CC BY
80
УДК 579.6
DOI 10.18286/1816-4501-2019-4-144-152
РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ BACILLUS CEREUS
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47
e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: Bacillus cereus, бактериологическая схема, признак, тест, идентификация, бактерии, проба
В статье представлены результаты разработки бактериологической схемы выделения из объектов ветеринарно-санитарного надзора и идентификации бактерий Bacillus cereus как части комплексной тест-системы по индикации и идентификации зооантропозначимых бактерий группы «Bacillus cereus». Модельными микроорганизмами для подбора параметров исследований и бактериологических тестов были референс-штаммы Bacillus cereus 8035, Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus АТСС14579. На основании анализа следующих признаков: форма эндоспоры, растяжение вегетативной клетки спорой, способности к движению и образованию пигмента, роста в аэробных и анаэробных условиях, наличию фермента каталазы, биохимической активности и наличию факторов патогенности, выделенные нами 102 штамма бактерии были отнесены к первой морфологической группе по Gordon (1973), к группе «Bacillus cereus» по «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacter'rn» (2015) и типированы как представители вида Bacillus cereus. В течение 216 часов (9 дней), применяя разработанную нами схему выделения и бактериологической идентификации бактерий Bacillus cereus, можно на основании 44 тестов типировать вышеназванные бактерии. Из 536 проб объектов ветеринарно-санитарного надзора и окружающей среды (210 проб почвы, 67 - вода открытых водоемов, сточные воды, 46 - корма растительного происхождения для с/х животных, 90 - пряности и приправы, 67 - молоко и молочная продукция, 56 - мясо и мясная продукция) было выделено 398 штаммов, которые были отнесены к роду Bacillus и 102 - к виду Bacillus cereus.
Введение
По литературным данным, разграничение видов внутри рода Bacillus иногда представляется достаточно сложным. В частности трудно дифференцировать представителей группы «Bacillus cereus», среди которых наиболее часто встречаются возбудители заболеваний человека и животных. Морфологические свойства этих микроорганизмов не являются критерием для их разграничения, а, наоборот, позволяют объединить их в одну группу [1-2]. Физиолого-биохимические признаки, по которым принято дифференцировать виды этой группы часто изменчивы и ненадежны. Поэтому, пользуясь традиционными методами идентификации, исследователи далеко не всегда могут точно определить видовую принадлежность изолируемых бактерий рода Bacillus [3-4]. Современные методы молекулярно-генетических исследований получили широкое распространение при идентификации бацилл, однако они требуют значительных материальных и временных затрат и неприемлемы для быстрой идентификации бактерий [5-7].
По мнению некоторых исследователей, представители группы Bacillus cereus, Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus thuringiensis в действительности являются патоварами (патогенны-
ми вариантами) единственного вида, и все же филогенетическое и фенетическое разграничение этой группы, вероятно, поддерживает генетический статус [8-9]. Внутреннее разграничение различных 16S рРНК групп внутри рода Bacillus в настоящее время далеко не ясно. Многие из его вида распадаются на несколько очевидно четких групп рРНК последовательности, таких как «Bacillus subtilis группа», «Bacillus cereus группа» и «Bacillus sphaericus группа», но хотя такие разделения могут также быть фенотипически отличимыми, промежуточные организмы могут сделать удовлетворительное подразделение сложным [10-12].
Цель работы - разработать бактериологическую схему выделения из объектов ветеринарно-санитарного надзора и идентификации бактерий Bacillus cereus как части комплексной тест-системы по индикации и идентификации зооантропозначимых бактерий группы «Bacillus cereus».
Объекты и методы исследований
Для разработки бактериологической схемы как части комплексной тест-системы по индикации и идентификации зооантропозначимых бактерий группы «Bacillus cereus» нами был использован ГОСТ 10444.8-2013 (ISO 7932:2004) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных Горизонтальный метод подсчета презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод подсчета колоний
при температуре 36±1 °C [13]. Термин «презум-птивный» в данном НТД определяет рекомендуемую методику как метод, не предусматривающий дифференциацию В. cereus от других представителей группы «Bacillus cereus». В качестве дополнительных тестовых компонентов разрабатываемого алгоритма идентификации нами были использованы данные, представленные в справочнике «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria» (2015) [14].
Модельными микроорганизмами для подбора параметров исследований и бактериологических тестов были референс-штаммы Bacillus cereus 8035, Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus АТСС 14579.
В исследованиях было использовано 536 проб объектов ветеринарно-санитарного надзора и окружающей среды, из которых 210 проб почвы, 67 - вода открытых водоемов, сточные воды, 46 - корма растительного происхождения для с/х животных, 90 - пряности и приправы, 67 - молоко и молочная продукция, 56 - мясо и мясная продукция.
Питательные среды: питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94 (ООО «БиоКомпас-С», РФ), эмульсия яичного желтка («HiMedia», Индия), среда Мосселя (MYP-агар) (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ); среда РЕМВА (ООО «Ростехнохим», РФ), среда Донована (НПЦ «Биокомпас-С», РФ), желточный агар с хлористым натрием, полимиксином В и 2,3,5-трифенилте-тразолиум хлоридом («HiMedia», Индия); питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) ТУ 9398-020-78095326-2006 (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ); Микро-ГРАМ-НИЦФ набор реагентов для окраски микроорганизмов по методу Грама ТУ 9398-002-39484474-2002 (ЗАО НИЦФ, РФ); дифференциально-диагностическая среда для выявления и культивирования сибиреязвенного микроба с фе-нолфталеинфосфатом натрия (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ); среда Гисса с бромкрезоловым пурпурным, с араби-нозой (ООО «Биотехновация», РФ); среда Гисса с индикатором ВР , с глюкозой (ООО «Биотехновация», РФ); агар маннито-солевой (среда № 10) (^nda, Испания), среда Гисса с маннозой БТН (ООО «Биотехновация», РФ), среда Гисса с салицином («HiMedia», Индия), среда Гисса с ксилозой («HiMedia», Индия), среда Гисса с лактозой («HiMedia», Индия), среда Гисса с мальтозой («HiMedia», Индия), среда Гисса с рамнозой («HiMedia», Индия), среда Гисса с сорбитом («HiMedia», Индия), среда Гисса с галактозой БНТ (ООО «Биотехновация», РФ), среда Гисса с раффинозой БНТ (ООО «Биотехновация», РФ), среда Кларка (ООО «БиоКомпас-С», РФ), Urea Agar Base (Christensen) Основа уреазного агара (по
Кристенсену) («HiMedia», Индия), Urea 40% Мочевина 40 % раствор («HiMedia», Индия); нитратный агар («HiMedia», Индия); среда № 7 ISP тирозино-вый агар («HiMedia», Индия); Corn Meal Peptone Yeast Agar Пептонно-дрожжевой агар («HiMedia», Индия); цитратный агар Симмонса (ФГУП «НПО Микроген», РФ); Arginine Dihydrolase Broth Арги-ниновый бульон («HiMedia», Индия); Blood Agar Base Основа кровяного агара («HiMedia», Индия); Nutrient Gelatin Питательный желатин («HiMedia», Индия).
Реактивы: сульфаниловая кислота, альфа-нафтиламиновый реактив, уксусная кислота, молоко цельное; 0,6 % спиртовой раствор а-нафтола, йод кристаллический CAS 7553-56-2 (Производство Чили), перекись водорода 3 % (ООО Росбио), водный раствор малахитовой зелени, 0,25%-ный водный раствор основного фуксина; Натрий хлористый (хч) (АО ЛенРеактив, РФ). Картофель; стерильная дефибринированная кровь барана, яйцо куриное диетическое.
Результаты исследований
При разработке схемы выделения и бактериологической идентификации микроорганизмов чрезвычайно важно подобрать селективную среду, характерный рост на которой мог бы стать первичным дифференциальным показателем. С этой целью нами был проанализирован рост бактерий Bacillus cereus на следующих средах: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, дифференциально-диагностическая среда для выявления и культивирования сибиреязвенного микроба с фенолфталеинфосфатом натрия; желточный агар с хлористым натрием, полимиксином В и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлоридом; агар с яичным желтком; модифицированная среда Донована; среде Мосселя (MYP-агар); среде РЕМВА.
На МПА Bacillus cereus образовывали «вос-ковидные» серо-белые распластанные колонии с неровными краями, имеющими зернистую структуру размером примерно 5-10 мм, через 48 часов культивирования колонии увеличивались в диаметре до 15-20 мм.
При росте Bacillus cereus в МПБ в течение 1824 часов проходят несколько стадий развития, которые визуально можно дифференцировать следующим образом: активное помутнение среды, последующее просветление и образование пленки, которая легко разбивается при встряхивании пробирки, оставляя на стенках пристеночное кольцо и ложась на дно, образует тем самым осадок. После чего в течение 7±1 часов при температуре 36±1 0С пленка образуется вторично. На селективных и дифференциально-диагностических средах
Рис. 1 - Бактерии Bacillus cereus 8035 на среде Мосселя (MYP-агар) (18 часов культивирования в термостате при температуре 36±1 0С)
для Bacillus cereus, содержащих ингибирующие рост неспецифичной микрофлоры, компонентов: натрия хлорида, лития хлорида, 2,3,5-трифенил-тетразолиум хлорида (ТТХ), этанола, полимиксина В, референс-штаммы Bacillus cereus 8035, Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus АТСС 14579 показали активный рост колоний.
На дифференциально-диагностической среде для выявления и культивирования сибиреязвенного микроба с фенолфталеинфосфатом натрия, бактерии Bacillus cereus растут в виде распластанных матовых колоний диаметром 1-1,5 см. При взаимодействии с парами аммиака Bacillus cereus и другие спорообразующие сапрофиты приобретают розовый или красный цвет, колонии же Bacillus anthracis не изменяют своего цвета, либо слабо розовеют. На желточном агаре с хлористым натрием, полимиксином В и 2,3,5-трифенилте-тразолиум хлоридом (ГОСТ 10444.8-88) колонии круглые, блестящие, красные, диаметром около 5,0-15,0 мм с зоной белого преципитата диаметром около 10-30,0 мм. Рост на агаре с яичным желтком рост колоний Bacillus cereus характеризовался крупными белыми колониями со слегка изрезанными краями, окруженными зоной матового коагулята. На модифицированной среде До-нована (селективный агент хлорид лития) бактерии Bacillus cereus формировали белые округлые колонии со слегка изрезанными краями, окруженные зоной белого матового коагулята. Рост Bacillus cereus на среде Мосселя (MYP-агар) проявляется в образовании распластанных зернистых колоний розового цвета (вследствие отсутствия способности ферментировать маннит), окруженных зоной коагулята розового цвета; среда бесцветная или со слабо-розовой окраской (рис.1).
В качестве селективной среды использовали Cereus Selective Agar (MYP-agar), которая, на
наш вгляд, адаптирована к особенностям бактерий В. cereus:
1) бактерии Bacillus cereus - маннит-отрица-тельный. Присутствие маннита в среде позволяет выявлять маннит-положительные микроорганизмы. Цвет среды при этом становится желтым (индикатор феноловый красный).
2) бактерии Bacillus cereus устойчивы к поли-миксину, который способствует подавлению роста сопутствующей микрофлоры.
Бактерии Bacillus cereus образуют на MYP-agar сухие шершавые колонии с красным или розовым основанием, окруженные кольцом плотного преципитата (рис. 1). Колонии, окруженные желтой или прозрачной зоной, не принадлежат к Bacillus cereus.
День первый. Пробоподготовка осуществлялась следующим образом: объект исследований твердой консистенции гомогенизировали, далее 1 г вносили в пробирку с 9 мл МПБ и ставили в термостат (t = 36±1 0С) на 20±4 часа для подращивания. Объекты исследований жидкой консистенции в объеме 1 мл вносили с пробирки с 9 мл МПБ и термостатировали при выше обозначенных параметрах. Этап подращивания вводился нами с целью перевода споровых клеток в вегетативное состояние.
Второй день. Для изучения каждого образца брали по Зчашки с MYP- агаром и вносили в каждую по 0,1 мл суспензии, которую распределяли по поверхности среды, не прикасаясь сторон чашки шпателем. Затем оставляли чашки на 15 минут с закрытыми крышками при комнатной температуре для впитывания суспензии. По истечении времени чашки переворачивали и инкубировали в течение 24 часов при температуре 36±1 0С. Первый учет результатов проводили через сутки, второй - через двое суток.
День третий. На чашках отмечали презум-птивные колонии В. cereus отличающиеся крупными размерами 0,8±0,3 см розового цвета и, как правило, окруженные зоной выпадения осадка (что характеризует наличие лецитиназной активности). Для дальнейших исследований отбирались также бледно-розовые и бесцветные колонии, которые образовывали в небольшом количестве или не образовывали лецитиназу. Эти атипичные по культуральным свойствам штаммы также подлежали идентификации. С чашки отбирали по две-три одинаковые колонии для исследований. При отсутствии возможности провести отбор изолированных колоний производили повторный высев на MYP-агар. Посевы инкубировали в течение 24 часов при температуре 36±1 0С. Далее осущест-
влялась идентификация выделенных бактерий по нижеописанному алгоритму.
Четвертый день. Окраска по Граму. При наличии роста на агаризованных средах готовили мазки выросших культур, окрашивали их по Граму.
Грамположительные споровые бактерии засевали на МПБ. После 7±1 часов при температуре 36±1 0С производили высев на следующие среды:
- среду Кларка (для постановки реакции Фо-гес-Проскауера. Этот тест основан на выявлении ацетоина (ацетилметилкарбинола) - промежуточного продукта в превращении пировиноград-ной кислоты (образующейся при расщеплении глюкозы) по бутиленгликолевому пути. В присутствии кислорода и КОН ацетоин окисляется в диа-цетил, образующий соединение красного цвета. Чувствительность теста возрастает с добавлением а-нафтола перед добавлением КОН. Для определения этих продуктов исследуемые культуры микроорганизмов засевали на среду Кларка и инкубировали при температуре 36±1 0С в течение 48 часов),
- МПБ с 2, 5, 7 % содержанием хлорида натрия,
- среду с мочевиной (для определения наличия фермента уреазы),
- две пробирки МПБ с нитратами (для определения редукции нитратов и изучения образования газа из NO3 в анаэробных условиях) - одну заливали слоем стерильного вазелинового масла, другую не заливали и помещали в термостат на 24-72 часа,
- молочный агар (для определения разложения казеина изучаемую культуру засевали штрихом),
- агар с тирозином (для определения тирозина),
- картофельный агар (для изучения гидролиза крахмала),
- среды с углеводами (для определения сахаролитических свойств); применяли классический метод инокуляции культуры в пробирки, содержащие субстраты и индикаторы, Расщепление углеводов, т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа,
- МПА, обогащенный 1% глюкозы (для определения наличия каталазы),
- кукурузно-пептонный агар (для быстрого выявления спорообразования),
- среду Симмонса (для изучения способности бактерий утилизировать цитрат натрия, как единственный источник углерода, входящий в состав среды, с изменением цвета среды в присутствии индикатора бромтимолового синего),
- аргининовый бульон (для определения наличия аргининдегидрогилазы);
- анаэробный агар (для изучения роста культуры в анаэробных условиях: петлю суточной бульонной культуры засевали уколом в столбик среды),
- 0,7 % МПА (для определения подвижности),
- селективная дифференциально-диагностическая среда с фенолфталеинфосфатом натрия для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы «Bacillus cereus», включающая питательный агар любого состава, обеспечивающий рост сибиреязвенного микроба (рН 7,2-7,4), ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры: 25 мг/л полимиксина сульфата М, подавляющего рост грамотрицательных микроорганизмов, 25 мг/л триметоприма, как ингибитора роста грамположительных бактерий, 100 мг/л натрия фенолфталеинфосфата, являющегося субстратом для действия фермента щелочной фосфатазы.
Все посевы помещали в термостате при температуре 36±1 0С на 22±2 часа.
У выделенных культур изучали факторы па-тогенности в опытах in vitro (гемолитическую активность: исследуемую культуру засевали в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубировали при 36±1 °С в течение 24 ч; наличие продукции фермента желатиназы, посевы инкубировали при 36±1 °С в течение 6 суток; лецитиназная активность определяется по наличию кольца преципитата по MYP-агаре и МПБ с яичным желтком).
Бактериальные штаммы также проверяли на способность роста при рН в диапазоне 6,0-7,0; выявляли температурный минимум и максимум вегетативных форм (бульонные культуры термо-статировали в диапазоне температур 5, 10, 20, 30, 40 0С, высевали на МПА, где предварительно смещали рН до 6,0-7,0).
Пятый день. Производили учет результатов по определению ферментативных свойств выделенных культур. Готовили мазки культур, выросших на кукурузно-пептонном агаре, окрашивали и микроскопировали. Грамположительные палочки, образующие эндоспоры и продуцирующие каталазу, были отнесены нами к роду Bacillus. В наших экспериментах установлено, что число спорулирующих клеток бактерий достигает примерно 90 % на пептонно-кукурузном агаре. Форма спор оценивалась в мазках, окрашенных по методу Трухильо, приготовленных из бактериальных штаммов, которые выращивали на вышеназванной среде. Форма, характер расположения спор в
Таблица 1
Культуральные свойства бактерий B. cereus []
Вид Признак
Рост на МПА Рост на МПБ
Bacillus cereus колонии белые, восковидные, твердые, круглые, иногда окрашенные в желтоватый цвет среда мутная, осадок трудно разбиваемый, крошковатый, прочные пленка и пристеночное кольцо. При образовании пленки среда просветляется
гройы СЬОЬДН ПрОДрНЛМ,. WKWfl Л'Я ЖЛОПЫл.
а >зм *гов вкшкя среда
ми -UfiT а-энштегы-ьи лвшггиватд 4<тиаюгть иои эелтз
Рис. 2 - Схема выделения и бактериологической идентификации Bacillus cereus, составленная на основании полученных результатов исследований
L-аргинин среды образуются щелочные продукты реакции, индикатор рН бромкрезоловый пурпурный в щелочной среде приобретает лиловый цвет.
Утилизация цитрата натрия - если микроорганизмы в ходе размножения на среде продуцируют щелочные продукты, то происходит изменение цвета индикатора с зеленого на синий.
Гидролиз мочевины. Покраснение среды
клетке - признаки, используемые для группового и видового разграничения бацилл.
Возможность роста на среде с 2-7 % содержанием хлорида натрия: наблюдали рост на МПБ. Описание характерного роста некоторых представителей рода Bacillus представлены в таблице 1.
Определение аргининдегидрогилазы. При действии аргининдегидролазы бактерий на
Таблица 2
Сводные данные об основных свойствах бактерий группы «Bacillus cereus», анализируемых для внутриродовой дифференциации^
Характеристика Сводные данные об основных свойствах бактерий по «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria» Результаты собственных исследований 105 штаммов
B. cereus B.crnthracis B. mycoides + - ±
пигментация - - 105
подвижность + - 105
диаметр клетки > 1 мкм + + + 105
окраска по Граму Гр+ Гр+ Гр+ Гр+
форма спор эллипсовидная эллипсовидная
каталаза + + + 105
рост в анаэробных условиях + + + 105
рост в аэробных условиях + + + 105
Кислота из
L-арабинозы - - - 103
D-глюкозы + + + 105
гликогена + + + 105
D-маннитола - - 105
D-маннозы - - - 105
салицина d - d 78 15 12
D-ксилозы - - 105
галактозы - d 105
лактозы - - 105
мальтозы + + + 105
раффинозы - - 105
рамнозы - - 105
сорбитола - - 105
L-ксилозы - - 105
Гидролиз
казеина + + + 105
крахмала + + + 105
тирозина + d 105
мочевины d - 80 22 3
Утилизация
цитрата + d d 105
гемолитическая активность ± - ± 105
желатиназная активность + + + 105
лецитиназная активность + - - 105
щелочная фосфатаза + d 105
ацетил-метилкарбинол + + + 105
аргининдегидролаза d - d 105
редукция нитратов до нитритов d + d 105
Рост на МПА в присутствии NaCl
2 % + + 105
5 % + + 105
7 % d + d 105
Рост на МПА при рН
6,0 + + + 105
7,0 + + + 105
Рост при температуре культивирования
5 0С - 2 103
100С d d 11 94
200С + + + 105
300С + + + 105
400С + + d 105
Примечание - «+» - положительный результат, «-»- отрицательный результат, «d» - вариабельный результат, « » - данные отсутствуют.
и SEIS
es
»1
Si
р íl
и Л
■ ■ 1 is
bad «5
CS s!
I открытые водоемы, сточные воды
корма для с/х животных растительного происхождения I пряности и приправы
Рис. 3 - Источники выделения штаммов бактерий Bacillus
cereus
Таблица 3
Источники выделения штаммов бактерий Bacillus cereus
№ п/п Источники выделения Количество образцов Количество выделенных штаммов рода Bacillus Количество выделенных штаммов бактерий Bacillus cereus
1 Почва 210 198 4S
2 Вода открытых водоемов, сточные воды б7 42 1S
3 Корма растительного происхождения для с/х животных 4б 24 S
4 Пряности и приправы 90 61 17
S Молоко и молочная продукция б7 28 S
б Мясо и мясная продукция S6 45 б
Итого: S36 398 102
с мочевиной через 20-24 ч свидетельствовало о продукции изучаемыми бактериальными штаммами фермента уреазы.
Гидролиз казеина. О нем свидетельствовали прозрачные зоны вокруг колоний микроорганизмов.О разложении тирозина судили по исчезновению кристаллов тирозина в среде округ посевов.
Дополнительно летициназную активность изучаемых штаммов бактерий оценивали по появлению беловатой мути и всплывающим хлопьям в пробирках. Ферментативная активность регистрировалась по изменению цвета засеянных изучаемой культурой питательных сред с сахара-ми и индикаторами: L-арабинозой, D-глюкозой, D-маннитолом, D-маннозой, салицином, D-ксилозой, галактозой, лактозой, мальтозой, раффинозой, рамнозой, сорбитолом, L-ксилозой и индикаторами. Наличие гликогена определяли в маз-
ке, окрашенном 0,5 % раствором йода. Бактериальную культуру, выросшую на МПА, осматривали. Сравнивали с характерными особенностями, описанными в таблице 1. Для изучения продукции каталазы чашечную бактериальную культуру заливали 10% H2O2. Образовавшие пузырьки газа свидетельствовали о наличии каталазы. Учет возможности роста изучаемых бактериальных штаммов при рН 6,0-7,0 констатировали на мясо-пептонном агаре, обращая внимание на характерный рост (табл. 1). Температурный минимум и максимум вегетативных форм определяли по наличию характерного роста в диапазоне температур 5-40 °С.
Шестой день. Ставилась реакция Фогеса-Проскауэра, определяли способность выделенных штаммов к денитрификации, к гидролизу крахмала, изучали гемолитическую и желати-назную активность
Седьмой-десятый день. Определяли же-латиназную активность выделенных штаммов.
В таблице 2 представлены сводные данные об основных свойствах бактерий рода Bacillus, отнесенных к первой морфологической группе по Gordon (1973) [15], и объединенных «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria» в группу «Bacillus cereus» [14]. На рисунке 2 отражена схема выделения и бактериологической идентификации Bacillus cereus, составленная на основании полученных результатов исследований. Из 536 проб объектов ветеринарно-санитарного надзора и окружающей среды было выделено 398 штаммов, которые были отнесены к роду Bacillus и 102 - к виду Bacillus cereus. Результаты исследований систематизированы в таблице 2.
На основании анализа следующих признаков: форма эндоспоры, растяжение вегетативной клетки спорой, способности к движению и образованию пигмента, роста в аэробных и анаэробных условиях, наличию фермента каталазы, биохимической активности и наличию факторов патоген-ности, выделенные нами 102 штамма бактерии были отнесены к первой морфологической группе по Gordon (1973) [15], к группе «Bacillus cereus» по «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bartem» (2015) [14] и типированы как представители вида Bacillus cereus.
Полученные результаты исследований по изучению некоторых биологических свойств вы-
деленных нами бактерий в основном не расходятся с паспортными данными референс-штаммов - Bacillus cereus 8035, Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus АТСС 14579, полученных для работы из музея кафедры МВЭ и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ.
На основании разработанной бактериологической схемы идентификации бактерий Bacillus cereus (рис. 2), включающей 45 показателей, нами было выделено 102 штамма, типированных как Bacillus cereus. Результаты исследований представлены в таблице 3 и на рисунке 3.
Выводы
Анализируя полученные данные можно сказать (рис. 3), что наибольший процент выделенных штаммов Bacillus cereus имеет ареалом распространения пробы - 44,1 %. По литературным данным, количество Bacillus cereus в почве зависит от содержания в ней органических веществ. Оптимальной средой являются почвы с нейтральной и слабощелочной реакцией. Известно, что частота выделения бактерий Bacillus cereus в пробах почвы достигает максимума в средней полосе РФ, снижаясь в северных и южных широтах [16-17].
Примерно 17,6 % культур Bacillus cereus было выделено нами из проб сточных вод и открытых водоемов, причем, в сточных водах вышеназванные бактерии встречались в 92 % случаев, в воде рек и озер - в 22 %.Третье место по частоте обнаружения Bacillus cereus занимает группа объектов, имеющих растительное происхождение -пряности и приправы - 16,7 % и корма растительного происхождения для сельскохозяйственных животных - 7,8 % от общего числа выделенных культур.
Эмпирически установлено, что совокупный процент контаминации сырья и продуктов питания животного происхождения составил13,7 %, из них 7,8 % приходится на молочные продукты и молоко и 5,9 % - на мясо и продукты его переработки.
Таким образом, нами было установлено, что в течение 216 часов (9 дней), применяя разработанную нами схему выделения и бактериологической идентификации бактерий Bacillus cereus можно на основании 45 тестов типировать вышеназванные бактерии. Однако, вариабельность некоторых изучаемых показателей, длительность и материалоемкость исследований не позволяют нам утверждать, что данный метод эффективен для рутинных исследований.
Библиографический список
1. Toxin production in a rare and genetically remote cluster of strains of the Bacillus cereus group
/ A. Fagerlund, J. Brillard, R. Fürst [et al.] // BMC Microbiol. - 2007. - № 7. - P. 43.
2. Усовершенствование методов идентификации атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и их дифференциация от близкородственных бацилл / Е. И. Еременко, О. И. Цыганкова, А. Г. Рязанова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - № 3. - С. 76-80.
3. Еременко, Е. И. Группа бактерий «Bacillus cereus» - проблемы идентификации и таксономии / Е. И. Еременко // Медицинский вестник Северного Кавказа. - 2008. - № 3. - С. 57-60.
4. Slepecky, R. A. The Genus Bacillus-Nonmedical / R. A. Slepecky, H. T. Hemphill // Prokaryotes. - 2006. - № 4. - Р. 530-562.
5. Bacillus anthracis diverges from Related Clades of the Bacillus cereus Group in 16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Transchibed Spacers Containing tRNA Genes / A. Cerif, S. Borin, A. A. Pizzi [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. -2003. - Vol.69, № 1. - Р. 33-40.
6. Toxi-infection alimentaire collective a Bacillus cereus / A/ Talarmin, E. Nicand, M. Doucet, [et al.] // Bulletin Epidemiologique Hebdomadaire Bulletin Epidemiologique Hebdomadaire August 1993. - № 33. - Р. 154-156.
7. Джей, Дж. Д. Современная пищевая микробиология / Дж. Д. Джей, М. Дж. Лёсснер, Д. А. Гольден. - Москва: Бином, Лаборатория знаний, 2011. - 886 с.
8. Efficient Isolation and Identification of Bacillus cereus / S. M. Tallent, K. M. Kotewicz, E. A. Strain, R. W. Bennett // Group Journal of AOAC International. - 2012. - Vol. 95, №. 2. - Р. 446-451.
9. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera / D. Daffonchio, A. Cherif, L. Brusetti [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - № 69. - P. 5128-5137.
10. Бактериофаги рода Bacillus: биология и практическое применение / Н. А. Феоктистова, А. И. Калдыркаев, Д. А. Васильев [и др.]. - Ульяновск, 2017. - 112 с.
11. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики / Д. А. Васильев, А. И. Калдыркаев, Н. А. Феоктистова [и др.]. - Ульяновск: НИИЦМиБ; УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. - 98с.
12. Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of Bacillus cereus, produced under various conditions / M. M. Haggblom, C. Apetroaie, M. A. Andersson, M. S. Salkinoja-Salonen // Applied and Environmental Microbiology. - 2002. - Vol. 68. -
SI
SS es »1
Si
p и Ш S Т si ■ i
00 s!
P. 2479-2483.
13. Техэксперт. ГОСТ 10444.8-2013 (ISO 7932:2004) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод подсчета колоний при температуре 36±1 °C - URL: http://docs.cntd.ru/document/1200107307 (дата обращения 12.10.2018).
14. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria / William B. Whitman, Paul DeVos, Jonsik Chun, Sveltlana Dedysh, Brian Hedlund, Peter Kämpfer, Fred Rainey, Martha Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015. - URL: https://onlinelibrary.wiley.
com/doi/pdf/10.1002/9781118960608.gbm00530. (дата обращения 12.07.2018).
15. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // Handb. Microbiol. - Cleveland (Ohio), 1973. - Vol. 1. - P. 71-88.
16. Леонтьев, В. Н. Порча пищевых продуктов: виды, причины и способы предотвращения / В. Н. Леонтьев, Х. М. Элькаиб, А. Э. Эльхедми // Труды БГУ. - 2013. - Т. 8, ч. 1. - С. 125-130.
17. Полховский, В. А. Биохимические типы Bacillus cereus, выделенных из различных природных источников / В. А. Полховский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1970. - № 2. - С.82-86.
DEVELOPMENT AND TESTING OF BACTERIOLOGICAL DIAGRAM OF BACILLUS CEREUS BACTERIA IDENTIFICATION
Feoktistova N.A.
FSBEI HE Ulyanovsk State Agrarian University 432017, Ulyanovsk, Novyi Venets boulevard, 1; 8 (8422) 55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: Bacillus cereus, bacteriological scheme, sign, test, identification, bacteria, sample
The article presents results of bacteriological scheme development for isolating Bacillus cereus bacteria from veterinary and sanitary surveillance objects and identification of bacteria as part of a complex test system for indicating and identifying zooanthropogenic bacteria of the Bacillus cereus group. Model microorganisms for selecting research parameters and bacteriological tests were reference strains of Bacillus cereus 8035, Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus ATSS14579. Based on the analysis of the following characteristics: endospore shape, spore extension of the vegetative cell, ability to move and form pigment, growth in aerobic and anaerobic conditions, the presence of catalase enzyme, biochemical activity and the presence of pathogenicity factors, 102 bacterial strains isolated by us were assigned to the first morphological group according to Gordon (1973), to Bacillus cereus group according to «Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria" (2015) and categorized as members of Bacillus cereus genus. Within 216 hours (9 days), using the developed scheme for isolation and bacteriological identification of Bacillus cereus bacteria, the above bacteria can be typed on the basis of 44 tests. 398 strains were isolated from 536 samples of objects of veterinary and sanitary supervision and the environment (210 soil samples, 67 - water from open reservoirs, waste water, 46 - animal feed for agricultural animals, 90 - spices and seasonings, 67 - milk and dairy products, 56 - meat and meat products) that were assigned to Bacillus genus and 102 to Bacillus cereus group.
Bibliography
1. Toxin production in a rare and genetically remote cluster of strains of the Bacillus cereus group / A. Fagerlund, J. Brillard, R. Fürst [et al.] // BMC Microbiol. - 2007. - № 7. - P. 43.
2. Improvement of methods for identification of atypical strains of anthrax causative agent and their differentiation from closely related bacilli / E.I. Eremenko, O.I. Tsygankova, A.G. Ryazanova [et al.] //Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunology. - 2009. - No. 3. - P. 76-80.
3. Eremenko, E.I. The group of "Bacillus cereus" bacteria - problems of identification and taxonomy / E.I. Eremenko // Medical vestnik of the North Caucasus. - 2008. - No. 3. - P. 57-60.
4. Slepecky, R. A. The Genus Bacillus-Nonmedical/R. A. Slepecky, H. T. Hemphill//Prokaryotes. - 2006. - № 4. - P. 530-562.
5. Bacillus anthracis diverges from Related Clades of the Bacillus cereus Group in 16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Transchibed Spacers Containing tRNA Genes/A. Cerif, S. Borin, A. A. Pizzi [et al.]//Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69, № 1. - P. 33-40.
6. Toxi-infection alimentaire collective ä Bacillus cereus / A/ Talarmin, E. Nicand, M. Doucet, [et al.] // Bulletin Epidemiologique Hebdomadaire Bulletin Epidemiologique Hebdomadaire August 1993. - № 33. - P. 154-156.
7. Jay, J.D. Modern food microbiology / J.D. Jay, M.J. Lössner, D.A. Golden. - Moscow: Binom, Laboratory of Knowledge, 2011.-- 886 p.
8. Efficient Isolation and Identification of Bacillus cereus /S. M. Tallent, K. M. Kotewicz, E. A. Strain, R. W. Bennett// Group Journal of AOAC International. - 2012. - Vol. 95, №. 2. - P. 446-451.
9. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera / D. Daffonchio, A. Cherif, L. Brusetti [et al.]//Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - № 69. - P. 5128-5137.
10. Bacteriophages of Bacillus genus: biology and practical application / N.A. Feoktistova, A.I. Kaldyrkaev, D.A. Vasiliev [et al.]. - Ulyanovsk, 2017.--112 p.
11. Identification of Bacillus cereus bacteria based on their phenotypic characteristics / D.A. Vasiliev, A.I. Kaldyrkaev, N.A. Feoktistova [et al.]. - Ulyanovsk: Research Innovation Center of Microbiology and Biotechnology of USAA named after P.A. Stolypin, 2013 .—98 p.
12. Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of Bacillus cereus, produced under various conditions / M. M. Haggblom, C. Apetroaie, M. A. Andersson, M. S. Salkinoja-Salonen // Applied and Environmental Microbiology. - 2002. - Vol. 68. - P. 2479-2483.
13. Techexpert. State Standard 10444.8-2013 (ISO 7932: 2004) Microbiology of food and animal feed. Horizontal method for counting presumptive bacteria of Bacillus cereus. The method for counting colonies at 36 ± 1 ° C is URL: http://docs.cntd.ru/document/1200107307 (access date: 12.10.2018).
14. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria / William B. Whitman, Paul DeVos, Jonsik Chun, Sveltlana Dedysh, Brian Hedlund, Peter Kämpfer, Fred Rainey, Martha Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015. - URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/9781118960608. gbm00530. (access date: 12.07.2018).
15. Gordon, R. The genus Bacillus /R. Gordon //Handb. Microbiol. - Cleveland (Ohio), 1973. - Vol. 1. - P. 71-88.
16. Leontiev, V. N. Food spoilage: types, causes and methods of prevention / V. N. Leontiev, Kh. M. Elkaib, A. E. Elkhedmi //Scentific works of BSU. - 2013.- V. 8, part 1. - P. 125-130.
17. Polkhovsky, V. A. Biochemical types of Bacillus cereus isolated from various natural sources / V. A. Polkhovsky //Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunology. -1970. - No. 2. - P. 82-86.
