CC BY
24
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
вести к активации эндоцитоза ДК чужеродного антигена (Lepenies et al., 2013; van Kooyk et al., 2013).
Недавно мы провели картирование клеток крови человека с помощью библиотеки флуоресцеин-меченых полиакриламидных гликоконъюгатов (гликопроб), синтезированных в Лаборатории углеводов ИБХ РАН. Из 230 исследованных гликопроб было выбрано восемь, с которыми связывалось более 15% популяции лейкоцитов крови человека, содержащей циркулирующие дендритные клетки (цДК) и «неклассические» моноциты (нМо). Дальнейшее исследование показало, что нМо связываются с 4-O-Su-GalNAcb1-4GlcNAcb (4'-O-Su-LacdiNAc), цДК — с Man-содержащими гликанами: Mana1-3(Mana1-6)Manb (Man)3, (Galb1-4GlcNAcb1-2Mana)23,6-Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb и Mana1-3(Mana1-6)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb, а также с три-сиалозидом (Neu5Aca-8)3 и дисахаридом GalNAca1-3Galb (Adi) (Rapoport et al., 2017). Анализ данных о локализации и специфичности лектинов позволил нам предположить, что мишенями выбранных гликанов в составе вакцин могут быть макрофагальный галактозосвязывающий лектин, MGL (Adi), сиглек-7 ((Neu5Aca2-8)3) и дектин-2 (Man-содержащие гликаны). Мы полагаем, что эти гли-каны могут быть использованы в качестве дополнительных векторов для улучшения доставки вакцины к ДК.
В экспериментах in vivo терапевтическое действие вакцин часто исследуется на мышиных моделях. В связи с этим целью данной работы было провести сравнительный анализ гликан-связывающего профиля популяции, содержащей цДК и нМо, в крови человека и мыши.
Методы. Сначала, используя боковое светорассеяние (SSC) и экспрессию CD45 на лейкоцитах, в периферической крови мыши были гейтированы моноциты, затем была локализована популяция клеток, экспрессирующая CD14low- to- negCD80+CD16+, содержащая цДК и нМо. Далее исследовалось связывание этих клеток с гликопробами, которые были выбраны нами при скрининге этой же популяции в крови человека (van Kooyk et al., 2013).
Результаты. 1) Из восьми гликопроб, с которыми связывалось более 15% популяции цДК+нМо человека, для четырех уровни связывания цДК+нМо мыши были тоже высокие, а именно для Аа
Mana1-3(Mana1-6)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAcb, (Neu5Aca-8)3 и 4'-O-Su-LacdiNAc, с последним связываются нМо, а не цДК (Rapoport et al., 2017). 2) Наиболее высокий уровень связывания (более 50%) популяции цДК+нМо человека выявлен с гликопробой Adi, цДК+нМо мыши связывались с этой гликопробой слабее. По-видимому, это объясняется различной углеводной специфичностью MGL человека и его мышиных гомологов MGL1 и MGL2.
Заключение. Гликан-связывающий профиль мыши и человека не идентичен, что должно учитываться при исследовании механизмов терапевтического действия вакцины, содержащей гликановый вектор, на мышах in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований — № 1604-01084 и гранта UniVaxA "Universal influenza vaccine through synthetic dendritic cell-targeted self-replicating RNA vaccines" (№ 601738).
РЕГУЛЯТОРНЫЕ КЛЕТКИ В КОНТРОЛЕ ИММУННОГО ОТВЕТА И ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ЛЕГКИХ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ
Рубакова Э.И., Капина М.А., Логунова H.H., Майоров К.Б., Апт А.С.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Считается, что Т-лимфоциты CD4+, вырабатывающие IFNy, и интерстициальные легочные макрофаги, активированные этим цитокином, играют главную роль в защите от хронической туберкулезной инфекции (ТБ), которая развивается в тех случаях, когда факторы естественной резистентности не справились с инфекцией в самой ранней фазе. В этих случаях инфекционный процесс в легких чаще всего сопровождается избыточным воспалением и разрушением легочной ткани. Контроль за этими угрожающими жизни процессами осуществляется разными типами клеток, среди которых следует отметить регуляторные клетки: дендритные клетки (DCreg) и Т-клетки (Treg). В многочисленных работах нашей группы было показано, что особой склонностью к воспалению легочной ткани и ее избыточной инфильтрации различными лимфоидными клетками отличаются генетически чувствительные к ТБ мыши линии I/St. Ранее мы охарактеризовали влияние DCreg на иммунный ответ резистентных и чувствительных к ТБ мышей в клеточных культурах in vitro, где DCreg получали из высоко очищенных клеток костного мозга Lin- после 6-дневного культивирования с клетками стромы легкого (Kapina et al., 2013). Нами было показано, что DCreg резистентных к туберкулезу мышей C57BL/6 подавляют пролифератив-ный ответ Т-клеток значительно сильнее, чем такие же клетки мышей линии I/St.
Получив результаты, указывающие на возможную связь между избыточным, плохо регулируемым воспалением у чувствительных к инфекции животных с количественным и функциональным недостатком регуля-торных клеток, мы попытались ограничить избыточный ответ в легких зараженных мышей I/St линии внутривенным введением регуляторных дендритных клеток (DCreg). Мышей I/St заражали аэрогенным введением микобактерий (M. tuberculosis H37Rv, 102/мышь), через 2-3 недели после заражения вводили выращенные in vitro клетки DCreg (1 х 106/мышь). Через 2 недели определяли в легких количество эффекторных T-клеток CD4+CD25+FoxP3- и регуляторных Т-клеток (Treg) с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+, продукцию цитокинов, гистологические изменения и количество микобактерий. Контрольными группами служили мыши, которым вводили выделенные из костного мозга и очищенные миело-идные клетки фенотипа CDllb+, и зараженные животные без введения клеток.
Введение DCreg мышам улучшало морфологическую картину в легких по сравнению с контрольными животными, на порядок снижало количество микобактерий в легких, в 2 раза увеличивало количество регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и уменьшало количество нейтрофилов в легких. При введении регуляторных дендритных клеток (DCreg) в легких этих мышей уменьшалась продукция IFNy и IL-10, в то время как продукция TGF-ß и IL-6 не изменялась. Продолжительность жизни животных при введении DCreg достоверно не увеличивалась.
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
Таким образом, было установлено, что регуляторные клетки действительно принимают участие в сдерживании патологического процесса при инфекции, но модуляция инфекционного процесса с помощью клеточной терапии является очень сложной задачей, решение которой требует, как минимум, детальных знаний о динамике воспалительного процесса, и кратности введения клеток.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского Научного Фонда 15-15-30020.
ВЛИЯНИЕ СЕМАФОРИНА 3А НА ФУНКЦИИ ТИМОЦИТОВ МЫШИ
Рутто К.В., Кудрявцев И.В., Людыно В.И., Киселева Е.П.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Семафорин ЗА (Sema 3A) известен как фактор, направляющий рост аксонов. Однако действие этого фактора гораздо шире и затрагивает клетки иммунной системы. В тимусе он синтезируется эпителиальными клетками и регулирует процесс адгезии тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса человека (Lepelletier Y., 2007).
Цель. Изучение влияния Sema ЗА на пролиферацию, миграцию и адгезию тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса мыши.
Адгезию тимоцитов проводили на двух линиях эпителия тимуса мыши — кортикального cTEC1-2 и медуллярного mTEC3-10 (Kasai M. et al., 1996). Пролиферацию ти-моцитов изучали в присутствии конканавалина А (Con А) и без него с помощью МТТ-теста и визуального подсчета клеток. Миграцию тимоцитов мыши изучали с использованием поликарбонатных вставок с диаметром пор 5 мкм 24-луночного формата (Kim C. et al., 1998).
На первоначальном этапе исследований с использованием реакции обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) было выявлено, что тимоциты экспрессируют мРНК следующих рецепторов Sema ЗА: PlexA1, PlexA2, PlexA3 и Nrp-1. При исследовании поверхностной экспрессии рецепторов с помощью проточной цитометрии среди тимоцитов было выявлено 37,5% PlexA1+ клеток и 89,8% Nrp-1+ клеток. Полученные данные указывают на то, что тимоциты могут служить мишенями для действия Sema 3A.
С помощью MTT-теста было показано, что Sema ЗА снижает митоген-индуцированную пролиферацию ти-моцитов в концентрациях 100 нг/мл (ОП570 в контроле - 0,285±0,014, n = 6; с Sema ЗА - 0,236±0,013, n = 5, p < 0,05) и 200 нг/мл (ОП570 в контроле - 0,З17±0,021, n = 6; с Sema ЗА - 0,24З±0,011, n = 6, p < 0,05). Полученные данные подтвердились при визуальном подсчёте клеток (в контроле - 4,82±0,09 млн/мл, n = З; с Sema ЗА 100 нг/мл - 4,28±0,06 млн/мл, n = З, p < 0,05; с Sema ЗА 200 нг/мл -З,48±0,11 млн/мл, n = З, p < 0,05).
Далее было показано, что Sema ЗА в концентрациях 10-200 нг/мл дозозависимо ингибировал адгезию тимо-цитов к обеим клеточным линиям (при З0 и 120 мин инкубации) с максимальны эффектом в концентрации 200 нг/мл. Чтобы выяснить, какие клетки являются мишенью действия Sema ЗА, тимоциты и эпителиальные клетки прединкубировали раздельно с Sema ЗА (200 нг/мл) в течение 2 ч, после чего клетки отмывали З раза и проводили
адгезию в течение 30 мин. Ингибирующий эффект Sema 3A сохранялся только при предварительной обработке тимоцитов, как на cTEC1-2 (индекс адгезии в контроле 33,12±0,57 n = 10; с Sema 3A 28,4±1,6 n = 10, p < 0,05), так и на mTEC3-10 (в контроле 39,66±0,82 n = 8; с Sema 3A 32,53±0,76 n = 10, p < 0,001). При этом предобработка Sema 3A клеток эпителия эффекта не давала. Обработка тимоцитов блокирующими антителами к Nrp-1 полностью отменяла ингибирующий эффект 200 нг/мл Sema 3A на адгезию тимоцитов к кортикальным (индекс адгезии в контроле 43,96±1,85 n = 6; с Sema 3A 21,58±9,96 n = 6; с Sema 3A и антителами к Nrp-1 — 42,67±1,33 n = 6, p < 0,001) и медуллярным клеткам (в контроле: 28,85±1,10 n = 6; с Sema 3A 24,40±1,59 n = 6; с Sema 3A и антителами к Nrp-1: 32,54±1,95 n = 6, p < 0,05). Таким образом, ингибирующий эффект Sema 3A был связан с его действием на тимоциты, а не на клетки эпителия, и опосредован через рецептор Nrp-1 на тимоцитах.
Кроме того, Sema 3A в концентрации 100 нг/мл оказывал хеморепеллентный эффект в отношении тимоцитов, а предобработка тимоцитов антителами к Nrp-1 отменяла эффект Sema 3A (индекс миграции в контроле 1,49±0,01 n = 5; с Sema 3A 0,65±0,08 n = 5, p < 0,001; с Sema 3A и антителами к Nrp-1 - 1,21±0,08 n = 5, p < 0,01).
Таким образом, были получены новые данные о влиянии Sema3A на пролиферацию, миграцию тимоцитов мыши и их адгезию к эпителиальным клеткам тимуса, имеющие значение для лучшего понимания процесса созревания Т-лимфоцитов.
Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-06150.
ЛПС-СТИМУЛИРОВАННЫЕ МАКРОФАГИ МИГРИРУЮТ В ТИМУС И ИНДУЦИРУЮТ АПОПТОЗ ТИМОЦИТОВ
Семенова М.А., Сергеев В.Г.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет» Ижевск, Россия ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», Ижевск, Россия
Введение. Представление о роли тимуса в иммунологических механизмах инфекционных заболеваний ограничивается представлением о закономерной акциден-тальной инволюции этого органа в ходе формирования адаптационного синдрома в ответ на действие стрессор-ных инфекционных агентов. Наряду с данными о прямом атрофическом действии на тимус гормонов надпочечников, появляется информация о том, что и сами бактериальные агенты через клеточное опосредование влияют на интенсивность гибели тимоцитов. Важную роль в механизмах такого взаимодействия могут играть макрофаги, которые, как показали последние исследования, способны проникать в тимус после нагрузки антигеном на периферии и вызывать селективную клональную делецию тимоцитов, имеющих рецепторы к данному антигену.
Однако из этих экспериментов остается неясным ограничено ли их действие только делецией относительно зрелых антигенспецифических Т-клеток мозгового вещества, или мигрирующие в тимус макрофаги способны к индукции апоптоза малодифференцированных тимоцитов корковой зоны, т.е. участвовать в процессе атрофии тимуса. Для ответа на этот вопрос мы провели эксперимент, целью которого явилась оценка интенсивности
