CC BY
81УДК 576.3+619:615+619:616.98
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ВНК-21/13-13 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН ПРОТИВ ЯЩУРА, БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И БЕШЕНСТВА
1А.Я.Самуйленко - доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАН;
1Н.В.Мельник - доктор ветеринарных наук, профессор; 1С.А.Гринь - доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН; 1Р.Н.Мельник - кандидат биологических наук;
Ю.Ю.Федорова - соискатель; 1И.В.Стоянов - соискатель; И.В.Федорова - соискатель;
И.Е.Стоянова - соискатель; С.В.Пажнов - соискатель; 1А.А.Круглов - соискатель;
2И.Ю.Литенкова - кандидат ветеринарных наук, 2Е.Н.Крюкова - кандидат биологических наук;
2В.В.Ельников - кандидат ветеринарных наук.
1ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (141142, Московская область, пос. Биокомбинат, тел.: +7(496) 567-32-63, е-mail: vnitibp@mail.ru).
2ФКП «Щелковский биокомбинат» (141142, Московская область, пос. Биокомбинат, тел.: +7(495) 134-58-85, e-mail: comerc@biocombinat.ru).
Эпизоотическая ситуация по болезни Ауески, ящуру и бешенству остается напряженной, как в Российской Федерации, так и в других странах мира. В связи с этим совершенствование промышленных технологий изготовления вакцин против этих заболеваний является актуальной задачей. В статье приведены результаты исследования промышленного культивирования перевиваемой монослойно-суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-13, которые легли в основу оптимизации процесса культивирования в автоматическом режиме для последующего изготовления вакцин против болезни Ауески, бешенства, ящура. Оптимизация процесса промышленного культивирования проводилась на ФКП «Щелковский биокомбинат» в ферментерах емкостью 5,0-2000 л, которые предназначены для производства вакцин против болезни Ауески; бешенства и ящура. Клеточная биомасса, полученная по разработанной технологии, высокочувствительна к заражению вирусами ящура, бешенства и болезни Ауески, а полученное вирусное сырье обладает высокой антигенной активностью.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: культура клеток, вирус болезни Ауески, бешенство, ящур, питательные среды, реакторы, ферментеры, промышленные регламенты, штаммы.
В настоящее время хорошо изучены биологические свойства возбудителей болезни Ауески, ящура и бешенства, разработаны меры борьбы с болезнями, которые они вызывают, созданы и успешно применяются средства специфической профилактики против них. Однако, анализ литературных данных свидетельствует о том, что эпизоотическая ситуация по этим инфекциям остается напряженной, как в РФ, так и в других странах мира [1, 5]. В связи с этим совершенствование промышленных технологий изготовления вакцин против этих заболеваний является актуальной задачей. Болезнь Ауески, ящур и бешенство - инфекционные заболевания вирусной этиологии, возбудители которых репродуцируются в первичных культурах клеток куриных эмбрионов (КЭ), почек крупного рогатого скота, обезьян, ягнят, свиней и перевиваемых линиях клеток: Не1а, ПЭС, ППК-66б, ППК-Д, ФЛ, ПЭКр, ПСГК, ПСГК-60, ВНК-21, ВНК-21/13 и многих других [7, 8, 9, 10, 11, 12].
Для разработки промышленной технологии репродукции вирусов огромный интерес представляют чувствительные к данным вирусам перевиваемые клеточные линии, способные культивироваться безопорным,
суспензионным способом в ферментерах емкостью от 50 л до 2000 л. Перевиваемая культура клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 неприхотлива при культивировании, продуктивна и высоко чувствительна ко многим вирусам, в том числе и к вирусам болезни Ауески, ящура и бешенства [3, 4]. В связи с огромной востребованностью этой культуры при биотехнологических разработках было получено много клонов и трофова-риантов этой линии, отличающихся друг от друга ка-риологическими характеристиками, культуральными и биофизиологическими свойствами. Известны и широко применяются следующие трофоварианты культуры клеток ВНК-21: ВНК-21/13; ВНК-21/15; ВНК-21/13-17; ВНК-21 /13-2; ВНК-21/13-13; ВНК-21/13-200 [6]. На ФКП «Щелковский биокомбинат» для масштабированного производства клеточной биомассы была получена перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 с высоким индексом пролиферативной активности, адаптированная к культивированию в оригинальной питательной среде, разработанной на ФКП «Щелковский биокомбинат» при аэрации клеточной суспензии стерильным воздухом, без дополнительной
подачи СО2. Полученная клеточная сублиния высоко чувствительна к вирусу болезни Ауески штамм «Скиф», вирусам бешенства штаммы: «РВ-97», «Щелково-51»; вирусам ящура типов: А, О, Азия-1; вирусам диареи крупного рогатого скота, а также к некоторым другим возбудителям болезней животных.
Учитывая продуктивность и высокую чувствительность ВНК-21 /13-13 к вирусам разных таксономических групп, на ФКП «Щелковский биокомбинат» было принято решение о создании гибко-блочной модульной технологии изготовления профилактических биопрепаратов против болезни Ауески, бешенства и ящура, основанной на том, что получаемая биомасса клеток может быть использована по мере необходимости для заражения разными вирусами и получением на их основе вакцин.
Цель работы - оптимизировать процесс промышленного культивирования перевиваемой монослой-но-суспензионной сублинии клеток ВНК-21/13-13 в автоматическом режиме в ферментерах емкостью 5,0-2000 л для производства вакцин против болезни Ауески из аттенуированного производственного штамма «Скиф», бешенства из штаммов «Щелко-во-51», «РВ-97» и ящура из штаммов Asia-1/Sindh-08; 0/PanAsia-2/Ant-10; «A/G-VII/SAU2015», «А/Иран-05».
Материалы и методы. В работе использовали перевиваемую монослойно-суспензионную сублинию клеток ВНК-21/13-13, посевную расплодку вируса болезни Ауески аттенуированного производственного штамм «Скиф»; посевную расплодку вируса бешенства штамм «Щелково-51»; посевную расплодку вируса ящура штамм Asia-1/Sindh-08; посевную расплодку вируса ящура штамм 0/PanAsia-2; посевную расплод-ку вируса ящура штамм «A/G-VIISAU2015»; каскад ферментеров фирм Applicon и Roland. Питательную среду для суспензионного культивирования клеток ВНК-21/13-13 готовили по оригинальной прописи.
Концентрацию клеток в суспензии учитывали с помощью камеры Горяева (модель 851).
Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли при подсчете клеток с окрашиванием по общепринятой методике.
Интенсивность клеточной пролиферации определяли по кратности прироста клеток за 48 часов (отношение количества конечной концентрации клеток к исходной концентрации в пределах одного пассажа).
Суспензию ВНК-21/13-13 клеток заражали:
- штаммами: Asia-1/Sindh-08; O/PanAsia-2; A/G-VII/SAU2015 вируса ящура, согласно промышленного регламента на «Производство вакцины ящурной культуральной моно-и поливалентной сорбированной инактивированной»; «Промышленного регламента на производство вакцины ящурной куль-туральной моно-и поливалентной эмульгированной инактивированной»;
- штаммом вируса бешенства «Щелково-51», «РВ-97» согласно «Промышленного регламента на производство вакцины антирабической инактивированной жидкой культуральной»;
- штаммом вируса болезни Ауески «Скиф» согласно «Промышленного регламента на производство вакцины против болезни Ауески культуральной эмульгированной инактивированной», утвержденных директором ФКП «Щелковский биокомбинат».
Для отработки технологии получения клеточной биомассы, ревилитацию клеток ВНК-21/13-13 после криоконсервирования осуществляли быстрой размо-розкой с последующим центрифугированием суспензии при 800-1000 об/мин в течение 15 мин.
Надосадочную среду, содержащую криопротектор диметилсульфоксид, сливали, концентрат клеток ре-суспендировали в ростовой питательной среде и культивировали прямыми последовательными пассажами, отъёмно-доливным способом.
Ревилитацию клеток, посевных расплодок после криоконсервирования проводили в течение 2-х последовательных пассажей в биоферментёре фирмы «MARUBISHI» (Япония) емкостью 5 л с автоматическим поддержанием основных жизненно важных параметров культивирования: концентрации водородных ионов (рН 7,0±0,3), температуры (37±0,50С), скорости перемешивания (40 об/мин) и подачи воздуха. Полученную культуру признавали пригодной для дальнейшего использования, если концентрация клеток составляла не ниже 2,5 млн/мл; доля жизнеспособных клеток не менее 98%; контаминация культуры посторонней микрофлорой отсутствовала. Суспензию клеток, отвечающую вышеперечисленным требованиям, переводили в ферментеры большей ёмкости: 150 л, 1000 л, 2000 л. Вся цепочка реакторов соединена трубопроводами для загрузки питательных сред, суспензии клеток и передачи продукта из одного ферментера в другой в автоматическом режиме.
Для подготовки к работе на первом этапе необходимо было отработать режимы мойки и стерилизации систем культивирования клеток, обеспечивающие стерильность и безвредность конечного продукта, а также режимы культивирования клеток. Программное обеспечение для поддержания оптимальных параметров культивирования клеток, должно быть отработано для каждой клеточной линии в зависимости от особенностей её пролиферации.
Подобранные режимы при проведении испытаний задавались на панели управления для запуска программы CIP мойки (Clean In Place), стерилизации системы в автоматическом режиме, а также для обеспечения оптимального режима культивирования клеток.
Отработку режимов культивирования клеток ВНК-21/13-13, обеспечивающих максимальный выход, про-
водили по следующим параметрам.
1. Начальная концентрация клеток при культивировании безопорным способом.
2. Оптимальная скорость перемешивания суспензии в зависимости от типа мешалки
3. Температура культивирования клеток.
4. Выбор оптимальной концентрации водородных ионов (рН) на протяжении всего цикла культивирования.
5. Способ аэрации суспензии.
6. Определение параметров растворенного кислорода, необходимое для клеточной пролиферации.
7. Время культивирования клеток.
Для воспроизведения стандартности условий культивирования клеток ВНК-21/13-13 в ферментерах разных объемов исследования таких параметров как объем клеточной суспензии, начальная концентрация клеток, способ и режим аэрации, скорость перемешивания, поддержание рН, проводились не менее, чем в 6 повторах для каждого объема реактора.
Для обработки результатов использовали статистические методы, используемые в биологии.
Результаты исследований. В результате оптимизации режима культивирования клеток ВНК-21/13-13 в автоматическом режиме при каскадном способе выращивания была получена клеточная суспензия с показателями, указанными в таблице 1. Данная клеточная суспензия была использована для репродукции вирусов болезни Ауески, бешенства и ящура. При заражении суспензии клеток ВНК-21/13-13 вирусами яшура штаммами: А$1а-1/81п^-08; 0/РапДв1а-2; А/в-У!!/8А112015, вирусом бешенства штаммами «Щел-ково-51», «РВ-97», вирусом болезни Ауески штамм «Скиф» по методикам, утвержденным в промышленных регламентах, было получено вирусное сырьё, отличающееся стабильными биологическими свойствами, как по инфекционной, так и по антигенной активности (табл. 2). Наилучшие результаты по выходу клеточной биомассы до 4,0 млн/мл при жизнеспособности 98% за 48 часов культивирования были получены при начальной концентрации клеток в пределах 0,4-0,5 млн/ мл, где ростовая питательная среда для обеспечения пролиферативной активности клеток ВНК-21/13-13 имела следующие физико-химические показатели:
- величина рН 7,2±0,2 (с сывороткой);
- осмоляльность или показатель криоскопии: от -0,62 до -0,700С;
- буферная емкость 3,5±0,5 мг экв. НС1_/л;
- концентрации растворенного кислорода Э0 (10 - 30%);
- температуры 36,5 - 370С;
- скорость перемешивания суспензии до 40 об/мин.
Данные параметры задавали по программному
обеспечению и поддерживали в автоматическом режиме на протяжении всего цикла культивирования.
Наилучшим способом аэрации культуры, обеспечивающим равномерное насыщение суспензии клеток кислородом (от 10 до 30%) во всех реакторах оказался метод барбатирования из расчета 0,5-1,5 л/час на литр суспензии. Поверхностная аэрация клеточной суспензии не способствовала насыщению клеток кислородом и приводила к гибели клеточной популяции. Поддержание концентрации водородных ионов при культивировании осуществляли 7,5% раствором бикарбоната натрия, который подавался автоматически с заданной программой по мере изменения рН.
По предлагаемой программе мойка всей системы должна производиться в 5 этапов: мойка детергентом, ополаскивание деминерализованной водой, мойка дезинфекционном раствором (перекись водорода), ополаскивание деминерализованной водой, мойка водой для инъекций (850С). Время мойки каждым раствором должно составлять не менее 7 мин, в результате общее время мойки 1 единицы составит от 35 до 50 минут.
После окончания мойки программа автоматически останавливает С!Р мойку, продувает трубопроводы сжатым воздухом и ставит статус реактору «Очищено». Только после того, как реактор получит статус «Очищено» можно перейти к стерилизации сосудов и подходящих к нему трубопроводов. Реактор стерилизуется дробно чистым паром в течение 1 часа при температуре не менее 1210С.
С!Р стерилизация сосудов и проводящих систем проходит в несколько этапов:
• Нагревание рабочей емкости до заданной температуры стерилизации (1210С).
• Преднагрев воздушных фильтров приходящего и уносимого воздуха до температуры 900С.
• Стерилизация сосуда при температуре не менее 1210Св течении 35 минут.
• Охлаждение биореактора до температуры 370С.
Процесс стерилизации проходит в автоматическом режиме с заранее заданными параметрами на панели управления реактором. После стерилизации программа поставит реактору статус «Стерильно». После того как реактор получил статус «Стерильно» на панели управления реактором должен быть обозначен режим культивирования клеток, включающий в себя:
• Автоматическое поддержание температуры культивирования;
• Автоматическое поддержание растворенного кислорода (Э0);
• Автоматическое поддержание pH;
• Автоматическое поддержание скорости перемешивания суспензии.
Наработанный вирусный материал, после инактивации был использован для изготовления промышленных серий вакцин: «Вакцина ящурная культуральная моно- и поливалентная эмульгированная инактивиро-ванная» типов А, О, Азия-1 серии № 5301Э; 5302Э дата
Таблица 1
Характеристика производственной линии культуры клеток BHK-21/13-13, полученной при автоматическом режиме поддержания параметров культивирования (п=6)
Емкость ферментера, л Пассаж Кол-во клеток, млн/мл
5,0 1-2 2,5±0,5
150 3-4 3,5±0,5 млн/мл
1000 5-6 3,8 ±0,4млн/мл
2000 7-8 4,2±0,3млн/мл
Индекс пролиферации не менее 6
Жизнеспособность, % не менее 98
Время удвоения популяции, ч 16
Таблица 2
Биологическая характеристика вирусов, репродуцированных в культуре клеток ВНК-21/13-13 (п=6)
Вирус Концентрация клеток при заражении, млн/см3 Доза заражения, ТЦД/кл Время репродукции, ч Показатели качества вируса
инф. активность, 1д ТЦД50/см3 146 Б (мкг/см3) кол-во гликопротеида (ГАЕ)
Болезни Ауески штамм «Скиф» 3,0±0,25 0,01 72±2 9,25±0,25 - -
Штамм «Щёлково -51» вируса бешенства 2,5±0,25 0,1 72 7,5±0,25 4
Штамм «РВ-97» вируса бешенства 2,5±0,25 1,0 48 8,0±0,25 4
Штамм «А/Иран-05» вируса ящура 2,5±0,25 0,1 14±2 7,8±0,23 2,5±0,5
Штамм Аз1а-1/81п^-08 вируса ящура 2,5±0,25 0,01 16±1 7,6±0,05 2,7±0,2
Штамм 0/РапАв1а-2 вируса ящура 2,5±0,25 0,1 12±2 7,9±0,25 2,8±0,3
Штамм А/0^11/БАи2015 вируса ящура 2,5±0,25 1,0 18±1 7,5±0,25 2,6±0,5
изг. 05.2016 г.; «Вакцина ящурная культуральная моно-и поливалентная сорбированная инактивированная» типов А, О, Азия-1 серии № 5301, 5302 от 04.2016 г.; «Вакцина против болезни Ауески инактивированная эмульгированная маркированная» серии № 4,5 от 03.2016 г.; «Вакцина антирабическая инактивирован-ная жидкая культуральная (Рабиков)» серии № 8,9 от 03.2016 г. Все опытно-промышленные серии вакцин прошли контроль качества согласно НТД на препараты и были выпущены для реализации.
Заключение. В результате проделанной работы была разработана, апробирована и запущена в эксплуатацию программа по культивированию клеток ВНК-
21/13-13 в автоматическом режиме поддержания основных параметров культивирования на каскаде реакторов от 150 до 2000 л. Внедрение этой технологии позволило исключить случайную контаминацию клеточных культур посторонней микрофлорой, увеличить выход клеточной биомассы до 4,5 млн/мл при жизнеспособности 98%, значительно снизить долю ручного труда в производственном процессе. Программы и все стадии технологического процесса валидированы. Клеточная биомасса, полученная по разработанной технологии, высокочувствительна к заражению вирусами ящура, бешенства и болезни Ауески, а полученное вирусное сырье обладает высокой антигенной активностью.
Литература
1. Инфекционная патология животных / А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. -М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 1911 с.
2. Дьяконова Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Л.П.Дьяконова. - М.: Изд-во «Спутник+», 2009. - 656 с.
3. Культивирование клеток и тканей животных. 2 Часть / Л.П.Дьяконов [и др.]. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988. - 91 с.
4. Фрешни, Р. Методы. Культура животных клеток / Р.Фрешни. - М.: Мир, 1989. - 333 с.
5. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А.Сергеев. - М.: Колос, 1976. - 303 с.
6. Дьяконов, Л.П. Специализированная Коллекция клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) РККК РАН и криобанк ВИЭВ, «Консервация генетических ресурсов»: материалы XIV рабочего совещания, Пущино, 28-30 мая 1996 г. / Л.П.Дьяконов. - Пущино, 1996. - С. 76-79
7. Уласов, В.И. Проблемы борьбы с болезнью Ауески у свиней / В.И.Уласов, А.А.Ольшанская // Ветеринария. - 2009. - № 1. - С. 20-23.
8. Чувствительность животных разных видов к вирусу болезни Ауески / В.А.Мищенко, Е.П.Баборенко, Л.Н.Корниенко [и др.] // Ветеринария. - 1994. - № 5. - С. 20-22.
9. Ящур / А.Н.Бурдов, А.И.Дудников, П.В.Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
10. Инфекционная патология животных. Том !. Ящур / А.Я.Самуйленко [и др.]. - М., 2014. - 909 с.
11. Груздев, К.Н. Бешенство животных / К.Н.Груздев, В.В.Недосеков. - М.: Аквариум, 2001. - 304 с.
12. Акиньшина, Т.В. Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Т.В.Акиньшина. - Щёлково, 2005. - 28 с.
THE OPTIMIZATION OF THE INDUSTRIAL CULTIVATION PROCESS OF BHK-21/13-13 CELL CULTURE FOR PRODUCTION OF VACCINES AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE, AUJESZKY'S DISEASE AND RABIES
'Samoilenko A.Ya. - Doctor of Veterinary Sciences, professor, Academician of RAS;
'Melnik N.V. - Doctor of Veterinary Sciences; 'Grin S.A. - Doctor of Biological Sciences, professor, Corresponding member of RAS; 'Melnik R.N. - Candidate of Biological Sciences;
1Fedorova O.Y. - applicant; 'StoyanovI.V. - applicant; 1Fedorova N.V. - applicant; 1Stoyanova I.E. - applicant; 'PazhnovS.V. - applicant; 'Kruglov A.A. - applicant;
2Litenkova I.Y. - Candidate of Veterinary Sciences; 2Kryukova E.N. - Candidate of Biological Sciences;
2Elnikov V.V. - Candidate of Veterinary Sciences.
'All-Russian Research and Technological Institute of Biological Industry, Moscow region
(e-mail: vnitibp@mail.ru).
2FSE«Shchelkovo Biokombinat», Moscow region (e-mail: comerc@biocombinat.ru).
The epizootic situation of Aujeszky's disease, foot-and-mouth disease and rabies persists tense both in the Russian Federation and in other countries of the world. In connection with that the improvement of industrial technologies of vaccines manufacture against these diseases is an actual problem. The article presents the research results of the industrial cultivation of a monolayer suspension of BHK-21/13-13 finite cells culture that formed the basis for the optimization of the culture process in an automatic mode for the subsequent manufacture of vaccines against Aujeszky's disease, rabies, and foot-and-mouth disease. The optimization of the industrial cultivation process was carried out at the FSE "Shchelkovo Biocombinat" in the reactors with a capacity of 5.0-2000 liters to be intended for the production of vaccines against Aujeszky's disease, rabies and foot-and-mouth disease. The cell's biomass obtained according to the developed technology is high sensitive to viral infection of foot-and-mouth disease, rabies and Aujeszky's disease, and the obtained virus material has a high antigenic activity.
KEYWORDS: cell culture, Aujeszky's disease virus, rabies, foot-and-mouth disease, culture medium, reactors, fermenters, industrial regulations, strains.
