CC BY
44
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
1
УДК: 578:57.083 UDC: 578:57.083
НЕКОТОРЫЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АТТЕНУИРОВАННОГО ШТАММА ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ1 SOME IMMUNOBIOLOGICAL FEATURES OF RIFT VALLEY FEVER VIRUS OF ATTENUATED STRAIN
Балышева Вера Ивановна д.б.н. Balysheva Vera Ivanovna Dr.Sci.Biol.
Капустина Ольга Владимировна к. в. н. Kapustina Olga Vladimirovna Cand.Vet.Sci.
Закутский Николай Иванович д.в.н. Zakytskiy Nickolay Ivanovich Dr.Sci.Vet.
Власова Наталья Никифоровна д.б.н. Vlasova Natalia Nikiforovna Dr.Sci.Biol.
Южук Татьяна Эммануиловна к. б.н. Yuzhuk Tatyana Emmanuilovna Cand.Biol.Sci.
Прудникова Елена Юрьевна аспирант Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовател ьский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г.Покров, Россия Prudnikova Elena Yurievna postgraduate student State Research Institution National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology of Russia, Russian Academy for Agricultural Sciences, Pokrov, Russia
В статье представлены результаты изучения культуральных свойств вируса ЛДР, разработки режимов инактивации вируса теотропином, формалином, димером этиленимина. Подобраны The article represents some results of Rift Valley virus culture characteristics, development of conditions for virus inactivation with teotropin, formalin or ethyleneimine dimer. A range of inactivants and optimal
инактиванты и оптимальные режимы инактивации, inactivation conditions, which provide the production of позволяющие получать инактивированное вирусное inactivated raw virus with preserved antigenic and сырье с сохранением антигенной и иммуногенной immunogenic activity rates, is selected активности
Ключевые слова: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, Keywords: CULTURE, INACTIVATION, RIFT
ИНАКТИВАЦИЯ, ВИРУС ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ VALLEY VIRUS, ANTIGENICITY,
РИФТ, АНТИГЕННОСТЬ, ИММУНОГЕННОСТЬ IMMUNOGENICITY
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект № 11 -08-01245-а
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
2
Введение
Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - зооантропонозная трансмиссивная остро протекающая болезнь с признаками интоксикации, лихорадки, некротического гепатита, геморрагического гастроэнтерита, с высокой летальностью среди ягнят и козлят. Возбудитель относят к семейству Bunyaviridae рода Phlebovirus. В настоящее время ЛДР является объектом пристального внимания исследователей, т.к. является особо опасным зооантропонозом и наносит огромный экономический ущерб, который складывается из потерь от абортов, высокого процента гибели молодняка, резкого снижения продуктивности скота, затрат на проведение карантинных и профилактических мероприятий, а также на госпитализацию и лечение людей [4].
Эпизоотическое проявление болезни в виде эпизоотических вспышек и эпизоотий имеет место в африканских и азиатских странах. Однако, согласно результатам исследования, проведенных Союзом защиты дикой природы (Wildlife Conservation Society), глобальное потепление повлечет изменение экосистем, привычных для определенных климатических поясов, на другие. В частности, потепление может привести к увеличению числа и распространению потенциальных переносчиков возбудителя болезни ЛДР - комаров Cx. tritaeniorhynchus и Ae. vexans arabiensis. Имеются сообщения об обнаружении антител в крови шведских солдат из контингента войск ООН. [6]. Все это свидетельствует об угрозе распространения лихорадки долины Рифт в страны, в которых к настоящему времени были свободны от этой болезни [7].
В связи с тем, что применение живых вакцин для профилактики ЛДР связано с потенциальной опасностью (реверсия, рекомбинация с полевыми изолятами), особую значимость приобретают инактивированные вакцины для защиты людей и животных. Производство инактивированных
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
3
вакцин связано с наработкой большого количества вирусного сырья с высокой инфекционной активностью [1], в связи с чем, поиск культуральных клеточных систем и разработка оптимальных параметров культивирования вируса всегда имеет важное значение для разработки вакцинных препаратов.
Не менее важным этапом при разработке инактивированных вакцин является инактивация вирусного сырья, которая должна быть не только эффективной, но и максимально сохраняющей антигенные свойства инактивированного вируса [2,3,5].
Поэтому целью наших исследований являлось изучение репродукции вируса ЛДР в перевиваемых линиях клеток - как наиболее технологичных продуцентов вирусного сырья, выбор инактивантов и отработка режимов инактивации вируса,
обеспечивающих сохранение антигенной и иммуногенной активности инактивированного препарата.
Материалы и методы.
Вирус ЛДР: вакцинный штамм «1974- ВНИИВВиМ» с инфекционной активностью 6,0-6,5 lg ТЦД50/см получен из коллекции микроорганизмов ВНИИВВиМ.
Перевиваемые линии клеток почек: сирийского хомячка (ВНК-21/13); эмбриона козы (ПЭАК), теленка (МОВК), зеленой мартышки сайги (ПС), сибирского горного козерога (ПСГК-60), (CV-1), овцы (ПО), эмбриона кролика (ПЭКр-85). Для сравнения эффективности накопления вируса ЛДР в первичных и перевиваемых культурах клеток использовали первичную культуру клеток почки ягненка (ПЯ).
Среда Игла (МЕМ) фирмы Sigma (США), среда 0,25% ФГМ-суспензионная, обогащенная витаминами группы "В" и глютамином (600 мг/дм) с добавлением 5-10% сыворотки крови КРС; забуференный
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
4
физиологический раствор (ЗФР) рН 7,2-7,4; 0,02%-ный раствор версена; 0,25%-ный раствор трипсина, бактериальные среды.
Реактивы: 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан
(теотропин, А-24), димер этиленимина (ДЭИ), бета-пропиолактон, формалин (36,5% формальдегида), гидроокись алюминия (ГОА, с 6% сухого остатка).
В опытах использовали клинически здоровых беспородных белых мышей: 1-3 дневного возраста, самок массой 18-20 гр, овец в возрасте 6-12 месяцев, массой 35-50 кг.
Вирус выращивали при 340С в статических, роллерных и суспензионных условиях в течение 3-4 суток в зависимости от клеточного субстрата, множественности заражения и условий культивирования. Инфекционную активность вируса определяли по общепринятой методике. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации
Л Л
Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см или lg MLD^/см .
Инактивация вируса ЛДР. Работу по подбору инактиванта и оптимальных режимов инактивации проводили с осветленной вируссодержащей культуральной жидкостью с инфекцонной активностью
3 3
не ниже 8,0 lg MLD^/см , концентрация белка не превышала 0,5 мг/ см .
Действие химических препаратов - теотропина, формалина, димера этиленимина на вирус изучали в следующих концентрациях: 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,025%; 0,001% при различных температурах 18-220С, 40С, 370С в течение 24-96 часов при периодическом перемешивании. Константу скорости инактивации вируса (К) рассчитывали по формуле, выражая в час-1 (потеря инфекционной активности вируса за час). Для изучения кинетики инактивации проводили отбор проб через 1, 3, 6, 18, 24, 48, 72 и 96 часов. На основании определения константы скорости инактивации
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
5
вируса ЛДР рассчитывали время полной потери инфекционности, которое впоследствии проверяли экспериментально.
Полноту инактивации вируса определяли путем проведения трех последовательных пассажей инактивированного вируса в элективной культуре клеток, а также путем внутримозгового введения
инактивированного материала мышам 1-3 дневного возраста.
Инфекционную и гемагглютинирующую активности вируса после экспозиции инактивантов определяли методом параллельного титрования на мышатах 1-3 возраста, в РПГА и РСК через 1, 3, 12, 24, 36, 48, 72, 96 часов после обработки.
Для оценки антигенной и иммуногенной активности
инактивированного вируса использовали белых мышей массой 18-20 гр., овец массой 35-50 кг. Животным вводили инактивированные препараты
3
внутримышечно дважды с интервалом 14 суток в объеме 0,5 и 2,0 см , соответственно. У животных для определения титра специфических антител отбирали пробы крови через 14, 21 и 28 суток после прививки, через 28 суток проводили заражение контрольных и вакцинированных
животных вирулентным вирусом ЛДР штамм «Энтеббе» внутримышечно в
3
дозе 1000 ЛД50/см . За состоянием опытных животных вели наблюдение в течение 14 суток.
Результаты исследования и обсуждение.
При культивировании вируса в указанных выше однослойных культурах клеток изучали зависимость накопления вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ» от множественности заражения (от 0,01 - 0,000001 ТЦД50/кл), содержания сыворотки КРС в поддерживающей среде, рН, длительности культивирования при стационарном методе выращивания.
Из культуральных сосудов (1,5 л матрасы) с выросшим монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили поддерживающую среду с 2% сыворотки. Множественность заражения составляла 0,01 ТЦД50/кл.
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
6
Инфицированную культуру инкубировали до наступления 80-100% ЦПД. В каждой культуре клеток проводили от 3-х до 5-ти последовательных пассажей.
В зависимости от культуры клеток первые признаки ЦПД в первом пассаже появлялись через 24-48 часов после заражения. В процессе последующих последовательных пассажей время проявления ЦПД сокращалось и к 24 часам культивирования отмечалось округление, сморщивание клеток, появление зернистости цитоплазмы, пикноз ядра, гибель клеток и отслаивание их от субстрата. Часть клеток приобретала звездчатую форму и сохраняла цитоплазматические связи в виде отростков с соседними клетками. Максимальные деструктивные изменения наблюдали через 48-72 часа (90-120 CV-1) культивирования.
При одинаковой множественности заражения (0,01ТЦД50/клетка) длительность культивирования вируса составляла от 3 до 7 суток (таблица1). Дальнейшее увеличение числа пассажей указанных серотипов в испытуемых клеточных субстратах не вызывало существенного увеличения «урожая» вируса. Во всех клеточных культурах, за исключением ПЭКр-85, вирус ЛДР накапливался в пределах от 5,70±0,21 до 6,90± 0,14 lg ТЦД50/см3. В результате исследований установлено, что наряду с клетками ПО высокой вируспродуцирующей активностью обладали клетки ПС. В культурах клеток ВНК-21/13, МДВК и ПСГК-60 титры вируса были на 0,4-0,9 lg ТЦД50/см3 ниже, чем в первых двух культурах клеток.
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
7
Таблица №1 - ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КУЛЬТУР КЛЕТОК К ВИРУСУ ____________ЛДР ШТАММ «1974-ВНИИВВиМ»________
№ п/п Количество пассажей Культура клеток Время развития 80-100% ЦПД Титр инфекционной активности (MICLD^/см3)
1 4 BHK-21/13 3-4 6,25± 0,15
2 5 ПЭАК 3-4 5,70±0,21
3 4 МДВК 3-5 6,00±0,25
4 3-4 ПС 4 6,90± 0,14
5 5 CV-1 3-4 6,50±0,25
6 3-4 ПСГК-60 3-4 6,22±0,17
7 4-5 ПО 4 6,80± 0,14
8 4 ПЭКр-85 7 4,17±0,15
9 5 ПЯ 3 6,32±0,14
Множественность заражения в пределах от 0,01 до 0,0003 практически не влияла на урожай вируса и длительность культивирования, которая была в пределах от 60 до 84 часов. Уменьшение множественности заражения (0,00001-0,00003 ТЦД50/кл и ниже) приводило к снижению «урожая вируса» и увеличению сроков наступления полной деструкции монослоя до 4-5 дней.
Таким образом, оптимальной множественностью заражения перевиваемой культуры клеток ПС является 0,01-0,0001 ТЦД50/кл, что позволяет получать вируссодержащий материал с инфекционным титром 6,81±0,12 lg ТЦД50/см через 2,5-3,5 суток культивирования.
Установлено (табл. 2), что в культуре клеток ПС инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса на 4-е сутки была значительно выше, чем в других клеточных культурах. Титр ГА-активности вируса, полученного в круговом монослое, в РПГА достигал величины 1:512, что более чем в 10 раз превосходило этот показатель при культивировании вируса ЛДР в культурах клеток ПСГК и ВНК-21. При этом наблюдается
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
8
прямая зависимость между титром инфекционной и гемагглютинирующей активностью.
Таблица 2 - НАКОПЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ И ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ЛДР (ШТАММ «1974-ВНИИВВиМ») ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Культура клеток Способ культивирования
Стационарный монослой Круговой монослой
Инф. актив., lg ТЦДУсм3 ГА-актив. в РПГА Инф. актив., lg ТЦД5„/см3 ГА-актив. в РПГА
ПС 6,81±0,12 1:258 7,32±0,17 1:512
ПСГК-60 6,05±0,15 1:16 6,25±0,12 1:32
ВНК-21/13 6,25±0,10 1:16 6,38±0,14 1:32
n=4
3
Примечание: исходный титр нативного вируса 6,50 lg ТЦД50/см , множественность заражения - 0,001 ТЦД50/кл .
Изучение влияния значений рН поддерживающей среды на накопление вируса ЛДР показало, что поддержание рН в период адсорбции на уровне 6,7-6,9 и при дальнейшем культивировании на уровне 7,1-7,5 позволяло увеличить титр вируссодержащего материала на 0,5-1,0 lg.
При изменении содержания сыворотки в поддерживающей среде от 0 до 10% установлено, что максимальное накопление вируса было в среде с 2% сыворотки крови КРС.
Известно, что снижение температуры культивирования
инфицированной культуры обеспечивает стабилизацию рН поддерживающей среды, сохранение антигенной активности вируса и снижение риска реверсии вирулентных свойств штамма вируса. Поэтому нами было изучено влияние понижения температуры инкубирования до 340С на сроки и уровень накопления инфекционной и антигенной активности вируса. Результаты сравнительного изучения динамики и
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
9
максимального накопления инфекционной и антигенной активности вируса при температуре инкубирования 370С и 340С не выявили значительных отличий. Однако при температуре инкубирования 340С рН поддерживающей среды изменялась в меньшей степени и не возникало необходимости периодического внесения (каждые 10-12 часов) раствора гидроокиси натрия.
Изучение антигенной активности вируссодержащего материала, полученного при разных температурах культивирования, показало, что гемагглютинирующая и комплементмсвязывающая активности практически не отличались и составляли 1:32-64 и 1:16-32, соответственно. Поддержание рН в пределах 7,2-7,5 в течение 48-72 часов культивирования стационарным методом при 340С обеспечивало максимальное накопление вируса до 6,81±0,12 lg ТЦД50/см3, или 7,5-8,7 lg MLD 50/см3.
Культивирование вируса роллерным методом в культурах клеток BHK-21/13, ПСГК-60 и ПС при отработанных оптимальных параметрах выращивания: скорость вращения - 12-15 об/мин, оптимальная доза заражения 0,01 MLD^/кл., температура - 340С, рН 7,2-7,5 позволяло получать через 48-72 часа вирусное сырье с инфекционной активностью 8,53±0,21 lg MICLD 50/см3 и с активностью в РПГА - 1: 64-128, в ТФ ИФА - 1:625-3125. Применение роллерной установки, разработанной во ВНИИВВиМ, для выращивания вируса ЛДР, обеспечивало одномоментно получение 48 л вирусного сырья.
При проведении электронно-микроскопических исследований инфицированных культур клеток показано, что в области контакта вирусных частиц с клетками происходит утолщение клеточной мембраны и ее прогиб. Уже через 10 минут адсорбции при 370С происходит частичное слияние клеточной мембраны с оболочкой вируса. Так же в период адсорбции обнаруживали вирусные частицы во внутриклеточных
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
10
вакуолях. Установлено, что большинство чувствительных клеток инфицируются в период адсорбции вируса.
Выявление антигенов вируса в процессе его репродукции проводили непрямым методом флуоресцирующих антител, непрямым и прямым методом ИФА на монослое с использованием специфической к ЛДР и контрольной сывороток овец, моноклональных антител к нуклеопротеину (NP) вируса ЛДР.
Показано, что уже через 6-9 часов после заражения культуры клеток удается выявить антигены вируса, в частности NP, в перинуклеарной зоне цитоплазмы в виде отдельных гранул, увеличение числа которых пропорционально сроку культивирования. Через 30 часов инкубирования антиген выявляется по всей поверхности цитоплазмы практически в 50% инфицированных клеток.
В результате проведенных экспериментов установлено, что через 3 часа инкубации при 370С и конечной концентрации инактивантов 0,06% -
о
0,02% инфекционность вируса резко снижается - на 4,7 lg ТЦД50/см . Через 24 часа после экспозиции вирус не обнаруживали в большинстве отобранных проб. Учитывая данные литературы, что инактивация при более низких температурах, чем 370С способствует лучшему сохранению антигенных свойств вируса, динамику инактивации изучали при 18-220С и 40С. Было установлено, что при воздействии формалина и бета-пропиолактона отмечается быстрое снижение инфекционной активности, затем последующее замедление процесса инактивации.
При воздействии ДЭИ и А-24 было отмечено более постепенное, приблизительно одинаковое снижение инфекционности до полной ее потери через 48 часов. Однако, полная инактивация оставшегося вируса, инфекционная активность которого ниже 1 lg ТЦД50/см3, не всегда может быть обнаружена при титровании в результате случайного отбора проб, особенно при работе с большими объемами вирусного материала.
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
11
Учитывая, что результаты инактивации вируса ЛДР в дальнейшем могут быть использованы для приготовления инактивированной вакцины, время экспозиции вирусного материала с инактивантами увеличили до 3 суток.
Окончательный выбор инактиванта был сделан после проведения опытов по изучению действия перечисленных инактивантов на антигенную активность вируса. Следует отметить, что воздействие на вирус ЛДР формалином или бета-пропиолактоном в конечной концентрации 0,2% вело к снижению его гемагглютинирующей и комплементсвязывающей активности. Препараты, инактивированные ДЭИ и А-24, при температуре 18-220С, времени экспозиции 72-96 часов и конечной концентрации ДЭИ - 0,06%, А-24 - 0,1% сохраняли
гемагглютинирующую и комплементсвязывающую активности.
Для оценки антигенных и иммуногенных свойств инактивированные ДЭИ и А-24 препараты вводили мышам и овцам и на 21-28 сутки после инокуляции отбирали пробы крови для определения комплементсвязывающих и гемагглютинирующих антител в сыворотках крови животных. Титр комплементсвязывающих антител составлял 1:256512, гемагглютинирующих - 1:512-1024, титр вирусспецифических
антител в ТФ ИФА -1: 125-625.
Эффективность экспериментального образца инактивированной А-24 ГОА-сапониновой вакцины проверяли на овцах по уровню накопления ВН-антител.
Установлено, что двукратная прививка образцами инактивированной вакцины индуцировала у привитых овец высокий уровень
вируснейтрализующих антител, равный 1:10 -1:64. Привитые животные были устойчивы к контрольному заражению вирулентным штаммом вируса в дозе 1000 ЛД50.
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
Научный журнал КубГАУ, №73(09), 2011 года
12
Заключение.
Таким образом, полученные результаты исследований показали, что вирус ЛДР штамм «1974- ВННИИВВиМ» накапливается в перевиваемых культурах клеток ПС, ПСГК-60, МОВК в высоких титрах инфекционной (8,53±0,21 lg MICLD 50/см3) и антигенной (в РПГА - 1: 64-128) активности. Подобраны инактиванты и оптимальные режимы инактивации, позволяющие получать инактивированное вирусное сырье с сохранением антигенной и иммуногенной активности.
Штамм «1974- ВННИИВВиМ» и полученные результаты исследований могут быть использованы для изготовления эффективной безопасной инактивированной вакцины против ЛДР.
Литература
1. Балышева, В.И. Клеточные культуры в биотехнологии производства инактивированных вакцин / В.И. Балышева, А.А. Кошелева, В.И. Жестерев // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных: Мат. междунар. науч.-произв. конф., посвященные 100-летию Авророва. /- Воронеж, 22-23 июня 2006. - С.1027- 1030
2. Гард, С. Химическая инактивация вирусов / С.Гард // Природа вирусов.-М., 1958. - С. 135-157.
3. Доел, Т.Р. Инактивация вирусов, продуцируемых в культурах клеток животных / Т.Р. Доел // Биотехнология клеток животных. - М.: ВО Агропромиздат, -1989. - Т. 2.- С. 518.
4. Книзе, А.В. Эволюция эпизоотической ситуации по лихорадке долины Рифт./ А.В. Книзе, Н.В. Дмитренко, А.А. Стрижаков // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропозоонозов: труды Междунар. науч.-практ. конф., посвященной 45-летию института 24-26 сентября ГНУ ВНИИВВиМ.-Покров, 2003. Часть1.-С. 93-98.
5. Сергеев, В.А. Вирусные вакцины /В.А. Сергеев. - Киев: Урожай, 1993.370 с.
6. Meegan, J. M. Rift Valley fever: / Meegan, J. M., Bailey C.L. // The Arboviruses: Epidemiology and Ecology.- 1989.- vol.4, Monath T.P., ed. CRC Press, Boca Rationh, Florida, USA, 52-76.
7. The Deadly Dozen: 12 Diseases Global Warming Incubates / From Lyme
Disease to Ebola Virus, The World Is Getting Sicker // - [Электронный ресурс]. - 2008.-Режим доступа: htt://www.thedailigreen.com/environmental-news/latest/deadly-dozen-
global-wamming-47100803#ixzz1UdUAav4g.
http://ej.kubagro.ru/2011/09/pdf/27.pdf
