Разработка инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК:619:615.371:616.98:578.823:636.5

РАЗРАБОТКА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ

Алиева А.К.*, Киселев О.И.**, Алиев М.Г.***, Юсупова Г.Р.

Санкт-Петербургский государственный университет сервиса и экономики* Научно-исследовательский институт гриппа (Санкт-Петербург)** ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»***

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: инфекционная бурсальная болезнь,

инактивированная вакцина, антигенная и иммуногенная активность, специфическая профилактика.

Key words: infectious bursal disease, inactivated vaccine, antigenic and immunogenic activity, specific prevention.

В условиях современного промышленного птицеводства вакцинопрофилактика - один из эффективных способов профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ). В настоящее время для этого широко используют живые и инактивированные вакцины, имеющие свои преимущества и недостатки [3, 4, 5, 7]. Существенным преимуществом инактивированных вакцин является полная безопасность и способность их формировать у привитой птицы напряженный и продолжительный поствакцинальный иммунитет.

Важнейшими этапами в разработке технологии изготовления вакцин являются выбор производственного штамма и наиболее экономически эффективного метода его культивирования. В литературе имеется ряд сообщений, где в качестве биологической системы культивирования вируса при изготовлении инактивированных вакцин против ИББ используются различные способы получения вирусного антигена: в первичных и перевиваемых культурах клеток, на СПФ-эмбрионах кур, на восприимчивых цыплятах (берутся пораженные фабрициевы сумки) [6,10,11]. Кроме того, довольно спорным все еще остается вопрос о возможности использования аттенуированных вакцинных штаммов вируса ИББ в производстве инактивированного препарата и его иммуногенной эффективности [10].

Целью наших исследований был подбор штамма и адъюванта, а также изучение условий изготовления инактивированной вакцины против ИББ и оценка ее эффективности.

Материал и методы. В опытах использовали производственный штамм вируса ИББ: аттенуированный - «КБК» и эталонный - «52/70-М».

Штаммы вируса ИББ поддерживали и титровали в культуре клеток МА-104, на 11-дневных эмбрионах СПФ-кур и на цыплятах восприимчивого возраста.

Инактивацию вируса ИББ проводили димерэтиленимином (ДЭИ) [3]. Полноту инактивации проверяли методом 3-х «слепых» пассажей на куриных эмбрионах.

При изготовлении инактивированного препарата в качестве антигена были использованы культуральный вирус (штамм «КБК», 7,0 ^ ТЦД50/мл) и гомогенаты тушек куриных эмбрионов или фабрициевых сумок цыплят, зараженных патогенным штаммом «57/70-М» (6,0 ^ ЭИД50/мл). В качестве адъювантов использовали гидроокись алюминия, двуокись кремния (аэросил) и минеральное масло — Маркол-52.

Безвредность оценивали путем введения пятикратной дозы препарата цыплятам разного возраста.

Антигенную активность вакцинных препаратов определяли по титру специфических антител в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментным методом (ИФА).

Иммуногенность полученных препаратов оценивали на цыплятах мясного и яичного кроссов путем однократного введения препарата. Препараты вводили внутримышечно или подкожно в объеме 0,2, 0,3 и 0,5 мл. Спустя 4 недели сывороткикрови исследовали в РДП и ИФА, а по 10 привитых и непривитых цыплят заражали вирулентным штаммом «52/70М» в дозе 10 ИД50/мл. Клинические наблюдения за зараженными цыплятами вели в течение 15 дней. До и после 15-ти суток заражения у цыплят определяли бурсальный индекс по общепринятой методике [1].

Результаты и обсуждение. Данные сравнительного изучения антигенной активности инактивированных препаратов вируса в зависимости от свойств адъюванта представлены в табл.1.

1. Антигенная активность инактивированного вируса ИББ с различными

адъювантами (п=10)

N п/п Инактивированный антиген вируса ИББ Титр антител

РДП (1082) ИФА

1 С гидроокисью алюминия 4,0 1:5896

2 С аэросилом 3,8 1:6526

3 С минеральным маслом 5,2 1:9214

4 Без адъюванта 2,4 1:4124

5 Контроль 0 0

Из данных, представленных в табл. 1, следует, что наиболее высокой антигенной активностью обладает препарат с масляным адъювантом и, как

следствие, установлен максимальный уровень антител на его введение (5,2 в РДП и в ИФА 1:9214). Адъювантная способность гидроокиси алюминия и аэросила существенно не различалась. Наименее выраженный иммунный ответ отмечали у цыплят, которым вводили инактивированный антиген без адъюванта.

Для определения оптимального соотношения дисперсной фазы (инактивированный вирус) и дисперсной среды (масляный адъювант) в инактивированной вакцине против ИББ были изготовлены опытные образцы препарата с различным соотношением водной и масляной фаз (20/80, 30/70 и 40/60) по весу. В качестве дисперсной фазы вакцины использовали инактивированный вирус ИББ. Эмульгирование водной фазы с адъювантом проводили на гомогенизаторе.

Иммунобиологические свойства инактивированных препаратов против ИББ с различным компонентным составом оценивали на 30-суточных цыплятах кросса «Хайсекс белый». Вакцины вводили птице подкожно в области верхней трети части шеи объеме 0,5 мл. Результаты определения антигенной активности инактивированных эмульгированных вакцин против ИББ представлены в табл. 2, из которой следует, что все образцы вакцин индуцировали у привитых птиц формирование достаточного уровня гуморального иммунитета к вирусу ИББ после прививки.

2. Антигенная активность инактивированной вакцины против ИББ в зависимости от соотношения антигена и адъюванта

Соотношение антигена и адъюванта Сроки исследования (сут)

0 28 60 90 180

20/80 РДП 0 3,2±0,4 3±0,2 2,7±0,3 1,6±0,2

ИФА 200 4800 4200 3840 2450

30/70 РДП 0 5,0±0,2 4,7±0,4 4,5±0,2 4,0±0,3

ИФА 310 8240 7800 7200 6540

40/60 РДП 0 4,8±0,2 3,7±0,4 2,5±0,4 1,3±0,3

ИФА 400 7600 6800 4255 2400

контроль РДП 0 0 0 0 0

ИФА 250 220 380 340 240

Птица, привитая биопрепаратом, содержащим 20 частей антигена, через 28 сут после иммунизации имела в крови концентрацию антител на уровне 3,2 1о§2 в РДП и 6755 в ИФА. Другие образцы вакцин индуцировали у привитых кур образование антител к вирусу ИББ в более высоких титрах.

В течение всего эксперимента наиболее напряжённый поствакцинальный иммунитет был зарегистрирован в группе птиц, которым ввели вакцину, имевшую соотношение дисперсной фазы и дисперсной среды 30/70.

У кур, привитых вакцинами с соотношением антиген/адъювант 20/80 и 40/60, была отмечена тенденция к снижению уровня антител к вирусу ИББ через 90 и 180 сут. в 2 и 4 раза, соответственно.

Полученные данные позволяют для получения инактивированной вакцины против ИББ со стабильной эмульсией и выраженными иммуногенными свойствами рекомендовать использовать 30 частей инактивированного вируса ИББ (дисперсная фаза) и 70 частей масляного адъюванта Маркол-52 (дисперсная среда).

Исходным материалом при производстве вакцин является вируссодержащая жидкость с высокой биологической и антигенной активностью. Используя несколько вариантов антигена вируса ИББ (культуральный, эмбриональный и бурсальный), сравнивали антигенную активность инактивированных препаратов с масляным адъювантом. Каждый из указанных препаратов вводили внутримышечно цыплятам 21дневного возраста (по 10 гол.) в объеме 0,5 мл, и через 4 недели брали у них кровь для определения антител.

Наиболее высокий титр антител наблюдали у цыплят на введение инактивированного препарата, полученного на основе бурсального антигена вируса ИББ (в РДП — 3,0 и 4340 в ИФА). Антигенная

активность препарата из культурального вируса была сравнительно низкой (1,5 1о§2 в РДП и 1250 в ИФА). Эмбриональный вариант препарата обеспечивал выработку специфических антител на достаточном уровне (2,8 1о§2 в РДП и 4250 в ИФА).

Для оценки иммунобиологических свойств у инактивированной эмульгированной вакцины против ИББ были проведены эксперименты по: определению оптимального прививного объема, изучению иммунного ответа у птицы при различных способах введения вакцины, определению сроков формирования иммунитета у цыплят после прививки и тестированию иммуногенной активности биопрепарата в процессе хранения.

В опыте по изучению антигенной и иммуногенной активности экспериментальной инактивированной масляной вакцины в зависимости от дозы и метода введения препарата 15-дневным цыплятам вводили препарат подкожно и внутримышечно в объеме по 0,2; 0,3 и 0,5 мл. В контроле было 10 невакцинированных цыплят. Через 4 нед после прививки всю птицу исследовали серологически и заразили эталонным штаммом «52/70-М» (табл.3).

Результаты данного опыта свидетельствуют, что вакцина в дозах 0,3 и 0,5 мл вызывает максимальное накопление титров специфических антител, которые обеспечивают высокую степень защиты цыплят (86,7100,0%), независимо от способа введения препарата.

3. Антигенная и иммуногенная активность инактивированной вакцины против ИББ в зависимости от дозы и способа введения (п=20)

Г руппа цыплят Способ введения Доза вакцины, мл БИ Титр антител Результаты контрольного заражения

РДП 0ой0 ИФА заражено заболело %

1 в/м 0,2 4,5 3,0 1 2424 15 4 73,3

2 в/м 0,3 4,6 4,5 1 7250 15 2 86,7

3 в/м 0,5 4,8 4,8 1 8445 15 0 0

4 п/к 0,2 4,4 3,4 1 2860 15 2 80,0

5 п/к 0,3 4,4 4,4 1 7560 15 1 93,3

6 п/к 0,5 5,2 4,6 1 8260 15 0 0

7 (к) - 5,5 - - 15 15 100,0

Примечание: «в/м» — внутримышечно; «п/к» - подкожно.

При вирусологическом исследовании фабрициевых сумок цыплят подопытной птицы, убитой на 4-ые сут после контрольного заражения, вирус ИББ не выделяли, тогда как у контрольных цыплят, павших в те же сроки, его выявляли в фабрициевой сумке. Уровень поствакцинальных антител до заражения и через 14- сут после него существенно не различался, это указывает на высокую протективную активность препарата в дозах 0,3 и 0,5 мл. У некоторых цыплят при внутримышечном введении в дозе 0,5 мл в месте инъекции отмечали уплотнение тканей в виде припухлости. Вакцина в дозе 0,3 мл не вызывала местной реакции и обеспечивала образование напряженного иммунитета при подкожном и внутримышечном введениях препарата.

Таким образом, можно заключить, что оба испытанных способа введения инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ (подкожная и внутримышечная инъекция) являются эффективными и могут быть рекомендованы для проведения массовой иммунизации цыплят в птицеводческих предприятиях.

В следующей серии экспериментов была определена напряженность и продолжительность поствакцинального иммунитета к вирусу ИББ у птицы, привитой инактивированной эмульгированной вакциной против ИББ с использованием двух различных прививных объемов.

С этой целью 30-суточным цыплятам и ремонтному молодняку (120 сут) инактивированную вакцину вводили однократно внутримышечно в дозах 0,3 и 0,5 мл в каждой возрастной группе. Через 1, 3, 6, 9 и 12 мес после этого сыворотку крови исследовали серологически в РДП и в ИФА.

Результаты изучения поствакцинального иммунитета у кур после иммунизации различными прививными объемами инактивированной эмульгированной вакцины против ИББ представлены на рис. 1 и 2.

Активность сывороток в РДП Ц> Активность сыворотки в ИФА

10000 -1

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0

3 6 9 12

Рис.1. Сроки исследования (в мес)

— Цыплята, привитые в дозе - 0,3 мл.

— Цыплята, привитые в дозе - 0,5 мл.

— Реммолодняк, привитый в дозе - 0,3 мл.

— Реммолодняк, привитый в дозе - 0,5 мл.

Рис.2. Сроки исследования (в мес)

■ Цыплята, привитые в дозе - 0,3 мл.

■ Цыплята, привитые в дозе - 0,5 мл.

■ Реммолодняк, привитый в дозе - 0,3 мл.

■ Реммолодняк, привитый в дозе - 0,5 мл.

Из материалов рис. 1 и 2 следует, что инактивированная

эмульгированная вакцина против ИББ способствовала формированию у птиц высокого уровня специфических антител к вирусу ИББ на протяжении всего периода исследований (12 мес), независимо от прививного объема. Максимальные уровни антител (4,8-5,2 в РДП и 6860-8845 в ИФА) к вирусу ИББ регистрировали у птицы обеих групп на протяжении З мес после иммунизации, после чего наблюдали снижение титров поствакцинальных антител до 1,8 в РДП и 3100 в ИФА. Однако снижение уровня специфических антител к возбудителю ИББ у иммунизированной птицы было некритичным.

Важным требованием при разработке технологии инактивированных противовирусных вакцин является стабильность физических и иммунобиологических свойств при хранении биопрепарата. Для изучения этого вопроса использовали образцы инактивированной эмульгированной вакцины против ИББ опытной серии, которую контролировали на показатели качества сразу после изготовления, а также через 3, 6, 9 и 12

о

мес хранения при +4 ^ +8 С (табл. 4). Иммуногенную активность вакцины тестировали на птице через 28 сут после однократной инъекции в дозе 0,5 мл по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом вируса ИББ. Состояние эмульсии контролировали визуально, эмульсию считали стабильной, если при хранении не регистрировали отделения водной фазы.

4. Иммуногенность инактивированной вакцины против ИББ при хранении

Результаты контрольного заражения

Г руппа цыплят Срок хранения вакцины, мес.

0 3 6 9 12

Вакцинированные 1/10 1/10 2/10 1/10 2/10

Контрольная 9/10 8/10 10/10 9/10 10/10

Примечание: числитель — количество заболевших птиц;

знаменатель — количество зараженных птиц.

В результате установили, что иммуногенная активность вакцины и

о

стабильность эмульсии в процессе хранения при температуре +4 - +8 С в течение 12 мес не снижается.

Полученные данные свидетельствуют о сохранении эмульсии и биологических свойств инактивированной вакцины против ИББ при

о

хранении в температурном режиме от +4 до +8 С С.

Заключение. При сравнительном изучении трех вариантов антигенных препаратов вируса ИББ установлено, что высокой антигенной активностью обладают препараты, полученные из фабрициевых сумок цыплят и эмбрионов СПФ-кур, зараженных вирусом ИББ.

Включение адъюванта в состав вакцины усиливает ее

иммуногенность, причем минеральное масло по адъювантным способностям превосходит гидроокись алюминия и двуокись кремния.

Инактивированная вакцина из штамма «52/70-М» высоко

иммуногенна и при однократном введении цыплятам в 10-15-дневном возрасте обеспечивает полную защиту птицы от высоковирулентных штаммов вируса ИББ на весь восприимчивый период.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Алиев А.С. Лабораторная диагностика

инфекционног бурсита кур // Ветеринария. — 1990. — № 5. — С. 31-33.

2. Алиев А.С. Инфекционная бурсальная болезнь птиц (эпизоотология, этиология, диагностика и профилактика.: Автореф. дис...д. в. н. — СПб., 1993.3.Алиев А.С. Инактивирующее действие ДЭИ и формальдегида на вирус ИББ. / Ветеринарная профилактика в промышленном птицеводстве: Сб. науч. трудов ВНИВИП. — СПб., 1996. . - С. 12-18. 4.Бакулин, В.А. Болезни птиц / В.А. Бакулин. - СПб., 2006. - С. 762. 5. Бессарабов, Б.Ф. Специфическая профилактика инфекционной бурсальной болезни цыплят / Б.Ф. Бессарабов, В. Демин // Птицеводство. - 2008. - № 3. - С. 6162. 6. Борисов, А.В. Разработка средств и методов диагностики

и специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни: Пвтореф. дис. ... д. в. н. / А.В. Борисов. - Владимир, 2000. -

58 с.7,Смоленский, В.И. Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии: Автореф. дис. . д. б. н. /

В.И. Смоленский. - М., 1999. - 44 с. 8.Coman, T. Raspunsul imun indus de unele tulpini de virus al bursitei infectioase aviare utilzate in prepararea vaccinului inactivat uleios / T. Coman, S. Coman, I. Gugiu et al. // Zootechn. Medic. Veter. - 1990. - Vol. 50, N 2. - P. 30-38. 9.Hassan, M.K. Pathogenicity, attenuation, and immunogenicity of infectious bursal disease virus / M.K. Hassan, M.Q. Al-Natour, L.A. Ward et al. // Avian Dis. - 1996. - Vol. 40, N 3. - P. 567-571. 10.Landgraf, H. Killed IBD vaccines / H. Landgraf, P. Wyeth // Poult. Int. - 1986. - Vol. 25, N 9. - Р. 24.11.Wyeth, P.J. The use of inactivated infectious bursal disease oil emulsion vaccine in commercial broiler parent chickens / P.J. Wyeth, G.A. Cullen // Vet. Rec. - 1979. -Vol. 104, N 9. - P. 188-193.

РАЗРАБОТКА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ

БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ

Алиева А.К., Киселев О.И., Алиев М.Г., Юсупова Г.Р.

Резюме

В результате проведенных исследований отобран штамм вируса ИББ и адъювант для производства инактивированной вакцины. Установлена антигенная и иммуногенная активность инактивированной вакцины при

разных методах введения и влияние дозы препарата на его иммунобиологические свойства. Вакцина является эффективным

биопрепаратом при длительном хранении и способна вызывать продолжительный и напряженный иммунитет.

DEVELOPMENT INACTIVATED VACCINE AGAINST INFECTIOUS BURSAL

DISEASE

Alieva A.K., Aliev M.G., Yusupova G.R.

Summary

Strain of IBD virus and adjuvant for the production of inactivated vaccine were selected as the result of conducted investigation. The antigenic and immunogenic activities of inactivated vaccine with different methods of administration and the influence of dose on its immunobiological properties were established. The vaccine is effective biological substance with prolonged shelf-life and it can cause a prolonged and high-level immunity.

УДК:619:616,98:578.823-084:636.5

ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ СХЕМ ВАКЦИНАЦИИ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОНОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ

Алиева А.К.*, Смоленский В.И.**, Алиев А.С.***, Юсупова Г.Р.

Санкт-Петербургский государственный университет сервиса и экономики* Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов* * ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»***

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана»

Ключевые слова: инфекционная бурсальная болезнь,

инактивированная и живая вакцины, специфическая профилактика.

Key words: infectious bursal disease, inactivated and live vaccine, specific prevention.

В настоящее время одной из актуальных проблем в промышленном птицеводстве является инфекционная бурсальная болезнь (болезнь Гамборо) - широко распространенная, высококонтагиозная вирусная болезнь молодняка птицы, которая характеризуется поражением