CC BY
14
УДК 576.851.214.093.3
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ЭНТЕРОКОККОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Н. Н. Седова
Институт питания АМН СССР, Москва
%
Для обнаружения и количественного учета энтерококков в объектах внешней среды, в том числе и в пищевых продуктах, предложено свыше 30 элективных сред. Элективность их обеспечивалась либо добавлением ингибиторных для посторонней микрофлоры химических веществ типа азида натрия, ацетата талия, 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (2,3,5-ТТХ), бактериальных красителей и т.д., либо создавался высокощелочной pH (9,6— 10,2) среды. Одни авторы для выделения энтерококков из пищевых продуктов использовали среду, содержащую ацетат талия и 2,3,5-ТТХ (Barnes; Н. К. Захарова; Э. С. Дербинова1, и др.), другие использовали среды, содержащие азид натрия в сочетании либо с 2,3,5-ТТХ и твином-80, либо с цитратом натрия (Burkwall и Hartman; Saraswat и соавт., и др.).
Д. Э. Беленький и Н. Н. Попова предложили плотную среду, содержащую 40% желчи, для обнаружения стрептококков в пищевых продуктах. Эта среда до настоящего времени используется в ряде лабораторий страны для выявления стрептококков, в том числе и энтерококков, в пищевых продуктах. В. В. Ильин и В. С. Касторский для определения титра энтерококков в пищевых продуктах брали жидкую среду КФ, предложенную Кен-нером и др. (1960) и содержащую азид натрия, А. Н. Крупина — солевой питательный бульон, а А. П. и Г. П. Калина — жидкую щелочную среду накопления, содержащую антибиотик полимиксин М и имеющую pH 10,2, с последующим пересевом из нее на плотную среду, содержащую кристал-виолет и 2,3,5-ТТХ. В «Инструкции о порядке расследования и учета пищевых отравлений с методикой бактериальных исследований» (М., 1962) при исследовании пищевых продуктов на стрептококки рекомендуется производить глубинный посев в кровяной агар и сахарный бульон.
Как видно из краткого обзора литературных данных, сейчас еще нет единой среды и единого подхода к выделению и количественному учету энтерококков в пищевых продуктах.
Комитет по микробиологическим рекомендациям и методам исследования пищевых продуктов при Международном обществе микробиологов (That-пег и Clark) рекомендует среду Пейкера (Packer), содержащую азид натрия, кристалвиолет и кровь, для выделения и количественного учета энтерококков в пищевых продуктах, содержащих более 10 клеток в 1 г.
Учитывая изложенное выше, мы ставили своей целью подобрать такую среду из ряда наиболее часто используемых, на которой можно было бы получить данные о количественной обсемененности и видовом пейзаже энтерококков в различных пищевых продуктах, с тем чтобы использовать эту среду в дальнейшей работе.
Исследуемым материалом являлись различные пищевые продукты, главным образом молочные. Навеску в количестве 1 г растирали в ступке с 9 мл 0,1% стерильной пептонной воды и, если было необходимо, со стерильным песком. Молоко засевали без дополнительной обработки. Из продуктов
готовили разведения до 1:1000 с использованием 0,1 % стерильной пептонной
воды. Для излучения были отобраны 4 среды отечественных и зарубежных авторов: желчно-кровяной агар Д. Э. Беленького и Н. Н. Поповой (1929), агар, содержащий антибиотик полимиксин М и имеющий pH 10,2, среда
1 Кандидатская диссертация. М., 1967.
№ 22 Бурквалл и Хартмана (1964), плотная среда КФ в модификации отечественных авторов (1966) и среда Пейкера (1943), в пропись которой были внесены некоторые изменения: вместо триптозы и мясного экстракта использовали мясо-пептонный бульон или бульон Хоттингера и снизили концентрацию агара «Дифко» до 1,5% вместо 3%, рекомендованных автором. Среды, рекомендованные «Инструкцией по расследованию пищевых отравлений» (М., 1962), не были включены для сравнительного изучения, так как они не являются элективными для энтерококков.
Была принята следующая методика испытания сред. На поверхность каждой чашки с испытуемой средой высевали по 0,1 мл из разведения 10"1 мясных и 10"3 молочных продуктов и хорошо растирали стерильным шпателем. Посевы выдерживали в термостате при 37° в течение 48 часов. Элек-тивность сред оценивали на основании учета общего количества выросших колоний энтерококков и посторонней микрофлоры и идентификации 10 изолированных колоний, снятых с поверхности каждой среды для определения видов и разновидностей энтерококков. Идентификацию штаммов проводили путем определения их каталазной активности, отношения к тестам Шермена, путем установления характера роста на средах, содержащих кровь, молоко, 2,3,5-ТТХ, теллурит калия, сорбит, маннит, арабинозу и рафинозу.
Исследовано по 5 образцов молока фляжного пастеризованного, творога, приготовленного из пастеризованного молока, творожных сырков с изюмом и по 5 образцов мясных продуктов (свиные сардельки, сырой говяжий фарш, ветчина, колбаса «любительская»). Следует отметить, что результаты оценки элективности каждой среды при посеве на нее одного и того же продукта, разных образцов существенно не отличались друг от друга, поэтому изучение было ограничено исследованием 20 проб различных продуктов.
Данные об общем количестве выросших колоний энтерококков и посторонней флоры и результатах идентификации колоний, снятых с поверхности 4 сред, при посеве на них 20 проб различных пищевых продуктов представлены в табл. 1 и 2.
Таблица I
Общее количество бактерий, выросших на элехтивных питательных средах для энтерококков при посеве на них различных пищевых продуктов
9 Среда Ингибитор Молоко Творог Сырки Мясные продукты
всего бактерий посторонняя микрофлора всего бактерий посторонняя микрофлора всего бактерий посторонняя микрофлора всего бактерий посторонняя микрофлора
Желчно-кровяной 40% желчи 31 х 19х 128 X 103 X 168 X 135 х 44 X 39 X
агар х Ю4 х 104 ХЮ4 X Ю4 X 104 х Ю4 ХЮ2 х 10а
Среда № 22 Азид натрия, 14 X О1 21 х Зх 32 х 6 X 0 0
2,3,5-ТТХ хЮ4 х 104 х 104 х 104 хЮ4
Среда КФ в моди- Азид натрия, 18 х 01 20 х 0 26 х 8 х 0 0
фикации отечест- 2,3,5-ТТХ Х104 х 104 хЮ4 х 104
венных авторов 23 х О1 51 х
Среда Пейкера Азид натрия 9х 61 X 4 х 14 х 0
кристал — хЮ4 хЮ4 х 104 х 104 ХЮ4 х 102
виолет
1 Роста нет.
Из табл. 1 и 2 видно, что наиболее удовлетворительные результаты оценки элективности получены при посеве пищевых продуктов на среду Пейкера. На ней отмечался максимальный рост энтерококков всех видов и разновидностей. Типичные колонии энтерококков имели округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5—2 мм и фиолетовую окраску, четко отличавшуюся от коричнево-красного фона среды. Рост посторонней
флоры при посеве многих образцов пищевых продуктов отсутствовал, но иногда отмечался рост посторонних каталазоотрицательных колоний, которые по культуральным признакам легко отличались от типичных колоний энтерококков.
Таблица 2
Результаты идентификации 772 колоний, снятых с поверхности элективных сред
при посеве на них 20 проб различных пищевых продуктов (в %)
Среда Молоко Творог • Сырки Мясные продукты
неэнтерококки энтерококки неэнтерококки энтерококки неэнтерококки энтерококки неэнтерококки энтерококки •
Желчно-кровяной агар .... 54 46 64 36 71 29 87 13
Среда № 22......... 20 80 16 84 15 85 0 0
Среда КФ в модификации оте-
чественных авторов ..... 16 84 19 81 16 84 0 0
Среда Пейкера........ 3 97 9 91 16 84 0 100
Менее удовлетворительные результаты получены на средах № 22 и КФ. Общее количество энтерококков на этих средах было меньше, чем на среде Пейкера, по-видимому, за счет угнетения роста штаммов Str. faecalis и его вариантов Str. liquefaciens и Str. xymogenes. Типичные колонии энтерококков на этих средах имели округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1—1,5—2 мм. Окраска колоний на средах №22 и КФ темно-вишневая. На этих средах довольно часто отмечался рост посторонних каталазоотрицательных и каталазоположительных колоний, которые по культуральным признакам трудно отличались от типичных колоний энтерококков. Неудовлетворительные результаты оценки электив-ности были получены при посеве пищевых продуктов на среду Д. Э. Беленького и Н. Н. Поповой. На ней отмечался обильный рост каталазоположительных и каталазоотрицательных колоний, которые по культуральным признакам не отличались от типичных колоний энтерококков.
Таким образом, для выделения и количественного учета энтерококков в различных пищевых продуктах в дальнейшей работе нами была использована среда Пейкера: кристалвиолет — азид — кровяной агар.
Рецепт среды Пейкера: а) основной агар: 100 мл мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера; 0,5 г поваренной соли (NaCl); 1,5 г агара «Дифко» или 2 г агар-агара.
На 100 мл основного агара требуется : б) 0,4 мл 0,05% водного раствора кристалвиолета, в) I мл 5% водного раствора азида натрия, г) 5 мл животной или человеческой цитратной крови.
Части а и б стерилизуют при 121° в течение 20 мин., часть в — текучим паром в течение 30 мин. или через бактериальный фильтр. Части б, в у г добавляют к основному агару перед разливкой среды в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 7—10 дней.
Вывод
Для выделения и количественного учета всех видов энтерококков в пищевых продуктах подобрана элективная среда Пейкера (кристалвиолет — азид — кровяной агар) путем сравнительного изучения 4 плотных сред отечественных и зарубежных авторов.
ЛИТЕРАТУРА
Ильин В. В., Касторский B.C. Гиг. и сан., 1966, № 5, с. 59. — Кали-н а А. П., Калина Г. П. В кн.: Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М., 1964, с. 360. — КрупинаА. Н. В кн.: Вопросы этиологии и диагностики пищевых токсикоинфекций. Л., 1967, с. 67. — Barnes Е. М., J. Appl. Bact., 1956, v. 19, p. 193. — Р а с k е г R. A., J. Bact. 1943, v. 46, p. 343.
Поступила 21/V 1969 г»
