CC BY
56УДК 619:615:616.98:578.825.1:576.3.809.33
сравнительное изучение Влияния различных инактивантов на вирус болезни ауески при промышленном производстве вакцины
1А.Я.Самуйленко - доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАН;
1О.Ю.Федорова - соискатель; 1Н.В.Мельник - доктор ветеринарных наук, профессор;
1С.А.Гринь - доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН;
1Р.Н.Мельник - кандидат биологических наук; 2И.Ю.Литенкова - кандидат ветеринарных наук.
1ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», пос. Биокомбината (141142, Московская область, пос. Биокомбината,
тел.: +7(496) 567-32-63, е-mail: [email protected]).
2ФКП «Щелковский биокомбинат», пос. Биокомбината (141142, Московская область, пос. Биокомбината, тел.: +7(495) 134-58-85, e-mail: [email protected]).
Приведены результаты исследования влияния различных инактивантов на вирус болезни Ауески, которые в дальнейшем были использованы при разработке в промышленном производстве вакцины против болезни Ауески инактивированной эмульгированной маркированной на ФКП «Щелковском биокомбинате», совместно со специалистами ВНИТИБП, которая индуцирует выработку иммунитета у вакцинированных животных к gB антигену, и не вызывает образование антител к делеционному gEантигену. При разработке вакцины, одним из важных моментов была отработка методики инактивации вируса с таким расчетом, чтобы после инактивации не была потеряна антигенность действующего вещества - инактивированного вируса и, в тоже время вакцина должна быть безвредной, ареактогенной. Разработанная технология изготовления «Вакцины против болезни Ауески инактивированной эмульгированной маркированной» позволяет получать авирулентную, иммуногенную вакцину, способную профилактировать распространение этой болезни среди восприимчивых животных.
клюЧЕВЫЕ СлоВА: вакцина, вирус болезни Ауески, монослойно-суспензионная сублиния клеток, инактивация, маркированный штамм, формальдегид, димерэтиленимин, В-пропиолактон, аттенуиро-ванный штамм, питательные среды, диспергирующие смеси, растворы.
Болезнь Ауески (БА, псевдобешенство) - высоко контагиозное заболевание продуктивных и непродуктивных животных. Заболевание вызывается вирусом, относящимся к семейству Негрезу^ае, подсемейству МрИаИегрезуИпае. Инфицирование ВБА молодняка животных, приводит к 80-90% гибели, инфицирование взрослых свиней не приводит к гибели животных, но сопровождается установлением длительного или пожизненного вирусоносительства [2, 4].
Вакцинопрофилактика является основным методом защиты от этого заболевания, снижая клиническое проявление заболевания и достаточно эффективно препятствуя его распространению [3].
В настоящее время для борьбы с этой инфекцией широко используются как лиофилизированные - живые вакцины, содержащие аттенуированные штаммы вируса болезни Ауески (ВБА), так и инактивированные [5].
Используемые в РФ для профилактической вакцинации против ВБА биопрепараты иммуногенны, обеспечивают выработку напряженного иммунного ответа у вакцинированных животных, однако, учитывая широкое распространение этой инфекции и скрытое течение болезни, для профилактической вакцинации пред-
почтение следует отдавать вакцинам, изготовленным из инактивированного антигена, полученного на основе маркированного штамма [6]. Маркированные штаммы получены путем делеции генов, кодирующих один из гликопротеинов вируса - дЕ, дС или дв. При иммунизации такими вакцинами у животных не образуются антитела против отсутствующего гликопротеина -«маркера». [1]. Инфицирование вакцинированных животных полевыми вирусными штаммами, имеющими весь набор гликопротеинов, индуцирует образование антител против «маркерного» гликопротеина. Таким образом, по наличию или отсутствию антител к «маркерному» гликопротеину можно дифференцировать антитела к полевому или вакцинному вирусу. Именно на этом различии построены программы мониторинга и ликвидации данного заболевания во многих странах с передовым, развитым свиноводством, что позволяет серологически отличать вакцинированных животных от инфицированных полевыми штаммами особей [7].
Цель работы - Подбор инактиванта и отработка методики инактивации ВБА при промышленном производстве инактивированной эмульгированной маркированной вакцины.
Материалы и методы. Для получения вирусного материала использовали перевиваемую культуру мо-нослойно-суспензионную линию клеток ВНК-21/13-13.
Культуру клеток выращивали пристеночным способом в культуральных флаконах, площадью 25 см2, 75 см2 или 300 см2 или в роллерных флаконах 0,5 л; 1,0 л; 2,0 л; 5,0 л в термостатах при температуре 37,5±0,50С, используя ростовую среду Игла ДМЕМ (рН 7,2) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота. Посевная концентрация клеток составляла 200 тыс./см3. Время формирования монослоя 48 ч, индекс пролиферации составлял 1:4. Концентрацию клеток в суспензии подсчитывали с помощью камеры Горяева для подсчета форменных элементов крови. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли при подсчете клеток с, окрашиванием по общепринятой методике.
Для получения посевных расплодок вируса использовали 2-х суточную культуру клеток с полным монослоем. Из роллерных флаконов или матрасов со сформированным монослоем сливали ростовую среду, однократно отмывали монослой клеток раствором Хенксс рН 7,4.
Предварительно лиофилизированный вирус из 3-х ампул с активностью 1080 ТЦД50/см3 растворяли поддерживающей средой, и заражали монослойную культуру клеток вирус содержащей жидкостью. Два матраса с культурой клеток оставляли не зараженными для контроля.
Для адсорбции вируса зараженные культуры помещали в термостат при температуре 37,50С на 40 мин, после чего в культуральные флаконы добавляли 250 см3 поддерживающей среды. Зараженную и контрольную культуру клеток инкубировали при температуре 37,50С.
Контроль за интенсивностью размножения вируса в культуре клеток осуществляли путем учета цитопати-ческого действия (ЦПД) вируса под световым микроскопом. ЦПД вируса появлялось через 24-48 ч в виде округления клеток и появления в них зернистости.
Инфекционную активность вируса устанавливали методом титрования по цитопатическому действию /ТЦД50/см3/ на перевиваемых культурах клеток ВНК-21/13-13.
Титрование вируса проводили микрометодом в десятикратном разведение на 96-ти луночных микро-плашкахс сформированном монослое клеток.
На каждое разведение использовали по 4 лунки, в каждую лунку вносили по 100 мкл вируса начиная с наименьшего разведения. Для контроля использовали 4 лунки незараженной культуры клеток.
Планшеты с зараженными и контрольными клетками помещали в СО2 термостат и выдерживали при тем-
пературе 37,50С в течение 5 сут, ежедневно просматривая их под микроскопом на наличие ЦПД вируса.
Учет инфекционной активности аттенуированного штамма ВБА проводили по методу Рида и Менча.
Режимы инактивации вируса отрабатывали с разными концентрациями инактивантов (формальдегид, димерэтиленимин, 6-пропиолактон).
Полноту инактивации проверяли на культуре клеток ВНК-21/13-13 в 3-х последовательных пассажей, оценивая полноту инактивации вируса по цитопатиче-скому действию на культуре клеток.
Культуральные флаконы с полностью сформированным монослоем, предварительно отмывали от ростовой среды, вносили проверяемый инактивиро-ванный вирус болезни Ауески и ставили на контакт в течение часа при температуре 370С, затем клеточный монослой заливали поддерживающей средой и инкубировали при 370С в течение 7 дней, ежедневно проводя микроскопию для выявления цитопатогенного действия вируса. Для подтверждения эффективности инактивации вируссодержащей суспензиии для исключения неспецифической дегенерации монослоя использовали по 3 культуральных флакона на одну пробу и по 3 культуральных флакона брали для контроля культуры клеток. Для проведения последующего пассажа, культуру клеток, инфицированную инакти-вированным вирусом, замораживали при минус 200С в течение 24 ч, для более полного выхода вируса из клеток и затем размораживали и заражали культуру клеток вирусной суспензией, проводя 2 последовательных пассажа.
Для обработки результатов использовали статистические методы, используемые в биологии.
Результаты исследований. Приготовив посевные расплодки вируса, отработав дозу заражения и определив способ культивирования, приступили к массовой наработке материала для подбора инакти-ванта и отработки методики инактивации вируса.
Для инактивации использовали вирусный материал с титром инфекционной активности 8,0 1д ТЦД50/см3.
Отрабатывали режим инактивации вируса БА с использованием инактивантов:
- формальдегид;
- димерэтиленимин (ДЭИ);
- 6-пропиолактон.
Для инактивации вируса БА формальдегидом, формалин вносили в вирусную суспензию до конечного содержания в продукте 0,12% и 0,3%. Инактивацию вируса проводили при рН 7,6 и температуре 37,00С в течение 72 ч с периодическим перемешиванием суспензии. После окончания инактивации суспензию охлаждали до (4-6)0С, и брали пробы на выявление полноты инактивации.
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 2/2018
При проверке полноты инактивации инактивиро-ванного в концентрации 0,3% формальдегидом ВБА на первом пассаже в культуре ВНК-21/13-13 было выявлено ЦПД вируса, дальнейшие пассажи не проводили. Инактивация вируса формальдегидом в концентрации 0,12% на культуре клеток ВНК-21/13-13 в 3-х последовательных пассажей ЦПД не было обнаружено.
Для инактивации вируса из 15% раствора ДЭИ готовили непосредственно перед применением 5% водный раствор инактиванта с рН 7,8. Вирусную суспензию тщательно перемешивали, устанавливали рН в пределах 7,6 и вносили ДЭИ в концентрации конечного продукта: 0,01%, 0,02%, 0,03%. Инактивацию вели с периодическим перемешиванием при температуре 20±0,50С; 37,00С; рН 7,6 в течение 24 часов. После окончания инактивации суспензию охлаждали до (4-6)0С, и брали пробы на выявление полноты инактивации на культуре клеток ВНК-21/13-13.
При проверке инактивированного ВБА ДЭИ в концентрации 0,01% на первом пассаже в культуре ВНК-21/13-13 было выявлено ЦПД, дальнейшие пассажи не проводили. При проверки инактивированного ВБА ДЭИ в концентрации 0,02% и 0,03% на культуре клеток ВНК-21/13-13 в 3-х последовательных пассажей ЦПД было не выявлено.
Для инактивации антигена 13-пропиолактоном при температуре 4-60С ВБА предварительно охлаждали до 40С и при непрерывном помешивании добавляли инакти-вант в конечной концентрации 0,025% и 0,5%. Инактивацию проводили при температуре 4-60С в течение 20 часов. После окончания инактивации брали пробы на выявление полноты инактивации на культуре клеток ВНК-21/13-13.
При проверке инактивированного ВБА 6-пропи-олактономв концентрации 0,5% на первом пассаже в культуре ВНК-21/13-13 было выявлено ЦПД, дальнейшие пассажи не проводили. При проверки инакти-вированного ВБА 6-пропиолактоном в концентрации 0,025%на культуре клеток ВНК-21/13-13в 3-х последовательных пассажей ЦПД было не выявлено.
Проведенные испытания показали, что для инак-тивацииВБА можно использовать формалин в концентрации в продукте 0,12%, 6-пропиолактоном в концентрации в продукте 0,025%, а для ДЭИ оптимальной концентрацией инактиванта является 0,02%.
В результате проведенных исследований было
принято решение использовать на ФКП «Щелковский биокомбинат» для получения опытно-промышленной серий вакцин против ВБА инактивант ДЭИ, учитывая тот факт, что фармальдегид в состваве вакцины может привести к её реактогенности, а инактивация 13-про-пиолактоном технологически сложна в связи с резким падением значения концентрации ионов водорода.
Получение опытно-промышленных серий вакцины. Подбор адъювантов. Компоновка вакцины. Испытание клинической эффективности.
Для получения опытных серий вакцины, инактиви-рованный вирус БА с инфекционной активностью до инактивации 8,0 1д ТЦД50/см3 эмульгировали в масляном адъюванте Монтанид 1БД-206 (серии вакцин №1 и №2).
Испытания проводили на клинически здоровых подсвинках массой не менее 35-40 кг из хозяйств, в которых не проводилась вакцинация против болезни Ауески. До вакцинации животных выдерживали в карантинных условиях до 4 дней.
У животных проводили забор крови до вакцинации и после вакцинации через 21 дней для определения титра сыворотка и постановка ИФА на наборах дВ-специфиче-ских и дЕ-специфических антител и в сыворотках крови вакцинированных животных, который определяется в ИФА с наборами, выпускаемыми фирмой ООО «Вет-биохим» г. Москва - «Набор для выявления антител к антигену дВ вируса болезни Ауески иммуноферментным методом «Ауески дВ-СЕРОТЕСТ» и «Набор для выявления антител к антигену дЕ вируса болезни Ауески им-муноферментным методом «Ауески дЕ-СЕРОТЕСТ» или аналогичными, зарегистрированными в Российской Федерации, согласно инструкции по применению набора.
В результате проведённых исследований было установлено, что «Вакцина против болезни Ауески инакти-вированная эмульгированная маркированная» производства ФКП «Щелковский биокомбинат» серий №1, 2 безвредна, ареактогенна и способна индуцировать формирование иммунитета у вакцинированных животных.
заключение. Разработанная на ФКП «Щелковский биокомбинат» технология изготовления «Вакцины против болезни Ауески инактивированной эмульгированной маркированной» позволяет получать авирулентную, иммуногенную вакцину, способную профилактировать распространение этой болезни среди восприимчивых животных.
Литература
1. Иммуногенные свойства концентрат-вакцины против болезни Ауески, делеционного по гликопротеину дЕ / М.Н.Гусева, В.В.Михайлишин, О.С.Моренков, Н.С.Мамков // Производство и контроль медицинских ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: тез. докл. конф. - Владимирская обл., п. Вольгинский: ФГУППЗП, 1999. - С. 56-58.
2. Инфекционная патология животных / под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 662 с.
3. Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных: справочник / В.Н.Сюрин, Р.В.Белоусова, Н.В.Фомина. - М.: Агропромиздат, 1991. - 528 с.
4. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А.Сергеев, Е.А.Непоклонов, Т.И.Алипер - М.: Библионика, 2007. - 523 с.
5. Основы промышленной иммунобиотехнологии: учеб. пособие / В.М.Безгин, Н.Н.Быкова, В.Е.Козлов [и др.]. - Курск: Изд-во КГСХА, 2011 - 288 с.
6. Цион, Р.А. Дифференциальная диагностика болезней свиней / Р.А.Цион. - Л.: Колос, 1970. - 96 с.
7. Оценка вирусвакцины для профилактики болезни Ауески свиней / А.А.Коломыцев, В.А.Бабаян, И.Ф.Вишняков [и др.] // Ветеринария. - 1991. - № 1 - С. 31-33.
8. The Role of Viral and Host MicroRNAs in the Aujeszky's Disease Virus during the Infection Process / O.Timoneda [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - № 9 (1). - January. - P. 86-96.
A COMPARATIVE STUDY OF THE INFLUENCE OF VARIOUS INACTIVATED ON THE VIRUS OF AUJESZKY'S DISEASE IN THE INDUSTRIAL PRODUCTION OF THE VACCINE
1Samuilenko A.Ya. - Doctor of Veterinary Sciences, professor, Academician of RAS;
1Fedorova O.Y. - applicant; 1Melnik N.V. - Doctor of Veterinary Sciences; 1Grin S.A. - Doctor of Biological Sciences, professor, Corresponding member of RAS; 1Melnik R.N. - Candidate of Biological Sciences;
2Litenkova I.Y. - Candidate of Veterinary Sciences.
1All-Russian Research and Technological Institute of Biological Industry, Moscow region
(e-mail: [email protected]).
2FSE«Shchelkovo Biokombinat», Moscow region (e-mail: [email protected]).
The article presents the results of a study of the effects of various inactivants on the Aujeszky's disease virus, which were subsequently used to develop in the industrial production of the vaccine against Aujeszky's disease inactivated emulsified labeled at the SCF «Shchelkovo Biomedical Combine», in conjunction with VNITIBP specialists, which induces immunity in vaccinated animals for GB antigen, and does not cause the formation of antibodies to the deletion gE antigen. When developing the vaccine, one of the important points was the development of the virus inactivation technique so that after the inactivation the antigenicity of the active substance - the inactivated virus was not lost and at the same time, the vaccine should be harmless, areactogenic.
KEYWORDS: vaccine virus of Aujeszky's disease, monolayer-suspension subline cells, inactivation, marked strain, the formaldehyde dimer, ethylenimine, B-propiolacton; uses an attenuated strain, nutrient medium, dispersing the mixture, solutions.
References
1. Immunogennye svojstva koncentrat-vakciny protiv bolezni Aueski, delecionnogo po glikoproteinu gE [Immunogenic properties Concentrate-vaccine against Aujeszky's disease, deletion by glycoprotein gE]/ M.N.Guseva, V.V.Mihajlishin, O.S.Morenkov, N.S.Mamkov // Proizvodstvo i kontrol medicinskih veterinarnyh preparatov, opyt primeneniya i realizaciya ih v stranah SNG - Production and control of veterinary medical drugs, expertise and selling in CIS countries: conference proceedings. - Vladimirskaya obl., p. Volginskij: FGUPPZP, 1999. - P. 56-58.
2. Infekcionnaya patologiya zhivotnyh [Infectious pathology of animals]/ edited by A.YA.Samujlenko, B.V.Soloveva, E.A.Nepoklonova, E.S.Voronina. - Moscow: IKC «Akademkniga», 2006. - 662 p..
3. Syurin, V.N. Diagnostika virusnyh boleznej zhivotnyh [Diagnostics of viral animal diseases]: reference book / V.N.Syurin, R.V.Belousova, N.V.Fomina. - Moscow: Agropromizdat, 1991. - 528 p.
4. Sergeev, V.A. Virusy i virusnye vakciny [Viruses and viral vaccines] / V.A.Sergeev, E.A.Nepoklonov, T.I.Aliper -Moscow: Biblionika, 2007. - 523 p.
6
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 2/2018
