CC BY
74
УДК 619:615.57.012
В. Н. Трифан, А. Я. Самуйленко, Р. Н. Мельник, Н. К. Еремец, И. В. Павленко, Т. А. Скотникова, Л. А. Неминущая, Л. Б. Соловьев, А. В. Канарский
ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ
АССОЦИИРОВАННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
Ключевые слова: адъюванты, эмульгатор-139, оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол. культивирование бактерий, вакцина.
Разработана экологически безопасная технология получения ассоциированной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза животных. Вместо «водно-маслянной» эмульсии предложено использовать «водно-масляно-водную» эмульсию с экологически безвредным адъювантом - эмульгатор-139 или оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол. Определены эффективные параметры культивирования с использованием экологически безопасных адъювантов.
Keywords: adjuvants, emulsifier-139, oxyethylized C7-C10 Alkylphenol. cultivation of bacteria, vaccine.
Developed environmentally sound technology of associated vaccines against anthrax and animal necrobacteriosis. Suggested to use instead of "water-oil" emulsion "water-oil-water emulsion with environmentally friendly" adjuvants-emulsifier-139 or oxyethylized C7-C10 Alkylphenol. The effective parameters of cultivation with the use of environmentally safe adjuvants.
Актуальность
В настоящее время биотехнология является активно развивающейся отраслью
промышленности, ответственной за разработку и производство широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве способствует повышению продуктивности животных, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства [1, 2, 3].
Северное домашнее оленеводство России в историческом плане развивалось как комплексный источник жизнеобеспечивающий основы коренных и малочисленных народов Севера, Сибири и Дальнего Востока [4].
Дальнейшее развитие северного оленеводства необходимо в направлении интенсификации отрасли с учетом проведения ветеринарных мероприятий - борьбы с особо опасными инфекциями по сохранению северного оленя с помощью вакцинопрофилактики.
Внедрение ассоциированных вакцин нового поколения с высокой эффективностью в данном случае против сибирской язвы и некробактериоза, позволяет экономить материально-технические, финансовые и людские ресурсы [5, 6].
Характер ведения оленеводства, связанный с условиями этой отрасли животноводства, создает благоприятные условия для возникновения и распространения этих болезней. Это обусловлено и тем, что возбудитель сибирской язвы длительное время может сохраняться во внешней среде, а возбудитель некробактериоза является постоянным обитателем в организме северных оленей, представляя потенциальную опасность для не иммунизированного поголовья животных.
В настоящее время в Республике Саха (Якутия) зарегистрировано 285 неблагополучных пунктов по сибирской язве. Учет регистрации вспышек сибирской язвы в республике ведется с 1900 года. Последний случай эпизоотий сибирской язвы на территории республики был зарегистрирован в 1993 году в Мирнинском районе.
Некробактериоз среди северных оленей регистрируется по всей площади арктической зоны, ежегодно заболевает в среднем от 3,5 до 5,2 тыс. голов домашних северных оленей. За последние пять лет в 45 неблагополучных пунктах 12 районов заболело 48138 оленей, из них пало 9537 (19,8 %). Заболевание носит сезонный характер, проявляется и распространяется в основном в июле-августе месяцах, когда стоит наиболее высокая температура воздуха и отмечается активный лет кровососущих насекомых. В конце лета (август) болезнь идет на убыль, а в сентябре - прекращается. Заболевание среди молодняка протекает крайне тяжело.
Известно несколько технологий производства вакцин:
- вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота, содержащая в равных объемных соотношениях инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из местных эпизоотических культур возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина [7]. Однако данная вакцина недостаточно иммуногенна, так как требует двукратного введения и обеспечивает иммунитет только против некробактериоза в течение 3,5 - 4 мес. Кроме того, при получении вакцины осуществляют предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве.
- вакцина против сибирской язвы животных, содержащая суспензию живых спор бескапсульного авирулентного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы (ТУ 9388-00400008064-99).
- инактивированная вакцина против некробактериоза животных, содержащая инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из производственного штамма "0-1" ВИЭВ возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина [7, 8]. Существующие моновакцины применяют независимо друг от друга и не создают иммунитет у животных одновременно против сибирской язвы и некробактериоза. Использование этих вакцин в отдельности требует удвоенного количества трудозатрат и оказывает сильное стрессовое влияние на состояние животных.
- ассоциированная вакцина против сибирской язвы, анаэробной дизентерии и инфекционной энтеротоксемии овец, содержащая суспензию жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в исходной концентрации (3 - 4)* 10 8 спор в 1 см3, анатоксины
perfrmgens типов С с исходной активностью 100
- 150 ЕС в 1 см3 и Д с исходной активностью 60 - 80 ЕС в 1 см3 и физиологический раствор [9]. Однако эта вакцина не обеспечивает создание достаточного иммунитета против сибирской язвы и некробактериоза.
- вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18
- 20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе и адъювант, причем инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин адсорбирован 12 - 15 % гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4 -8,6, взятом в конечной концентрации 1,8 - 2,0 %, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ используют с исходной концентрацией (5 - 5,2) *107 в 1 см3 физиологического раствора, а в качестве адъюванта содержит сапонин при определенном соотношении компонентов [10], и способ ее получения.
В настоящее время для профилактики сибирской язвы в России и странах СНГ применяют живую моновакцину, которую получают на основе высоко иммуногенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, а для профилактики некробактериоза
- используют инактивированную масляную вакцину. Однако, несмотря на наличие этих препаратов, практическая ветеринарная служба нуждается в ассоциированной вакцине, что обусловлено совпадением неблагополучных зон по сибирской язве и некробактериозу, а также необходимостью формирования, при некоторых эпизоотических ситуациях, в короткие сроки иммунитета против этих болезней.
Следует отметить, что при использовании моновакцин в хозяйствах возникают трудности с составлением прививочного календаря вакцинации, поскольку при формировании полноценного
иммунитета между отдельными прививками требуется соблюдение определенного интервала. Применение ассоциированной вакцины могло бы значительно снизить затраты на проведение прививок, уменьшить потери продуктивности оленей вследствие стресса и травмирования животных при вакцинации.
Для усиления иммуногенности вакцин (в частности вирусных - против ящура, парагриппа-3, болезни Ауески, чумы плотоядных, инфекционного гепатита собак, болезни Гамборо, ньюкаслской болезни, гриппа лошадей, ротавирусной диареи телят и других болезней) в практике их производства используют эмульгированнве адъюванты с применением эмульсий типа «вода-масло». В качестве компонентов классического неполного адъюванта применяют минеральные масла (например, «Маркол»), в которых растворяют до 10% липофильного эмульгатора — маннида моноолеата (например, «Арлацел А» или «Монтанид»).
Основными недостатками
эмульгированных адъювантов на основе водно-масляных эмульсий являются токсичность, высокая реактогенность и вязкость, недостаточная стабильность эмульсий.
Широкое использование некоторых масляно-адъювантных вакцин, содержащих «Арлацел А», было прекращено в связи с обнаружением канцерогенности адъювантного субстрата.
Недостатки водно-масляных эмульсий могут быть преодолены благодаря включению в рецептуру гидрофильного эмульгатора, который повышает дисперсность водных капель вакцины в масляной фазе и обеспечивает стабильность эмульсии. Так с целью снижения токсичности предложены другие эмульгирующие системы, в том числе содержащая «Маркол 52», с добавлением гидрофильного эмульгатора. В результате такой технологии образуется эмульсия типа «вода-масло-вода».
Эмульсии типа «вода-масло--вода» были предложены как средство решения проблемы вязкости, которая весьма актуальна для эмульсий типа «вода-масло». По сравнению с простой эмульсией двойная эмульсия, обладающая такой же антигенностью, имеет меньшую вязкость, более стабильна; вызывает менее выраженные пролиферативные образования в месте инъекции.
Таким образом, проблема разработки стабильных безопасных (нетоксичных)
эмульгированных адъювантов является актуальной с точки зрения обеспечения экологически безопасной технологии производства
ассоциированных бактериальных вакцин для животных.
Цель настоящей работы: разработка экологически безопасной технологии
ассоциированной вакцины для профилактики и защиты животных от сибирской язвы и некробактериоза.
Для достижения цели решались следующие
задачи:
- исследование влияние экологически безопасных адъювантов на свойства противосибиреязвенного и противонекробактериозного компонентов вакцины;
- разработка технологии ассоциированной эмульсионной вакцины и ее испытание in vivo.
Материалы и методы
Объекты исследований. При исследовании и разработке технологических процессов производства вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных использовали производственные штаммы Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, 55-ВНИИВВиМ.
С целью снижения токсичности (в частности, канцерогенности адъюванта Арлацел А) в работе использовали новый тип адъюванта, приготовленный на основе минеральных и неминеральных масел и их смесей, который позволяет получить эмульсию типа «вода-масло-вода» - безвредный эмульгатор-139 -
оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол, в соотношении: 8 % эмульгатора №139 или оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол и 92 % минерального масла «Маркол».
Благодаря включению в рецептуру гидрофильного эмульгатора, такого как эмульгатор-139, возможно, кроме снижения токсичности, преодолеть такой значительный недостаток традиционных эмульгированных адъювантов. как высокая вязкость и недостаточная стабильность.
Методы доклинических испытаний. Морфологию бактериальных культур определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства - путем высева их на МПА и МПБ. Жизнеспособность определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопептонным агаром. Длительность фаз роста, максимальной удельной скорости, минимального времени удвоения культур определяли графическим методом.
Клинические испытания. Образцы ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза испытывали на безвредность и иммуногенность на морских свинках и кроликах. Вакцина не должна вызывать гибель животных в течение 10 сут. наблюдения.
Результаты исследований
Прототипом исследований служила ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, которая содержит:
- экзотоксин лейкоцидин -высокоочищенный белок с молекулярной массой 18 - 20 кДа, с содержанием белка 5,5 - 6 мг %, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивированный формалином и адсорбированный на гидроокиси алюминия;
- суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5 - 5,2)* 109 спор/см3 в 1 см3 физиологического раствора, 1,0 - 1,21М раствор метабисульфита натрия и масляный адъювант;
- при следующем соотношении компонентов (мас. %): лейкоцидин - 32,0 - 34,0; суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5 - 5,2)*109 - 2,2 - 2,4; масляный адъювант - до 100 %.
Разработанная экологически безопасная технология производства ассоциированной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза состоит из следующих этапов:
- культивирование штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, инактивирование его формалином, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием, выделение из культуральной жидкости экзотоксина - лейкоцидина, его очистка, концентрирование ультрафильтрацией на полых волокнах и адсорбция на гидроокиси алюминия в гликолевом буфере;
- добавление суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапонина.
Новая технология отличается от существующей тем, что:
- перед адсорбцией на гидроокиси алюминия к экзотоксину добавляют 1 - 10 % инактивированной бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием 7,0 - 7,7 млрд клеток в 1 см3;
- глицерин и смесь минерального масла «Маркол-52» и эмульгатора, взятых в весовых соотношениях 1:1 (0,9 - 1,1), соответственно, добавляют после добавления сапонина;
- соотношение компонентов следующее, мас. %: суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (2,5 - 3,0) * 107в 1 см3 физиологического раствора - 1,0 - 1,2; сапонин 10,0 - 15,0 %; глицерин - 20,0 - 30,0 %; смесь минерального масла «Маркол-52» и эмульгатора-139, взятых в весовых соотношениях 1:1 (0,9 -1,1), соответственно 15,0 - 20,0 %; инактивированный формалином лейкоцидин -экзотоксин с м.м. 18 - 20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 - 7,0 мг %, адсорбированный 12 - 15 % гидроокисью алюминия в гликолевом буфере с рН 8,4 - 8,6, взятой в конечной концентрации 1,8 - 3,0 % - до 100 %.
- в качестве эмульгатора содержит эмульгатор-139 (оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол).
На основе проведенных исследований разработана экологически безопасная технология получения ассоциированной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза животных, которая включает две основных стадии: получение
противосибиреязвенного компонента вакцины и получение противонекробактериозного компонента вакцины.
Технология противосибиреязвенного компонента вакцины
Приготовление рабочей расплодки (Production seed) штамма 55-ВНИИВВиМ. Споровую культуру (Working seed) производственного вакцинного сибиреязвенного штамма 55 (лиофилизированную или в 30 %-ном растворе глицерина) в ампуле разводят в 5 см3 стерильного мясного бульона (МБ). Полученной суспензией спор в количестве 0,5 см3 засевают склянки широкогорлые вместимостью 3,0 дм3, заполненные на 2/3 объёма стерильным МБ, и одновременно две пробирки с МПБ и МПА. Посевы культивируют при температуре (37 ±
1)°С в течение (22 ± 2) часов. Количество рабочей расплодки должно обеспечивать производство одной серии вакцины. Через (22 ±
2) часа выросшую микробную культуру контролируют на чистоту, типичность роста и подвижность. При условии получения положительных результатов производят засев рабочей расплодки на стерильный мясной кислотно-гидролизатный агар (МКГА) в «четвертях».
Изготовление производственной
суспензии спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 на мясном кислотно-гидролизатном агаре. При засеве МКГА в каждую «четверть» асептически вносят по 10 - 12 см3 рабочей расплодки штамма 55. Засев производят иглой, вводя её между ватно-марлевой пробкой и внутренней поверхностью горловины
«четверти». Одновременно, с целью контроля, делают высевы рабочей расплодки по 0,2 - 0,3 см в МПБ, МП11Б под вазелиновым маслом, на МПА, агар Сабуро в две пробирки с каждой средой и по 0,5 - 1,0 см в два флакона с МППБ под вазелиновым маслом.
Посевы в/на мелких питательных средах культивируют в течение 10 суток при температуре (37 ± 1) °С, на агаре Сабуро при (22 ± 2) °С.
После равномерного увлажнения рабочей расплодкой всей поверхности агара засеянные «четверти» в вертикальном положении ставят в термостат при температуре (33 ± 1) °С на трое суток. Через указанное время в выросших культурах определяют степень спорообразования, используя для этого 2 % засеянных четвертей.
Степень спорообразования проверяют в неокрашенных и окрашенных мазках. Количество спор, видимых в поле зрения микроскопа при просмотре препарата «раздавленная капля» или окрашенного мазка, должно быть не менее 90 %. При степени спорообразования менее 80 % допускают культивирование «четвертей» с посевами дополнительно в течение одних суток. При достижении показателя степени спорообразования (95 ± 5) % культивирование
«четвертей» с посевами прекращают.
Все «четверти» подвергают визуальному просмотру в проходящем свете на чистоту и типичность роста вакцинной сибиреязвенной культуры.
Споровую культуру вакцинного штамма 55 с типичным ростом, при условии получения положительных результатов высевов на чистоту, типичность и отсутствие подвижности бацилл рабочей расплодки, смывают стерильной водой для инъекций из расчета (175 ± 25) см на одну «четверть». Смытую бакмассу декантируют из «четвертей» при помощи перистальтического насоса и сифона с трёхслойным марлевым фильтром, задерживающим частицы питательного агара, в стерильные стеклянные широкогорлые склянки вместимостью 3 дм с бусами на дне.
Склянки с бакмассой шуттелируют в течение трёх часов, затем из них берут пробы для проверки культур на чистоту и типичность.
Для изготовления ассоциированной эмульсионной вакцины производят
концентрирование споровой бакмассы методом спонтанного осаждения спор или при помощи флокулянта - 1 %-ного раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.
Бутыли с концентрированной споровой бакмассой хранят при температуре от 2 °С до 10 °С в течение десяти дней. За это время её проверяют на чистоту, типичность роста, подвижность бацилл и на концентрацию жизнеспособных спор в 1 см3.
Сконцентрированная бакмасса до смешивания с некробактериозным
экзоанатоксином должна иметь концентрацию от 4,5 до 12 млрд спор в 1 см3.
Получение производственной суспензии спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 в мясной кислотно-гидролизатной жидкой среде (МКГЖС) реакторным методом. В биореактор, в котором производят культивирование, из подготовительного цеха по стерильной трубе из нержавеющей стали перекачивают расчётное количество кислотного гидролизата мяса. Соли в необходимой массе растворяют в дистиллированной воде и смешивают с кислотным гидролизатом мяса.
Одним из условия роста культуры является её достаточная оксигенация. При этом количество растворённого кислорода должно быть на уровне (3,5 ± 0,2) миллимолей в 1 дм среды за 1 час. Снижение или наоборот повышение концентрации кислорода в среде приводит к ослаблению роста, уменьшению или прекращению
спорообразования. Поэтому для достижения необходимого уровня оксигенации среды, перед культивированием вакцинного штамма, определяют массообмен кислорода в используемом реакторе. Массообмен кислорода в реакторе определяют по сульфитному методу.
Засев МКГЖС в реакторе при суспензионном культивировании штамма 55
проводят споровой бакмассой, проверенной на чистоту, типичность, подвижность бацилл и на содержание жизнеспособных спор в 1 см3. Устанавливают температуру (37 ± 1)°С. В течение (28 ± 1) часов культивирования через барботёр в реактор подают определённое по калибровочной прямой количество стерильного воздуха.
После указанного срока из реактора берут пробу культуры, из которой готовят препарат «раздавленная капля» для предварительного определения чистоты и степени
спорообразования.
Для дальнейшей работы культура должна быть без посторонней микрофлоры и иметь не менее 80 % спор на разных стадиях формирования.
Затем культуру в реакторе выдерживают без аэрации в течение 20 часов при температуре (37 ± 1) °С. После чего культуру перемешивают мешалкой при 85 об./мин в течение 20 - 30 минут и берут пробу для контроля на чистоту, типичность, морфологию, подвижность, однородность, степень спорообразования. Кроме того, если в культуральной суспензии содержится не менее 90 %) спор, производят определение концентрации жизнеспособных спор.
Для изготовления ассоциированной эмульсионной вакцины производят
концентрирование спор в культуральной суспензии, изготовленной в реакторе, при помощи флокулянта - 1 %-ного раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.
Концентрат спор из бутыли проверяют на чистоту, типичность, морфологию, однородность и концентрацию спор. Количество жизнеспособных спор в 1 см должно быть в пределах от 4,5 до 12 млрд.
При положительных результатах бактериологической проверки и после определения количества живых спор сконцентрированную споровую бакмассу, полученную в реакторе, считают пригодной для производства ассоциированной эмульсионной вакцины.
Технология противонекробактериозного компонента вакцины
Приготовление рабочей расплодки (Production seed) штамма «0-1» F.necrophorum для глубинного культивирования в реакторах. При изготовлении рабочей расплодки (Production seed) из штамма «0-1» используют рабочий посевной материал в ампуле (Working seed), изготовленный из главного посевного материала (Master seed). Для этого в ампулу с сухой культурой штамма «0-1» вносят стерильный 0,9 %-ный раствор натрия хлорида в объёме 2 - 3 см , после полного разведения сухой микробной массы засевают 5-10 пробирок с МППБ, параллельно делают посев на/в МПА и МПБ. Посевы культивируют в течение 2-3 суток при температуре (37,0 ± 0,5) °С. В посевах в/на МПБ и МПА не должно быть роста. Рост в МППБ
проверяют световой микроскопией и делают пересевы пастеровской пипеткой на ту же среду во флаконы объёмом 0,5 л, содержащие от 300 до 350 см3 среды, из расчёта одна пробирка на флакон, дополнительно засевают 1 - 2 пробирки с МПБ и МПА для контроля микробиологической чистоты. Посевы культивируют в течение 2 - 3 суток при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Рост во флаконах проверяют микроскопией. Затем делают пересевы в бутыли вместимостью от 16 до 20 дм с МППБ из расчета один флакон на бутыль. Бутыли помещают в термостат на срок от 36 до 72 часов и культивируют при температуре (37 ± 0,5) °С.
Параллельно с посевом в бутыли из флаконов делают контрольные посевы в пробирки с МПБ и МПА и флаконы с МПБ, которые культивируют при (37,0 ± 0,5) °С в течение трёх суток. Посевы в эти среды не должны давать роста культур штамма «0-1».
При изготовлении рабочей расплодки допускается из одной ампулы с рабочим посевным материалом (Working seed) засевать 5-10 пробирок с МППБ, из которых затем производят пересевы во флаконы с той же средой из расчёта -одна пробирка на один флакон.
Через 2 - 3 суток выросшие культуры F. necrophorum из флаконов пересевают в бутыли из расчета - один флакон на бутыль.
В последующем, каждую бутыль с выросшей некробактериозной культурой штамма «0-1» используют для засева одного реактора с питательной средой ХППБ.
Суспензионное культивирование
F.necrophorum в реакторе. Технология суспензионного культивирования состоит из следующих операций: из подготовки к работе и стерилизации реактора; приёма питательной среды ХППБ, её стерилизации и засева в реакторе; культивирования.
Питательную среду ХППБ загружают в реактор и стерилизуют при давлении 0,1 МПа (1 кгс/см2) в течение 45 минут, охлаждают до 37 °С, pH среды после стерилизации доводят до (7,4 ± 1). В среду вносят стерильный 40 %-ный раствор глюкозы из расчёта 0,5 % по сухому веществу.
Из реактора отбирают пробу питательной среды для оценки стерильности и биохимических показателей. Через стерильную питательную среду в реакторе перед засевом рабочей расплодки пропускают чистый азот, который подают через стерилизующий фильтр в течение (12 ± 1) мин из расчета (35 ± 5) л/мин при работающей мешалке.
Засев питательной среды в реакторе культурой F. necrophorum производят с помощью перистальтического насоса из расчета от 3 до 5 % к её объёму при избыточном давлении азота около 0,05 МПа (0,5 кгс/см ).
Выращивание культуры штамма «0-1» в реакторе проводят при температуре (37,0±0,5)°С в течение (36±1) часов, через каждые пять часов через культуру в реакторе пропускают чистый
азот в течение 10-15 минут в количестве от 30 до 40 дм /мин по ротаметру без выключения мешалки.
Рост культуры контролируют через одни сутки от начала инкубирования, затем проводят отбор проб через каждые 6 часов, выращивание прекращают в стационарной фазе роста культуры при достижении показателей (5,5 ± 1) млрд микробных кл./см и рН (6,6 ± 0,3).
Изготовленную культуру Б. песгорИогиш высевают в МППБ, в котором должен быть характерный рост, а также проверяют на чистоту путём микроскопирования и высевов на МПА и в МПБ, на/в которых в течение трёх суток при температуре (37,0 ± 5) °С не должно быть роста микрофлоры. В мазках культуры из МППБ должны быть видны грамотрицательные палочки и нити с характерной для F. necrophorum морфологией.
Для исключения длительной и затратной процедуры изготовления рабочей расплодки штамма «0-1» допускается использовать в качестве рабочей расплодки для засева питательной среды ХППБ в реакторе производственную микробиологически чистую культуру из реактора.
Для этого в бутыли вместимостью 16 - 20 дм3 предварительно наливают от 300 до 500 см вазелинового масла, монтируют сифонами и стерилизуют при 0,1 МПа (1 кгс/см) в течение одного часа.
После окончания культивирования в реакторе бутыли стерильно подсоединяют к реактору и наполняют их бактериальной суспензией, которая оказывается под вазелиновым маслом. Такие бутыли с готовым посевным материалом хранят в холодильной камере при температуре (6 ± 2)° С в течение 6 суток, по мере необходимости используя для засева реакторов, предварительно проверив посевной материал на чистоту микроскопией и высевами на МПА и в МПБ, на которых не должно быть роста.
Для изготовления некробактериозного компонента вакцины культуру F. necrophorum после окончания выращивания в реакторе проверяют на контаминацию посторонней микрофлорой и концентрацию микробных клеток с использованием стандартов мутности ГИСК им. Тарасевича. Затем культуру подвергают центрифугированию с целью получения супернатанта.
Супернатант (экзотоксин), полученный от первоначального фракционирования
культуральной жидкости на центрифуге, подвергают стерилизующей фильтрации через картриджи с величиной пор 0,22 мкм. В собранный стерильный фильтрат экзотоксина в реакторе вносят 0,4 % формалина для его детоксикации. Инактивацию экзотоксина формалином проводят в течение 15 суток при температуре (42 ± 1) °С. После её завершения в экзоанатоксин вносят 3 % - ный гель гидрата
окиси алюминия в количестве 25 % к его объёму и таким образом производят его концентрирование в 10 раз путём удаления расчётного количества надосадочной жидкости.
Адсорбированный на ГОА
инактивированный экзотоксин на центрифуге отмывают от остаточного формальдегида трижды 0,9 %-нам раствором натрия хлорида. К отмытому экзоанатоксину добавляют споры вакцинного сибиреязвенного штамма 55. Первоначальная концентрация спор штамма 55 до смешивания с экзоанатоксином должна быть пределах от 7 до 10 млрд спор в 1 см3. К смеси экзоанатоксина и спор добавляют масляный адъювант с эмульгатором в соотношении: 65 % масла + 35 % смеси из анатоксина и спор штамма 55. Смесь экзоанатоксина со спорами штамма 55 с эмульгированным маслом подвергают
гомогенизации на коллоидной
мельнице.
Изготовление масляного адъюванта: масляную основу соединяют с экологически безвредным эмульгатором, эмульгатор-139 или оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол, в соотношении: 8 % эмульгатора №139 или оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол и 92 % минерального масла «Маркол». Полученную смесь тщательно перемешивают, затем стерилизуют при 0,1 МПа (1 кгс/см) в течение одного часа. После охлаждения масляный адъювант проверяют на стерильность высевами на МПА и в МПБ и МППБ. Адъювант должен быть стерильным. Безвредность масляного адъюванта определяют путём его подкожного введения в дозе 1 см3 двум кроликам массой 1,5-2 кг и внутримышечного введения пяти морским свинкам массой 400 - 450 г и подкожного введения по 0,2 см пяти белым мышам массой 20 -25 г. Наблюдение за подопытными животными ведут 10 суток, в течение которых все лабораторные животные должны оставаться клинически здоровыми.
Для определения реактогенности масляный адъювант в дозе 1 см вводят внутримышечно шести морским свинкам массой 400 - 450 г. В течение срока наблюдения масса тела животных не должна снижаться и температура тела должна быть в пределах нормы. На месте введения масляного адъюванта не должны образовываться абсцессы и свищи, допускаются небольшие асептические отеки. Масляный адъювант должен быть умеренно реактогенным.
Ассоциированную эмульсионную вакцину проверяют на стабильность эмульсии путем центрифугирования в пробирках в течение 30 мин при 3000 об./мин. Отсутствие расслоения должно свидетельствовать об её стабильности.
Антиген из смеси адсорбированного на ГОА инактивированного экзотоксина штамма «01» и спор штамма 55 соединяют со стерильным масляным адъювантом из расчёта: в 0,2 см3 вакцины должно содержаться количество
экзоанатоксина, полученного из 4 млрд микробных клеток возбудителя
некробактериоза.
Готовая ассоциированная эмульсионная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза животных должна содержать в 1 см3 (225 ± 25) млн живых сибиреязвенных спор штамма 55 и белка экзоанатоксина возбудителя некробактериоза штамма «0-1» должно быть (6 ± 1) мг/см .
Готовую ассоциированную эмульсионную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза животных расфасовывают в стерильные флаконы вместимостью 10, 20 или 50 см3, закрывают стерильными пробками, которые укрепляют алюминиевыми колпачками.
Расфасованную вакцину проверяют на микробиологическую чистоту и при положительных результатах сдают на контроль в ОБТК.
Проверку иммуногенности
противосибиреязвенного компонента проводят на 10 морских свинках массой (375 ± 25) г, которым подкожно вводят 0,2 см вакцины, а через 10 - 12 суток заражают стандартной сибиреязвенной споровой культурой штамма М-71 в дозе 1 млн спор. Вакцина должна предохранять от гибели не менее восьми животных из 10 вакцинированных морских свинок. При этом из 10 заражённых невакцинированных (контрольных) животных должны погибнуть не менее восьми.
Иммуногенную активность
противонекробактериозного компонента вакцины определяют in vitro в РА некробактериозного антигена с сыворотками от трёх кроликов, иммунизированных двукратно подкожно в дозе 1 см3 с интервалом 14 суток. Титр агглютининов в сыворотках должен быть не ниже 1 - 128.
Исследования in vivo показали, что разработанная ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза создает длительный иммунитет у привитых животных, при этом по иммуногенности вакцина превосходит известную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза [9, 11, 12]. Вакцина безвредна и авирулентна для лабораторных и сельскохозяйственных животных. Ассоциированная вакцина применяется однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2 - 0,4 см3.
В таблице 1 представлена сравнительная характеристика показателей иммуногенности известной и разработанной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза через 1.5 года после вакцинации оленей в республике Саха (Якутия).
Устойчивость к заражению сибирской язвой и некробактериозом у животных сохраняется до 1,5 лет, что в 1,5 раза продолжительней при вакцинации известным препаратом. Новизна разработанной технологии ассоциированной вакцины для
профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных подтверждена патентом [13].
Таблица 1 - Сравнительная характеристика показателей иммуногенности вакцины против сибирской язвы и некробактериоза через 1.5 года после вакцинации оленей в республике Саха (Якутия)
Заключение
Разработана экологически безопасная технология получения ассоциированной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза животных, в качестве экологически безвредного эмульгатора содержит эмульгатор-139 или оксиэтилированный С7-С10 алкилфенол и показаны сравнительная характеристика показателей иммуногенности вакцины против сибирской язвы и некробактериоза через 1.5 года после вакцинации оленей в республике Саха (Якутия).
Литература
1. Самуйленко А.Я., Раевский А.А., Павленко И.В., Еремец Н.К., Бобровская И.В., Канарская З.А., Канарский А.В. Вест. Казан. технол. унив. Т16. № 9. С. 162 -165. (2013).
2. Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Нежута А.А., Неминущая Л.А., Павленко И.В., Раевский А.А., Фролов Ю.Д., Бобровская И.В. Вест. Рос. академии сельскохозяйственных наук. № 4. С. 37- 39. (2014).
3. Школьников Е.Э., Еремец Н.К., Павленко И.В., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Бобровская И.В., Филимонов Д.Н., Гаврилов В.А., Ковальский И.В., Канарская З.А., Хусаинов И.А. Вест. Казан. технол. унив. Т. 17. № 13. С. 255 - 263. (2014).
4. Винокуров И.Е., Мельник Р.Н., Самуйленко А.Я., Мельник Н.В., Трифан В.Н. Ветеринария и кормление. М. № 6. С. 28 - 29. (2014).
5. Винокуров И.Е., Мельник Р.Н., Самуйленко А.Я., Мельник Н.В., Трифан В.Н. Ветеринария и кормление. М. № 6. С. 28 - 29. (2014).
6. Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Дресвянникова С.Г., Гринь С.А., Киш Л.К., Крюкова Е.Н., Стрельникова А. В., Еремец Н. К., Трифан В. Н. Ветеринария и кормление. М. № 6. С. 10 - 11. (2014).
7. Пат. Ш 1816348, А61К 39/00. (1995).
8. Пат. Ш 2109519, А61К 39/02. (1998).
9. Пат. Ш № 2191599, МПК7 А61К 39/116. (2002).
10. Пат. РФ № 2480237, МПК А61К 39/116. (2013).
Проявление
о г симптомов
о н Кол- во голов заболевания ы н
Вакцины о жив а В некробак-териоза сибирской язвы s щ а з ^ 0х
Разработанная олени 900 0 0 100
Прототип олени 900 60 30 90
11. Пат. RU № 2337706, МПК А61К 39/00. (2008). 13. Пат. РФ № 2524430. (2014).
12. Пат. RU № 2134964, МПК А0Ш 25/00. (1999)
© В. Н. Трифан - асп. ГНУ ВНИТИБП , vnitibp@mail.ru; А. Я. Самуйленко - академик РАСХН, д. веет. н., профессор, директор ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; Р. Н. Мельник - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; Н. К. Еремец - канд. биол. наук, зав. отделом обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии и животноводства, vnitibp@mail.ru; И. В. Павленко - канд. биол. наук, доктор техн. наук, зав. лаб. отдела противобактерийных препаратов ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, polt65@yandex.ru; Т. А. Скотникова - д-р биол. наук, зав. лаб. отдела обеспечения качества ГНУ ВНИТИБП, ook_vnitibp@mail.ru; Л. А. Неминущая - д-р биол. наук, зав. лаб. отдела обеспечения качества ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; Л. Б. Соловьев - к. б. н., зав. лаб. отдела противобактерийных препаратов, ФГБНУ ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; А. В. Канарский - -д.т.н., проф., каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, alb46@mail.ru.
© V. N. Trifan - PhD student, VNITIBP, vnitibp@mail.ru; A. Y. Samujlenko - academician of RAN, direktor VNITIBP, vnitibp@mail.ru; R. N. Melnyk — candidate of biological sciences, head of laboratory of VNITIBP, vnitibp@mail.ru; N. K. Eremec - Candidate of Biology, Docent, head of Department of quality assurance of medicines for veterinary use VNITIBP, vnitibp@mail.ru; 1 V. Pavlenko - doctor of technical sciences, head laboratory of bacterial preparations VNITIBP, vnitibp@mail.ru; T. A. Skotnikov -Doctor of Biology, Docent, head laboratory of Department of quality assurance of medicines for veterinary use VNITIBP, vnitibp@mail.ru; L. A. Neminushshaja - Doctor of Biology, Docent, head laboratory of Department of quality assurance of medicines for veterinary use VNITIBP, vnitibp@mail.ru; L. B. Solovyov — candidate of biological sciences, head of the laboratory of protivobakterijnyh drugs, vnitibp@mail.ru; A. V. Kanarskiy - Dr. Tech. Sci., professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, alb46@mail.ru.
