CC BY
178
УДК 619:616-07/619.3
Ключевые слова: болезнь Ауески, иммуноферментный анализ, диагностика
Key words: Aujeszky's Disease, enzyme-linked immunosorbent assay, diagnostics
Сейсенбаева М. С., Кошеметов Ж. К., Матвеева В. М., Нурабаев С. Ш., Богданова М. И., Сугирбаева Г. Д.
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ
DEVELOPMENT FOR TEST-SYSTEM ON THE BASE OF IMMUNE-ENZYME ASSAY FOR AUJESZKY'S DISEASE DIAGNOSTIC
РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» (НИИПББ КН МОН РК), лаборатория диагностики инфекционных заболеваний Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский. Тел.: +7 (72636) 72228, +7 (72636) 72004 Research Institute for Biological Safety Problems of the Committee for Science of the Ministry of Education and Science of Republic of Kazakhstan, Republican State Enterprise (RIBSP CSMES RK),
Laboratory for Diagnostic of Infectious Diseases Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya region, Kordaysky district, Gvardeiskiy. Tel.: +7 (72636) 72228, +7 (72636) 72004
Сейсенбаева Мадина Сагадатовна, ст. лаборант / Seisenbayeva Madina S., Senior Laboratory Assistant Кошеметов Жумагали Каукарбаевич, к. б. н., зав. лабораторией Koshemetov Zhumagali K., Ph.D. in Biological Sciences, Head of the Laboratory Матвеева Валентина Михайловна, к. б. н., вед. научн. сотрудник Matveyeva Valentina M., Ph.D. in Biological Sciences, Leading Researcher Нурабаев Сергазы Шуратбаевич, ст. научн. сотрудник / Nurabayev Sergazy Sh., Senior Researcher Богданова Марина Ивановна, научн. сотрудник / Bogdanova Marina I., Research Associate Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна, мл. научн. сотрудник / Sugirbayeva Gulnur D., Junior Researcher
Аннотация. На козах получена антисыворотка против антигена штамма «УБ-95» вируса болезни Ауески (ВБА), с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) 1 : 16. Из данной сыворотки по методу Кона выделен иммуноглобулин, активность которого в РДП составила 1 : 16. С применением выделенного иммуноглобулина приготовлен иммунопероксидазный конъюгат по методу Wilson и Nakane, пригодный для постановки иммуноферментного анализа (ИФА). Используя выше указанные диагностические препараты, были отработаны оптимальные условия постановки прямого метода ИФА для обнаружения антигена данного вируса в различных испытуемых материалах
Summary. Antiserum with activity in reaction diffusion precipitation (RDP) 1: 6 against antigen UB-95 strain of Aujeszky's disease virus is obtained from goats. Immunoglobulin was isolated from this serum by Kon's method, its activity was 1 : 16 in RDP. On the base of this immunoglobulin, immunoperoxidase conjugate suitable for immune-enzyme assay (ELISA) was prepared by Wilson and Nakane method. Optimal conditions for direct method ofELISA for antigen detection of this virus in the various tested materials were provided with using above mentioned diagnostical preparations.
Введение
Болезнь Ауески (БА), вызываемая вирусом семейства Herpesviridae рода Уаг1се11ау1гт, продолжает оставаться одной из самых серьезных проблем для свиноводства многих стран мира [5].
При анализе эпизоотической ситуации в различных странах мира установлено, что болезнь Ауески широко распространена. По данным МЭБ, за период 1996-2003 гг. заболевание было зарегистрировано в 42 странах, в том числе в 24 европейских, 7 азиатских и 11 американских государствах. В 1996
году количество стран, сообщивших о наличии болезни, было 29, а к 2003 году их число снизилось до 20.
Возникает чаще осенью или в начале зимы, что связано с перемещением грызунов. Болезнь Ауески наносит значительный экономический ущерб свиноводству, который обусловлен большим отходом поросят, малой эффективностью при откорме и непригодностью в качестве племенных животных. Заболевание свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада из-за абортов и рождения неполноценных
поросят. Отход молодняка свиней при появлении заболевания достигает 80-90 %.
Широкомасштабная вакцинация свиней против болезни Ауески, которая используется для профилактики заболевания, несмотря на значительный клинический эффект, не может препятствовать инфицированию животных, т. к. особенностью возбудителя болезни Ауески является способность вызывать латентную инфекцию, при которой вирус может пожизненно персистировать в клетках ЦНС, миндалин и лимфоузлов. Вирусный геном интегрируется в геноме клетки хозяина и при определенных обстоятельствах способен реактивироваться и инициировать новый цикл размножения вируса, провоцируя возникновение заболевания, выделение вируса во внешнюю среду, инфицируя при этом чувствительных животных [6].
В большинстве развитых стран мира программы искоренения БА основаны на применении «маркированных вакцин» и соответствующих диагностических тест-систем, способных дифференцировать инфицированных животных среди вакцинированного поголовья с последующей их выбраковкой. В настоящее время в качестве таких дискриминирующих тестов используется система на основе блокирующего иммунофермент-ного анализа с применением моноклональ-ных антител, как правило, зарубежного производства (Laboratories HIPRA, Испания, Chekit-ИФА, фирма Bommeli-IDEXX) [2, 7].
Метод иммуноферментного анализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов [4, 9].
Иммуноферментный метод обладает рядом преимуществ перед традиционными иммунологическими реакциями, главными из которых является высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, автоматизация всех этапов постановки анализа и воспроизводимость. Как и всякий аналитический метод ИФА кроме достоинств имеет и свои недо-
статки, прежде всего связанные с фоновыми реакциями, которые становятся все более значимыми по мере того, как растет чувствительность детекторных систем.
Целью нашей работы была оптимизация условий постановки прямого варианта им-муноферментного анализа за счет усовершенствования метода получения антигена вируса болезни Ауески, который может быть использован в ИФА в качестве штаммо-спец-ифического при выявлении антител к антигену в сыворотке крови без использования моноклональных антител, а также снижения неспецифической сорбции конъюгата на иммунный и неспецифический комплекс антиген - антитело.
Материалы и методы
Антиген. В работе использовали концентрированный культуральный антиген вируса болезни Ауески штамм «УБ-95».
Сыворотки. Применяли гипериммунные сыворотки крови коз на штаммы «УБ-95» и «ГНКИ» вируса БА, а также на их основе выделены IgG [3].
Вирусспецифические иммуноглобулины из козьей антисыворотки выделяли спиртовым методом Кона и с помощью сернокислого аммония [1, 8, 10].
Вирусспецифический иммуноперокси-дазный конъюгат. Конъюгат получали по методу Wilson и Nakane [11]. Для конъюгации вирусспецифических антител использовали пероксидазу хрена фирмы Biozyme laboratories (Ukraine) с чистотой RZ = 2,6-3,4 и удельной активностью по белку от 650 до 1400 Ед/мг. Приготовленные фракции вирус-специфического конъюгата подвергали сублимационному высушиванию с добавлением защитной среды, состоящей из сахарозы, агара и желатина.
Прямой вариант ИФА. Иммобилизацию 96-луночных полистироловых планшет ви-русспецифическим иммуноглобулином в разведениях 1 : 1000 - 1 : 32000 проводили в объеме 100 мкл на лунку в 0,05 М кар-бонатно-бикарбонатом буферном растворе (рН 9,6) в течение 18 ч. при температуре 4 °С. Для блокирования остаточных свободных центров связывания в лунках планшета,
с которыми могут взаимодействовать любые последующие компоненты реакции, использовали 1%-й раствор БСА, инкубационный период в течение 60 мин. при температуре 37 °С. Очищенные специфические и нормальные антигены вносили по 100 мкл в лунку в разведении 1 : 10 и 1 : 160 соответственно и инкубировали антигены с иммуноглобулинами в течение 18 ч. при температуре 4 °С. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляли с добавлением вирусспецифиче-ского иммунопероксидазного конъюгата в разведениях 1 : 50 - 1 : 6400 соответственно. Планшеты инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 ч. Между этапами реакции несвязавшиеся компоненты удаляли путем промывания лунок планшета 3-4 раза промывочным буфере. Индикацию реакции проводили с помощью субстратного раствора с добавлением 0,02 % перекиси водорода. Через 30-45 минут - учет результатов. Значения оптической плотности измеряли при длине волны 405 нм (для АБТС) на спектрофотометре марки Labsystems Multiskan Plus (США).
Результат считать положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более раз превышает оптическую плотность контрольного (нормального) антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,2.
Результаты исследований
Для разработки лабораторных тест-систем важную роль играет качество (специфичность и активность) диагностических препаратов, используемых в эксперименте. В связи с этим нам необходимо было приготовить из вируссодержащей суспензии концентрированный очищенный антиген
для иммунизации животным с целью получения специфической антисыворотки. В результате проведенных исследований был отработан оптимальный метод очистки и концентрирования антигена с помощью ультрацентрифугирования через 20 % сахарозу. Для получения антисыворотки вируса ВБА предварительно, за 1 месяц до гипериммунизации, животных иммунизировали вирус-содержащей суспензией ВБА с активностью 7,0 ^ ТЦД50/см3 после трехкратного введения очищенного антигена в возрастающей дозе (80, 400, 900 мкг). Материал вводили внутримышечно в область предлопаточных лимфоузлов с интервалом между введениями в 2-3 недели в комплексе с адъювантом ГОА в конечной концентрации 2 %. Оценку активности и специфичности полученной сыворотки проводили в РДП. Активность специфической сыворотки, полученной по данной схеме, составила в РДП 1 : 8 - 1 : 16.
Из полученных антисывороток выделяли вирусспецифические иммуноглобулины с использованием методов спиртового осаждения по Кону и сернокислым аммонием. Активность вирусспецифических иммуноглобулинов исследовали на активность и специфичность в РДП. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.
Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что наиболее активные иммуноглобулины выделены с помощью спиртового осаждения по методу Кона. Предельная активность специфического иммуноглобулина составила 1 : 32000, а сенсибилизирующая доза - 1 : 1000. Использование иммуноглобулина в данной концентрации способствовало также его более высокой специфичности и возможности выявления антигена вируса болезни Ауески.
Таблица 1.
Оценка активности и специфичности иммуноглобулинов, выделенных спиртовым методом Кона и сернокислым аммонием, и приготовленных на их основе вирусспецифических конъюгатов в РДП и ИФА
Метод выделения иммуноглобулинов Активность в РДП Активность в ИФА Титр конъюгатов в ИФА
Спиртовое осаждение по Кону 1 : 8 - 1 : 16 1 :32000 1 :1600
Сернокислый аммоний 1 : 4 - 1 : 8 не исследовали 1 : 800
Таким образом, указанным методом показана способность полученных иммуноглобулинов дифференцировать вирус болезни Ауески по показаниям оптической плотности в прямом варианте иммуноферментного анализа при исследовании различных материалов.
Активность вирусспецифических конъю-гатов, приготовленных на основе данных иммуноглобулинов, в ИФА составила 1 : 1600, и соответственно рабочий титр - 1 : 100. Конъюгат на основе спиртового иммуноглобулина, приготовленной к антигену ВБА вышеуказанного штамма не давал неспецифических реакций с контрольными нормальными и гетерологичными антигенами в рабочем разведении.
С применением данного конъюгата были проведены исследования по отработке прямого варианта ИФА для обнаружения общих антигенов ВБА в различных испытуемых материалах. Чтобы исключить неспецифическую реакцию - сорбцию конъюгата на иммунный и неспецифический комплекс антиген - антитело, нами в дальнейшем были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех», в ходе которых были отработаны оптимальные температурно-вре-менные условия контакта диагностических препаратов между собой (которые длились от 1 до 3 ч. при 37 °С и от 16 до 24 ч. при 4 °С), испытаны рабочие концентрации компонентов реакции, а также подобраны солевые растворы для разведения диагностиче-
ских препаратов при постановке ИФА (где испытывались растворы ФСБ и ФБР с рН 7,2-7,4, а также КББ с рН 9,6 различных мо-лярностей). Данными исследованиями было показано, что наибольшей чувствительности метод достигает при следующих параметрах постановки реакции:
- сенсибилизация лунок полистироловых планшетов вирусспецифическим иммуноглобулином, взятым в рабочей концентрации, в течение 18 ч. при температуре 4 °С с дальнейшей обработкой лунок 1%-м раствором БСА в течение 60 мин. при температуре 37-38 °С;
- время контакта испытуемых и контрольных антигенов с иммуноглобулинами в течение 18 ч. при температуре 3-4 °С;
- взаимодействие вирусспецифических конъюгатов с антигенами в течение 60 мин. при температуре 37-38 °С, а затем с субстратом в течение 30-60 мин. при комнатной температуре;
- учет результатов реакции проводили на фотометре марки Labsystems Multiskan Plus (США) при длине волны 405 нм (для АБТС).
Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более раз превышает оптическую плотность контрольного (нормального) антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,2.
Отработанный вариант ИФА был применен нами для обнаружения антигенов ВБА
Таблица 2.
Результаты исследования в ИФА различных материалов ВБА и гетерологичных антигенов
№ п/п Наименование проб Титр в ИФА
1 20 % суспензия легкого, отобранного от здорового животного отрицательный результат
2 20 % суспензия сердца, отобранного от здорового животного отрицательный результат
3 20 % суспензия печени, отобранного от здорового животного отрицательный результат
4 20 % суспензия селезенки, отобранного от здорового животного отрицательный результат
5 20 % суспензия почки, отобранного от здорового животного отрицательный результат
6 нормальный (контрольный) антиген отрицательный результат
7 специфический антиген вируса бешенства отрицательный результат
8 специфический антиген вируса ИРТ КРС отрицательный результат
9 специфический антиген вируса чумы плотоядных отрицательный результат
10 специфический антиген вируса болезни Ауески 1 :2560
11 Культуральная суспензия вируса болезни Ауески 1 : 16
в различных испытуемых материалах. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Из данных таблицы видно, что разработанный вариант ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Специфический антиген вируса болезни Ауески в ИФА показал активность 1 : 2 560, культу-ральная проба 1 : 16. Все нормальные (контрольные) и гетерологичные пробы показали отрицательные результаты в ИФА.
Результаты проведенных исследований указывают на высокую эффективность разработанной тест-системы и возможность использования ее для диагностики ВБА. Хорошая чувствительность данного метода позволяет достоверно обнаруживать антиген ВБА, что в свою очередь даст возможность более оперативно осуществлять противоэпи-зоотические мероприятия, направленные на блокирование распространения инфекции, а создание диагностических тест-систем, таких как ИФА имеет большую практическую значимость в связи с возможностью внедрения их в практику здравоохранения и ветеринарии и тем самым повысить эффективность выявления этой важной в экономическом отношении инфекции.
Выводы
В результате проведенных исследований из козьей антисыворотки, полученной к антигену ВБА, выделены высокоактивные ви-русспецифические иммуноглобулины, на их основе приготовлены вирусспецифические иммунопероксидазные конъюгаты. С применением этих конъюгатов проведены исследования по отработке оптимальных условий постановки метода ИФА и тем самым разработан данный метод, пригодный для обна-
ружения общих антигенов ВБА в различных испытуемых материалах.
Список литературы
1. Ахмедов, А. М. Белки сыворотки крови при инфекционных болезнях животных [Текст] / А. М. Ахмедов. - М. : Колос, 1968. - С. 31-36.
2. Бъядовская, О. П. Применение дифференцирующего ИФА при болезни Ауески свиней [Текст] / О. П. Бъядовская, О. Г. Андреева, А. С. Оганесян и др. // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. -Владамир, 2006. - Т. 4. - С. 225-232.
3. Блотова, Г. А. Получения и оценка диагностических сывороток и иммуноглобулинов к вирусу болезни [Текст] / Г. А. Блотова, В. И. Диев, А. В. Константинов и др. // Акт. пробл. инфекц. пат. ж-ных : мат. Междунар. науч. конф., посв. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2003. - С. 203-208.
4. Егоров, А. М. Теория и практика иммунофер-ментного анализа [Текст] / А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова. - М. : Высш. шк., 1991. -288 с.
5. Коломыцев, А. А. Болезнь Ауески свиней. Современная эпизоотическая ситуация и меры борьбы [Текст] / А. А. Коломыцев, И. В. Амирова, А. А. Стри-жаков и др. // Ветеринарный консультант. - 2007. -№ 13. - С. 7-10.
6. Мищенко, А. В. Экологические особенности вируса болезни Ауески [Текст] / А. В. Мищенко, Н. А. Яременко, В. М. Захаров и др. // Болезнь Ауески свиней: сб. науч. работ. - Владимир, 2001. - С. 43-45.
7. Моренков, О. С. Болезнь Ауески: дифференциация инфицированных и вакцинированных животных методом блокирующего ИФА на основе моноклональ-ных антител [Текст] / О. С. Моренков, Ю. А. Собко, В. А. Сергеев и др. // Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. -211 с.
8. Пономарева, Н. А. Гамма-глобулин [Текст] / Н. А. Пономарева, А. С. Нечаева. - М., 1985 г.
9. Самуилов, В. Д. Иммуноферментный анализ / В. Д. Самуилов // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 12. - С. 9-15.
10. Фримель, Г. Иммунологические методы [Текст] / Г. Фримель. - М. : Медицина, 1987. - 472 с.
11. Wilson, M. B. Resent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies [Текст] / M. B. Wilson, P. K. Nakane // Biomedical press. - 1978. - P. 215-244.
Ф
Форум для ветеринарных специалистов: www.ivb.forum24.ru/70-18-0
