарамагнитных биодеградируемых частицах MACS MicroBeads, конъю-гированных с моноклональными антителами. Добавленные к взвеси клеток MicroBeads/CD45RA-частицы связываются с соответствующими рецепторами на поверхности клеток. После связывания клетки пропускаются через колонки MACS, заполненные ферромагнитным матриксом и помещённые в сепаратор MACS, генерирующий сильное магнитное поле. Клетки, связавшиеся с MicroBeads, фиксируются в колонке, а не связавшиеся с MicroBeads — удаляются путем промывания извлечённой из магнитного поля колонки и позиционируются как негативная фракция. Именно из неё 2-м этапом выделяли CD45RO+-клетки при помощи соответствующих MicroBeads/CD45RO-частиц.
Выделенные клетки с фенотипом CD45RA+ и/или CD45RO+ отмывали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США) и оценивали количество с помощью автоматического счётчика клеток (Countess Automated Cell Counter, InVitrogen, США) с использованием красителя Trypan blue 0,4% (InVitrogen, США). Жизнеспособность составляла не менее 95—98% общего числа клеток. Отсутствие моноцитов ^D14+) и В-лимфоцитов (CD19+) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток до культивирования подтверждали с помощью анализа поверхностных маркеров на проточном цитофлуо-риметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия), согласно протоколам производителей. В эксперименте использовали клеточные культуры, содержание CD3+CD45RA+CD14-CD19-и CD3+CD45RO+CD14-CD19- Т-клеток в которых составляло в среднем 98,5 ± 1,5%.
Культивирование CD45RA+ и CD45RO+-клеток. CD45RA+ и/или CD45RO+ клетки (Ы06 кл/мл) культивировали в 48-луночных планшетах в полной питательной среде (ППС): RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), с добавлением 10% ЭТС (Sigma, США), 10 мМ Hepes (ICN Ph., США), 2 мМ L-глутамина (CN Ph., США) 5Ч0-5 М ß-меркаптоэтанола (Acros Organics, США) и 30 мкг/мл гентамицина (KRKA,
ORIGINAL ARTICLE
Словения) в течение 48 ч при 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. В качестве контроля использовали образец, где вместо гормона добавляли ППС.
В работе использовали физиологические концентрации ХГ («Московский эндокринный завод», Россия) 10 и 100 МЕ/ мл, приближенные к его содержанию в периферической крови во II—III и I триместр беременности соответственно [24].
В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ac/Exp) (Miltenyi Biotec, Германия) — антибиотиновые частицы MACSiBead с био-тинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+ человека. Нагруженные антителами частицы MACSiBead имитируют присутствие антигенпрезентирующих клеток и активируют Т-клетки. Реагент Ac/Exp в количестве 5 мкл добавляли в пробы, которые содержали 0,5Ч06 нагруженных антителами MACSiBead частиц. Соотношение клеток и активирующих частиц составляло 2:1.
Определение поверхностныгх молекул костимуляции и активации (CD25, CD28, CD71) на CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетках методом проточной цитометрии. Иммунофе-нотипирование клеток проводили с использованием коктейлей моноклональных антител (CD71 FITC, CD8 PE, CD25 PE-Cy 5.5, CD28PE Cy7, CD4 APC, Miltenyi Biotec, Германия), приготовленных ex tempore. Измерение образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Результаты цитометри-ческого анализа проанализированы с помощью программы KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США).
Статистическую обработку данных проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики с использованием парного t-критерия Стьюдента.
результаты и обсуждение
Для оценки эффектов ХГ на наивные Т-клетки и Т-клетки памяти использовали активационную модель, которая отражает процесс взаимодействия Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки с антиген-презентирующими клетками (АПК). Присутствие в культуре частиц, имитирующих АПК (Ac/Exp), активирует Т-клетки через молекулы CD2, CD3 и CD28. Вследствие этого формируется иммунный синапс, и регулируются такие процессы, как активация, дифференци-ровка и пролиферация лимфоцитов. Такой подход позволяет в контролируемых условиях исследовать разные аспекты функциональной деятельности Т-клеток памяти.
Первым этапом анализа данных стала дифференцировка наивных Т-клеток (CD45RA+) и Т-клеток памяти (CD45RO+) по субпопуляциям CD4+ и CD8+. При дифференцировке тар-гетных субпопуляций по поверхностным маркерам CD4/ CD8 установлено, что изолированные CD45RA-клетки в контрольной пробе (Ac/Exp+ХГ-) имели следующее соотношение: CD4+ 36,22 ± 7,09; CD8+ 36,11 ± 11,89; CD4+CD8+ 1,92 ± 0,82, а изолированные CD45RО-клетки CD4+ 67,32 ± 6,41; CD8+ 24,95 ± 5,41; CD4+CD8+ 0,739 ± 0,281. Таким образом, во фракции изолированных «наивных» Т-лимфоцитов соотношение CD4 и CD8 составляет примерно 1:1, в то время как во фракции Т-клеток памяти преобладают CD4+-лимфоциты (соотношение CD4/CD8 составило 2,6:1).
В наших экспериментах экспрессия CD28, CD25 и CD71 оценивалась спустя 48 ч после активации клеток Ac/ Exp (CD2/CD3/CD28). Присутствие активатора не оказывало влияние на экспрессию CD28 в контрольных образцах CD45RO+ и СD45RA+-фракций клеток (табл. 1, 2). Вероятно, это связано с тем, что CD28 относительно быстро интерна-лизуется и обновляется на поверхности клетки. Присутствие активатора достоверно повышало экспрессию CD71 в субпопуляциях CD45RA+CD4+-, CD45RO+CD4+- и CD45RO+CD8+-лимфоцитов. Активация клеток приводила также к повышению экспрессии CD25 во всех исследуемых субпопуляциях в контрольных пробах (см. табл. 1, 2).
Иммунология. 2017; 38(4)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-179-184 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
содержание CD28, CD25, CD71-позитивных клеток (%) в культурах CD45RA+-лимфоцитов, дифференцированных по субпопуляциям CD4+ и CD8+, инкубируемых с Т-клеточным активатором (Ac/Exp) и разными концентрациями ХГ (п = 13, М ± т)
Экспериментальное воз- CD45RA+CD4+ CD45RA+CD8+
действие CD28+ CD25+ CD71+ CD28+ CD25+ CD71+
Интактная проба 38,16 ± 7,25 0,71 ± 0,40 2,36 ± 0,90 14,54 ± 2,80 0,14 ± 0,07 1,94 ± 0,65
Контроль + Ac/Exp 44,72 ± 13,59 22,24 ± 5,13 6,36 ± 2,20 16,44 ± 3,16 20,84 ± 2,33 1,41 ± 0,46
ХГ 10 МЕ/мл + Ac/Exp 34,44 ± 7,55 Р < 0,05(2-1) 16,96 ± 3,63 Р < 0,05(2-1) 5,93 ± 1,33 15,86 ± 3,03 Р < 0,05(2-1) 18,59 ± 4,23 2,67 ± 1,60
ХГ 100 МЕ/мл + Ac/Exp Р < 0,05(3-2) 33,16 ± 6,74 Р < 0,05(3-2) 15,67 ± 3,11 Р < 0,05(3-2) 6,31 ± 1,93 15,71 ± 3,66 19,04 ± 4,82 2,48 ± 1,18
Примечание. Здесь и в табл. 2 показаны только достоверные (р < 0,05) различия по /-критерию Стьюдента.
Таблица 2
содержание CD28, CD25, CD71-позитивных клеток (%) в культурах CD45RO+-лимфоцитов, дифференцированных по субпопуляциям CD4+ и CD8+, инкубируемых с Т-клеточным активатором (Ac/Exp) и разными концентрациями ХГ (п = 13, М ± т)
Экспериментальное воздействие CD45RO+CD4+ CD45RO+CD8+
CD28+ CD25+ CD28+ CD25+ CD28+ CD25+
Интактная проба 66,23 ± 6,01 2,21 ± 0,73 66,23 ± 6,01 2,21 ± 0,73 66,23 ± 6,01 2,21 ± 0,73
Контроль + Ac/Exp 69,77 ± 4,21 27,71 ± 8,07 69,77 ± 4,21 27,71 ± 8,07 69,77 ± 4,21 27,71 ± 8,07
Р < 0,05(2-1) Р < 0,05(2-1) Р < 0,05(2-1)
ХГ 10 МЕ/мл + Ac/Exp 61,95 ± 6,50 19,42 ± 6,20 61,95 ± 6,50 19,42 ± 6,20 61,95 ± 6,50 19,42 ± 6,20
Р < 0,05(3-2) Р < 0,05(3-2) Р < 0,05(3-2) Р < 0,05(3-2) Р < 0,05(3-2) Р < 0,05(3-2)
ХГ 100 МЕ/мл + Ac/Exp 60,57 ± 8,06 21,44 ± 5,07 60,57 ± 8,06 21,44 ± 5,07 60,57 ± 8,06 21,44 ± 5,07
_Р < 0,05(3-2_Р < 0,05(3-2)_Р < 0,05(3-2)_Р < 0,05(3-2)_Р < 0,05(3-2)_Р < 0,05(3-2)
Влияние ХГ на экспрессию CD25 (а) и CD28 (б) CD4+-лимфоциraми изолированных CD45RO-^eTOK.
а — гистограммы отражают влияние ХГ на количество СВ4+СБ28+-клеток в культуре изолированных Т-клеток памяти (CD45RO+) на примере одного эксперимента. В правом верхнем квадранте указан процент CD4+CD28+-клеток. По оси X — интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE-Cy7); по оси Y — интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); б — гистограммы отражают влияние ХГ на количество CD4+CD25+-клеток в культуре изолированных Т-клеток памяти (CD45RO+) на примере одного эксперимента. В правом верхнем квадранте указан процент CD4+CD25+-клеток. По оси X — интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание APC); по оси Y — интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC).
Установлено, что ХГ не влиял на экспрессию CD71 во фракциях CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов независимо от принадлежности к CD4 или CD8-субпопуляциям (см. табл. 1, 2). Молекула CD71 представляет собой рецептор к транс-феррину, обеспечивающий поступление Fe в клетки, и экс-прессирующийся на пролиферирующих клетках [25]. Таким образом, пролиферативная активность CD45RA+ и CD45RO+ лимфоцитов, связанная с мембранной экспрессией молекулы CD71, оказалась резистентна к действию ХГ.
В отношении активационных маркеров показано, что ХГ снижал экспрессию CD28 и CD25 в активированных CD45RA+CD4+-лимфоцитах, не влияя на экспрессию этих маркеров в гейте CD8+-лимфоцитов (см. табл. 1). Таким образом, на уровне наивных Т-клеток ХГ угнетал экспрессию активационных маркеров CD25 и CD28 в гейте CD4+-лимфоцитов, что, по-видимому, в ситуации in vivo может приводить к снижению функциональной активности этих клеток.
Установлено, что в отношении Т-клеток памяти (CD45RO+) ХГ производил аналогичный эффект, угнетая экспрессию CD28 и CD25 в субпопуляции CD4-лимфоцитов (см. табл. 2, рисунок). Таким образом, гормон в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл, экстраполированных со II—III и I триместра беременности соответственно, подавлял экспрессию CD25 и CD28 на уровне CD4+-лимфоцитов, не влияя на ак-тивационный статус CD8+-лимфоцитов. Важно отметить, что не выявлено дозовой зависимости в реализации депрессивных эффектов ХГ на экспрессию CD25 и CD28.
Молекула CD28 конститутивно экспрессируется на всех наивных (CD45RA+) Т-клетках и является первичным коре-цептором, опосредующим их позитивную костимуляцию, играя важную и сложную роль в контроле иммунного го-меостаза [25, 26]. Очевидно, что снижение экспрессии CD28 может приводить к снижению функциональной активности Т-клеток, так как эта молекула участвует в формировании иммунного синапса, взаимодействуя с CD80/86 (В7) на поверхности АПК. Формирование полноценного иммунного синапса приводит к антиген-специфической клональной экспансии Т-лимфоцитов. В контексте полученных результатов можно предположить, что в ситуации in vivo снижение экспрессии CD28 на CD4+-лимфоцитах под воздействием ХГ приводит к подавлению иммунного ответа на фетоплацен-тарные антигены.
CD25 (a-цепь рецептора для IL-2) представляет собой маркер активации и неразрывно связан с продукцией IL-2 [25]. Экспрессия CD25 считается ранним маркером активации и отражает способность клетки к дифференцировке и пролиферации. Активация CD28 затрагивает механизмы, опосредующие повышение синтеза IL-2 и Т-клеточную пролиферацию. Очевидно, что эти процессы должны подавляться в период гестации в интересах полуаллогенного эмбриона. Тот факт, что ХГ подавляет экспрессию этих маркеров, логично встраивается в концепцию механизма формирования иммунной толерантности в период беременности.
В 2017 г. T. Keiffer и соавт. показали, что физиологическая беременность не влияет на количество периферических CD8+-лимфоцитов памяти (CD45RO+CD8+), но существенно регулирует функции CD4+-лимфоцитов памяти. В частности, во время беременности достоверно повышается количество так называемых эффекторных Т-клеток памяти (CD45RO+CD4+CCR7-), а спустя 18 мес после родов показано повышение количества эффекторных (CD45RO+CD4+CCR7-) и центральных Т-клеток памяти (CD45RO+CD4+CCR7+) [3]. Авторы считают, что гипотеза о том, что во время беременности генерируются долгоживущие Т-клетки памяти, специфичные к фетоплацентарным антигенам, подтверждается этими исследованиями. Мы предполагаем, что белки и гормоны, ассоциированные с беременностью, служат одним из факторов, не позволяющих сформироваться и реализоваться иммунному
ORIGINAL ARTICLE
ответу на фетоплацентарные антигены. Особенно это касается ХГ, играющего важную роль в формировании иммунной толерантности в период беременности. Выявленные эффекты затрагивали только субпопуляцию ОБ4+-клеток, но не CD8+-лимфоцитов, что согласуется с данными T. Keiffer [3].
Заключение
Впервые установлена роль ХГ в регуляции активности Т-клеток иммунной памяти, ассоциированная с подавлением экспрессии активационных маркеров CD28 и CD25 на CD45RO+CD4+-клетках. Полученные данные расширяют представления о формировании иммунной толерантности в период беременности и о роли ХГ в этом процессе.
Финансирование. Исследование поддержано грантом РФФИ 16-44-0049 «Роль белков, ассоциированных с беременностью, в регуляции молекулярно-генетических механизмов дифференцировки Т-клеток иммунной памяти» и субсидией «Организация проведения научных исследований» (№ 603, БФУ им. И. Канта).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
6. Кудрявцев И.В. T-клетки памяти: основные популяции и стадии дифференцировки. Российский иммунологический журнал. 2014; 8(4): 947—964.
17. Куклина Е.М., Ширшев С.В. Репродуктивные гормоны в контроле баланса ТН1/ТН2-цитокинов. Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2005; 3: 273—80.
18. Заморина С.А., Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин — фактор индукции иммунной толерантности при беременности. Иммунология. 2013; 34(2): 105—7.
19. Заморина С.А., Горбунова О.Л., Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин как регулятор фенотипического созревания интакт-ных и интерлейкин- 2-активированных NK- и NKT-клеток. Вестник Пермского университета. Серия: Биология. 2010; 1: 77—80.
23. Гуцол А.А., Сохоневич Н.А., Селедцов В.И., Литвинова Л.С. Влияние дексаметазона на активацию и пролиферацию т-клеток иммунной памяти. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; 155(4): 468—70. 25. Литвинова Л.С., Гуцол А.А., Сохоневич Н.А., Кофанова К.А., Хазиахматова О.Г., Шуплецова В.В. и др. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов. Медицинская иммунология. 2014; 6(1): 7—26.
references
1. Nair R.R., Verma P., Singh K. Immune-endocrine crosstalk during pregnancy. Gen. Comp. Endocrinol. 2017; 242: 18—23.
2. Ghaebi M., Nouri M., Ghasemzadeh A., Farzadi L., Jadidi-Niaragh F., Ahmadi M., Yousefi M. Immune regulatory network in successful pregnancy and reproductive failures. Biomed Pharmacother. 2017; 88: 61—73.
3. Kieffer Т.Е., Faas M.M., Scherjon S.A., Prins J.R. Pregnancy persistently affects memory T cell populations. J. Reprod Immunol. 2016; 119: 1—8.
4. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Ann. Rev. oflmmunol. 2004; 22: 745—63.
5. McNeill L., Salmond R.J., Cooper J.C., Carret C.K., Cassady-Cain R.L., Roche-Molina M., Tandon P., Holmes N., Alexander D.R. The differential regulation of Lck kinase phosphorylation sites by CD45 is critical for T cell receptor signaling responses. Immunity. 2007; 27(3): 425—37.
6. Kudryavtsev I.V. T-cells memory: major populations and stages diferentsirovki. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8(4): 947—64. (in Russian)
7. Holmes N. CD45: all is not yet crystal clear. Immunology. 2006; 117(2): 145—55.
8. Elyaman W., Kivisakk P., Reddy J., Chitnis T., Raddassi K., Imitola J., Bradshaw E., Kuchroo V.K., Yagita H., Sayegh M.H., Khoury S.J. Distinct functions of autoreactive memory and effector CD4+ T
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Am. J. Pathol. 2008; 173(2): 411—22. 9. Guibourdenche J., Handschuh K., Tsatsaris V., Gerbaud P., Leguy M.C., Muller F., Brion D.E., Fournier T. Hyperglycosylated hCG is a marker of early human trophoblast invasion. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2010; 95: E240—E244.
10. Zygmunt M., Herr F., Keller-Schoenwetter S., Kunzi-Rapp K., Munstedt K., Rao C.V., Lang U., Preissner K.T. Characterization of human chorionic gonadotropin as a novel angiogenic factor. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002; 87: 5290—6.
11. Kajihara T., Uchino S., Suzuki M., Itakura A., Brosens J.J., Ishihara
0. Human chorionic gonadotropin confers resistance to oxidative stress-induced apoptosis in decidualizing human endometrial stromal cells. Fertil. Steril. 2010; 95: 1302—7.
12. Schumacher A., Brachwitz N., Sohr S., Engeland K., Langwisch S., Dolaptchieva M., Alexander T., Taran A. et. al. Human chorionic gonadotropin attracts regulatory T cells into the fetal-maternal interface during early human pregnancy. J. Immunol. 2009; 182: 5488—97.
13. Rull K., Nagirnaja L., Ulander V.M., Kelgo P., Margus T., Kaare M., Aittomäki K., Laan M. Chorionic gonadotropin beta-gene variants are associated with recurrent miscarriage in two European populations. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008; 93(12): 4697—706.
14. Nagirnaja L., Venclovas C., Rull K., Jonas K.C., Peltoketo H., Christiansen O.B., Kairys V., Kivi G., Steffensen R., Huhtaniemi
1.T., Laan M. Structural and functional analysis of rare missense mutations in human chorionic gonadotrophin ß-subunit. Mol. Hum. Reprod. 2012; 18(8): 379—90.
15. Tsampalas M., Gridelet V., Berndt S., Foidart J.M., Geenen V., Perrier d'Hauterive S. Human chorionic gonadotropin: a hormone with immunological and angiogenic properties. J. Reprod. Immunol. 2010; 85(1): 93—8.
16. Schumacher A., Heinze K., Witte J., Poloski E., Linzke N., Woidacki K., Zenclussen A.C. Human chorionic gonadotropin as a central regulator of pregnancy immune tolerance. J Immunol. 2013; 190(6): 2650—8. doi: 10.4049/jimmunol.1202698.
17. Kuklina Ye.M., Shirshev S.V. Reproductive hormones in controlling the balance of TH1 / TH2-cytokine. Izvestiya Rossiyskoy akademii nauk. Seriya biologicheskaya. 2005; 3: 273—80. (in Russian)
18. Zamorina S.A., Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin — a factor inducing immune tolerance in pregnancy. Immunologiya. 2013; 34(2): 105—7. (in Russian)
19. Zamorina S.A., Gorbunova O.L., Shirshev S.V. Chorionic gonadotropin as a regulator of the phenotypic maturation of intact and interleukin-2-activated NK- and NKT-cells. Vestnik Permskogo Universiteta. Seriya: Biologiya. 2010; 1: 77—80. (in Russian)
20. Fettke F., Schumacher A., Canellada A., Toledo N., Bekeredjian-Ding I., Bondt A., Wuhrer M., Costa S.D., Zenclussen A.C. Maternal and Fetal Mechanisms of B Cell Regulation during Pregnancy: Human Chorionic Gonadotropin Stimulates B Cells to Produce IL-10 While Alpha-Fetoprotein Drives Them into Apoptosis. Front. Immunol. 2016; 7: 495.
21. Dominique D., Ehrentraut S., Langwisch S., Zenclussen A.C., Schumacher A. Immune modulatory effects of human chorionic gonadotropin on dendritic cells Supporting Fetal Survival in Murine Pregnancy. Frontiers in Endocrinology. 2016; 7: 1—11.
22. Cole L.A. HCG, the wonder oftoday's science. Reproductive Biology and Endocrinology. 2012; 10(24): 1—18.
23. Gutsol A.A., Sokhonevich N.A., Seledtsov V.I., Litvinova L.S. Influence of dexamethasone on the activation and proliferation of immune memory T-cells. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2013; 155(4): 468—70. (in Russian)
24. Shipkova M., Wieland E. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation. Clin. Chim. Acta. 2012; 413(17-18): 1338—49.
25. Litvinova L.S., Gutsol A.A., Sokhonevich N.A., Kofanova K.A., Khaziakhmatova O.G., Shupletsova V.V., Kaygorodova Ye.V., GoncharovA.G. The main functional surface markers ofT-lymphocytes. Meditsinskaya immunologiya. 2014; 6(1): 7—26. (in Russian)
Поступила 16.02.17 Принята в печать 14.04.17
ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.361.4-013.3
Хаитов Р.М.1, Алексеев Л.П.1, Трофимов Д.Ю.1, Кофиади И.В.1, Алексеева П.Л.2 ИММУНОГЕНЕТИКА И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
1 ФГБУ «ГНЦ — Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва;
2 Институт государства и права РАН, 119019, Москва
Рассмотрено современное состояние проблемы клинической трансплантации КСК/КМ в России и за её рубежами. Обозначены основные организационные и правовые причины отставания России в этой важнейшей для здравоохранения и биобезопасности отрасли высокотехнологичной прикладной медицины.
Ключевые слова: иммуногенетика; трансплантация кроветворных стволовых клеток.
Для цитирования: Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Кофиади И.В., Алексеева П.Л. Иммуногенетика и трансплантация кроветворных стволовых клеток. Иммунология. 2017; 38(4): 184-192. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-184-192
Khaitov R.M.1, Alekseev L.P.1, Trofimov D.Yu.1, Kofiadi I.V.1, Alekseeva P.L.2 IMMUNOGENETICS AND TRANSPLANTATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS
1 «State scientific center — Institute of immunology» FMBA of Russia, 115478, Moscow;
2 Institute of state and law of Russian Academy of Sciences, 119019, Moscow
The modern condition problems of clinical transplantation KSK/KM in Russia and abroad. Identified the main organizational and legal reasons for the lag of Russia in this critical health and Biosafety sector of applied high-tech medicine.
Keywords: immunogenetics; transplantation of hematopoietic stem cells.
Для корреспонденции: Алексеев Леонид Петрович, д-р мед. наук. проф., зам. директора по научной работе и инновационной деятельности. E-mail: l.p.alexeev@mail.ru
