CC BY
134
УДК 602.3:579.6
DOI 10.18286/1816-4501-2018-3-196-201
подбор специфических праймеров на основе гена 16s ррнк для бактерий «группы bacillus cereus»
Феоктистова наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
васильев дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Мастиленко Андрей владимирович, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: группа Bacillus cereus, праймеры, параметры, ПЦР РВ, метод, идентификация В статье описаны результаты исследований по подбору специфических праймеров на основе гена 16S рРНК для бактерий «группы Bacillus cereus», которая включает виды Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus cytotoxicus, Bacillus weihenstephanensis (определена структура гена, консервативные регионы данного гена представленных в системе NCBI (BLASTnucleotide и PRIMER BLAST) штаммов вышеназванных групп, проведено множественное выравнивание гена и подбор праймеров). Систез праймеров и зондов осуществлялся методом химического концентрирования на приборе ASM-800 (фирма «Би-оссет», г. Новосибирск). Олигонуклеотиды, способные специфически связываться с представителями всей «группы Bacillus cereus» - GCGGTAATACGTAGGTGGCA-GTTTACGGCGTGGACTACCA. В результате ряда проведенных экспериментов по оптимизации были определены параметры постановки полимеразно-цепной реакции, при которой наблюдается амплификация максимального количества специфического продукта реакции: температура отжига праймеров - 60°С, а их количество - по 8 пмоль/реакцию. При использовании 16 референс и 116 выделенных из окружающей среды штаммов исследуемой «группы Bacillus cereus» была проведена валидация ПЦР. В итоге отнесены 132 штамма были идентифицированы как представители «группы Bacillus cereus». Постановка ПЦР с детекцией в режиме реального времени с применением праймеров, специфичных для представителей «группы Bacillus cereus», рекомендуется как метод первичной идентификации вышеназванных бактерий и способ индикации в объектах ветеринарно-санитарного надзора, чувствительность которого составляет 102-103 мк.к/г.
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ,
выполняемых по заданию МСХ РФ в 2018 году.
введение
«Группа Bacillus cereus» включает бактерии следующих видов: Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus cytotoxicus, Bacillus weihenstephanensis). Представители рода Bacillus, за исключением Bacillus anthracis и Bacillus cereus, в норме не оказывают патогенного действия, но при ослаблении защитных сил макроорганизма могут вызывать острый, клинически выраженный патологический процесс у человека, животных и рыб [1-4].
По литературным данным до настоящего времени не разработано универсальной и максимально достоверной системы для дифференциации 95 видов рода Bacillus. Многими исследователями доказано, что внутривидовое разграничение рода Bacillus представляется достаточно сложным и не всегда достоверным. Физиолого-биохимические признаки, по которым принято дифференцировать виды, часто изменчивы и ненадежны [5-8]. Известно, что молекулярно-
генетическая дифференциация имеет высокую разрешающую способность и может исключить различные интерпретации, которые связаны с фенотипической изменчивостью бацилл [9-10]. Поэтому разработка метода идентификации бактерий «группы Bacillus cereus» с применением молекулярно-генетических методов исследований является актуальной темой для исследований.
Цель исследований - подобрать специфические для бактерий «группы Bacillus cereus» праймеры на основе гена 16S рРНК, оптимизировать методику постановки полимеразно-цеп-ной реакции с детекцией «в режиме реального времени» и апробировать полученные результаты на полевых и референс-штаммах Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis
объекты и методы исследований
В строго контролируемых экспериментах использовали чистые штаммы культур бакте-
ВС4894 16S ribosomal RNA [ Bacillus cereus ATCC14579 ]
Gene ID: 1207236, updated on 2-Арг-2013
Gene symbol BC4894
Gene description 16S ribosomal RNA
Locus tag BC4894
Gene type rRNA
RNA name 16S ribosomal RNA
Organism Bacillus cereus ATCC 14579 (strain- ATCC 145791
Lineage Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus cereus group
Genomic context
Sequence: NC_004722.1 (4807094..4808649, complement)
NCJ04722.1
[4M38H*
6C_rû5 BMW41 BC46Î6
Bacillus cereus ATCC 14579 chromosome, complete genome
LOCUS 2016
linear CON 28-AUG-
Genomic regions, transcripts, and products
Genomic Sequence: NCJ04722.1
Go to reference sequence details
Go to nucleotide: Graphics FASTA GenBank
1 ¿J % NC_004722.1 T 1 Find:
14,808,800 4,308,600 4,808,400 4,808,200 14,808 К 14,807,800 14,807,600
Uli HU ВС4894
STS Markers |4,808,800 14,808,600 |4,808.400 ULI ffl ¡4,808,260 |4,808 К |4,807,800 |4,807,600 |
NC_004722.1: 4.8M..4.8M (2.0Kbp) С
A
NC_004722 1556 bp DN.
/locus_tag="BC4894" /product="16S ribosomal RNA" /note="rRNA operon M; BC4894" /db xref="GeneID:1207236"
IN
1 ctttattgga gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc
61 aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt agcggcggac gggtgagtaa
121 cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga
181 taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg
241 gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc
301 cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag
361 gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg
421 atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct agttgaataa
481 gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg
541 gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt
601 ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag
661 acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat
721 ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag
781 cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa
841 gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg
901 agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc
961 atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgaaaac
1021 cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag
1081 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc
1141 catcattaag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat
1201 gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac
1261 aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa accgttctca gttcggattg
1321 taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc
1381 ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac
1441 ccgaagtcgg tggggtaacc tttttggagc cagccgccta aggtgggaca gatgattggg
1501 gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggatcacctc ctttct
Б
рис. 1 - Анализ (А) и структура (Б) гена 16s ribosomal Bacillus cereus group
рис. 2 - Фрагмент сравнительного анализа гена 16s ribosomal представленных в ncbi штаммов Bacillus cereus group
X » к
СР023245.1:264993-266702 Bacillus ce г eus strain HBL-AI chromosome, ■ CP012726.1:289992-291701 Bacillus anthracis strain PR09-1, complete g CPOIOSIS. 1:269969-2916?$ Bacillus anthrads strain РЫКпо sequence HZ_CP009692.1 C2-W857-239302 Bacillus mycoides Strain ATCC 6462, < NZ_CPQQ9692.1 :c5248243-524*696 Bacillus mycoides strain ATCC $54, .
С GAT А т т G А А С Т т т G A A A A С T A A A С G A A A С А А А С А А С G Т G AAA С G T С A A T
íC С А А G T А G T Т С Т т Т G A A A a С T G A A С G A A A С А А А С А А С G т G AAA С G T С ДАТ
.с a rej а С А А G T Т С Т т т G A A A A С T G A A С G A A A С А А А с А А С G т G AAA С G T С ДАТ
с AGA с А А G T Т С т Т Т G A A A a С T G A A С G A A A с А А А С: А А С G т G AAA с G T с ДАТ
CPÖ20383.1 :B829-10538 SsciWlis cervus Strain FORC6Ö chromosome, CP02324S. 1 : 264993-266702 Bacillus ce reus strain HBL-AI chromosome, 0*012726.1:289992-291701 Bacillus anthracis straw PR09-1, complet< CP010813.1:289969-291678 Bacillus anthracis strain Pollino sequence
МИ—ИМ
ttattggagagtttgatcctg
ее tí п
T6T$6b$2ííÍ66t90
гТТТ т А T т т ТА G A T G С T A G A С A A A С T A A С TTT A T T G G A G A G T T T G A T С CTG
сТ T Т т А T т т T А G A T G С T A G A С A A A С T A A С T T T A T T G G A G A G T T T G A T С CTG
,Т т т т А T т т T А G A T G С T A G AC A A A С T A A С TTT A T T G G A G A G T T T G A T С CTG
т т т т А т т т T А G A T G с T A G A С A A A с T A A С TTT A T T G G A G A G T T T G A T С CTG
г- -...........................^ A A T T T T G G G G A A G G A A G T T T G T T T G G A T A T С С CTG CTG
gctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgaat
им ice ios по из
не
HS 120 122 124
IK
130 132 13« 136
140
146 l*B ISO
CP020383.1:8829-10538 ВэсШus cereus strain FOOC60 chromosome, се.'С С T С A СР023245.1:264993-266702 Bacillus се reus strain HBL-AI chromosome, tG С T С A CP012726.1 -.289992-291701 Bacillus anthrads strain PROS' 1, complete g-G С T С A CP010BI3.1:289969-291678 Bacillus anthracis strain Pollino sequence G С T С А HZ_ С PO 00692.1 : с240857-239302 Bacillus mycoides strain ATCC 6462, со G С Т С А NZ_CP009692.1 : С5248243-5246686 Bacillus myCOideS Strain ATCC S54, CG ct С A
АТС
A T G АТС A T G A T G a T G
aacgctggcggcgtccct a^a cgctggcggcgt gcct acgctggcggcgtgcct acgctggcggcgtgcct acgctggcggcgtgcct acgctggcggcgtgcct
A A T A A T A A A A T A С A A T A С A A T A С
ätgcaagtcg a t g с a a g г с g atgcaagtcc atgcaagtcg atgcaagtcg atgcaagtcg
G С G
G С G
G С G
G С G
G С G
G С G
МШПВШШИВ
GGATTAAGAGCTTGCTCTTATG/
iGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC
CP020383.1:8829-10538 Bacillus ce reus strain FORC6O chromosome, cor g g CP023245.1:264993-266702 Bacillus ce reus strain HBL-AI chromosome, i G G CP012726.1:289992-291701 Bacillus anthracis strain PRQ9-1, complete g< G G CP010813.1:289969-291678 Bacillus anthracis strain PoV.no sequence G G NZ_CP009692.1 :c2408S7-239302 Bacillus mycoides strain ATCC 6462, cc G G HZ_CP009692-1 C5240243-5246686 BacMis mycoides strain ATCC 554, cG G
ISS W 1« 1W ■в« I&8 70 72 76 173 1«0 183 1S4 íes iea 190 192 9* 9« m 00
G A G С T T G С т с T т А Т G A A G T T A G С G G С G G A С G G G T G A G T A A с А с
G A G С T T G С т с т т А т G A A G T T A G С G G CSG A С G G G T G A G T A A с А с
G A G С T T G с т с т т А т G A A G T T A G С G G С G G A С G G G T G A G T A A с А с
G A G С T T G С т С т т А т G A A G T T A G С G G С G G A С G G G T G A G T A A С А с
G A G С T K с т с т т А т G A A G T T A G с G G С G G A С G G G T G A G T A A с Д с
G A G С T T G с т с T т А т G A A G T T A G с G G С G G A С G G G T G A G T A A с А С
gtgggtaacct-cccataagactgggataactccgggaaaccggggctaa
201 204 206 20S 210 212 CP020383.1:3829-10538 Bacillus cereus strain FORC6O chromosome, cor G TGGGTAACCTGCCCA CP023245.1:264993-266702 Bacillus cereus Strain HBL-AI chromosome, tG TGGGTAACCTGCCCA CP012726. i .-289992-291701 Bacillus anthracis stram PR09-1, complete í-gtgggtaacctgccca CP010813.1:289969-291678 Bacillus anthracis strain Pollino sequence GTGGGTAACCTGCCCA NZ„CPQ09692.1 ¡C240857-239302 BacH/US mycoides Strain ATCC 6462, CCGTGGGTAACCTACCCA NZ_CP009692. í : С5248243-5246696 Bacillus mycoides Strain ATCC S54, cGTGGGTAACCTACCCA
216 21B 220 722 22* ¿26 226 230 232 254 236 236 240 2*2 244 246 246 250
А С T G G G А С T G G G A С T G G G A С T G G G A С T G G G й С T G G G
"AACTCCGGG "AACTCCGGG "AACTCCGGG "AACTCCGGG "AACTCCGGG "AACTCCGGG
aaac cggggct aaac cggggct aaac cggggct aaaccggggct aaac cggggct aaaccggggct
A A A A A A A A A A A A
faccggataa- attttgaac- G С *
ьшшдпь
gttc-aaattgaaaggcggcttcg
CP020383.1:8829-10538 Bacillus cereus strain FORC6O chromosome, cor T A С С G G CP023245.1:264993-266702 Bacillus cereus strain H6L-AI chromosome, tt л с с g g CP012726.1:289992-291701 Bacillus anthracis strain PR09-1, complete g<T A С С G G CP010S13-1:289969-291678 Bacillus anthracis strain Polhno sequence T A С С G G NZ_CP009692.1 :c240857 239302 Bacillus mycoides strain ATCC 6462, со T A С С G G NZ_ CP009692.1 ; с5248243-5246696 BaciUuS rnyCOides strain ATCC S54, c T A С С G G
254 250 258 J63 JE2 354 2ff, 25Л 270 272 274 27B 27B 230 282 284 AACATTTTG AACATTTTG
288
290 292 294 296 296 ЗЛО
aacattttg aacattttg aatattttg aatattttg
A A С С G С A A A С С G С A A A С С G С A A A С С G С A
A A С T G С A A A С T G С A
T G G T T С G T G G T T С G T G G T T С G T G G T T С G
a a a t t g д a a t t g
a a a t t g a a a t t g gttcaaaattg gttcaaaattg
aaaggcggcttcg aaaggcggcttcg
aaaggcggcttcg aaaggcggcttcg aaaggcggcttcg aaaggcggcttcg
MHMHI
GCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA
Mi
SO* 5W MB MO )I2 Э+4 HÍ Я* ^Ш^ШШШП^ЯП^МШНМ!»
CP020383.1:8829-10538 Bacillus C&VuS Strain FORC6O Chromosome, GOr« С CP02324S. 1:264993-266 702 BacMuS cereus Strain HBL-AI chromosome, '. s с CP012726.1:289992-291701 Baáthis anthracis strain PRD9-1, complete : ClviQ8lJ.l:2899í9-29lc?$ ee&lftjs anthracis strain РоШпо sequence NZ_CP009692- i C2-W8S7-23930Г ва с h mycotíes strain ATCC 6462. ®6 С T S T С i HZ_CP009693.l:cS248243-$24t686 eecitojs mycoitíes strain ATCC S54. (SÍTGTCe
tgtcacttít! tgtc^cttatg gctgtcacttatc ccretcHiTiTfic
С T T Ü Г 5 5 С T T Л T i s
А Т G G A С С С G С G T С G С А T Т А G С Т А G T T G G T G A G G T A A
А Т G G A С С С G С G T С G С А T Т А G С т А G T T G G T G A G G T A A
А Т G G А С С С G С G T С G С А T Т А G С т А G T T G G T G A G G T A A
А Т G G А С С С G С G T с G С А Т Т А G с т А G T T G G T G A G G T A A
А Т G G А С С С G С G T С G С А Т Т А G С т А G T T G G T G A G G T A A
А Т G G А С С С G с G T с с А Т Т А G С т А G T T T G A G G T A A
Рис. 3 - Фрагмент множественного выравнивания гена 16S ribosomal Bacillus cereus group
рий, которые были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ: Bacillus anthracis СТИ-1, 55-ВНИИВВиМ, Шуя-15, Sterne 34 F2, 1007, 1190R, 104; 94; Ichtiman, «Девис», М-71; Bacillus
mycoides - 12 штаммов, Bacillus cereus - 106 штаммов; Bacillus thuringiensis - 3 штамма; Bacillus subtilis - 16 штаммов, Bacillus megaterium - 6 штаммов, Bacillus pumilus - 18 штаммов, Bacillus coagulans - 5 штаммов, Paenibacillus polimixa - 2 штамма, Paenibacillus larvae - 2 штамма, Listeria
monocytogenes - 3 штамма. Бактериальные культуры хранились в столбике 0,7 % мясо-пептонного агара, засеянного уколом, при температуре 2-4 0С.
Для подбора и оптимизации праймеров, специфичных в отношении изучаемых бактерий и бактериофагов, были использованы ресурсы NCBI: BLAST nucleotide и PRIMER BLAST. Систез праймеров и зондов осуществлялся методом химического концентрирования на приборе ASM-800 (фирма «Биоссет», г. Новосибирск) с использованием реагентов: мономеров (dA-CE фосфорамидид, dC(Bz) CE фосфорамидид, dG-CE фосфорамидид, dT-CE фосфорамидид), активатор 5- Ethylthio-1H-Tetrazole, полимеры CPG, колонки 100nmol/ 12 ul (dA, dC, dG, T). Выделение ДНК проводили с использованием набора реагентов EX 511 «ДНК-Экстран-2» (ООО «Синтол», г. Москва), для постановки ПЦР применяли набор реагентов R-412 «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ», имеющий состав дезоксинуклео-тидтрифосфаты - 2,5 мМ, 10-кратный ПЦР буфер, MgCl2 - 25 мМ, Taq ДНК-полимераза с ингибиру-ющим активность фермента антителами-5 Е/мкл (ООО «Синтол», г. Москва).
результаты исследований Так как к «группе Bacillus cereus» относят виды Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus my-coides, Bacillus thuringiensis, Bacillus cytotoxicus, Bacillus weihenstephanensis, то сравнение и разработка системы индикации была проведена с использованием данных геномов, доступных для изучения в системе NCBI. Сначала была определена
позиция и полный нуклеотидный состав гена 16S ribosomal «группы Bacillus cereus» (рис. 1).
Затем с использованием ресурсов NCBI Blast nucleotide было проведено прямое сравнение исследуемого гена у всех доступных для изучения штаммов к «группе Bacillus cereus». В итоге проведенного сравнения были получены данные о 99% совпадении нуклеотидного состава исследуемого гена у всех, доступных для исследования, штаммов «группы Bacillus cereus» (рис. 2).
Далее с помощью ПО UGENE было проведено множественное выравнивание гена 16S ribosomal для выявления консервативных участков, которые могут быть использованы при дизайне праймеров при индикации бактерий «группы Bacillus cereus» (рис. 3. После определения консервативных регионов для данных фрагментов были определены олигонуклео-тиды, способные специфически связываться с представителями всей «группы Bacillus cereus» (рис. 4).
В результате ряда проведенных экспериментов по оптимизации были определены параметры постановки полимеразно-цепной реакции, при которой наблюдается амплификация максимального количества специфического продукта реакции: температура отжига праймеров - 60°С, а их количество - по 8 пмоль/реак-цию.
При использовании 15 референс и 117 выделенных из окружающей среды штаммов
PrimerlD Sequence(5'-3') Tm( °C) Primer Quality(%) Fragment Size(bp)/Tm(°C) Topt(
1F26 1 366-389 agtagggaatcttccgcaatggac 58, 3 95
1R37 1 1149-1171 cagtcaccttagagtgcccaact 58, 0 90 806/85 65
1F26 1 366-389 agtagggaatcttccgcaatggac 58, 3 95
1R82 1 628-648 aatgaccctccacggttgagc 58, 8 90 283/84 64
1F26 1 366-389 agtagggaatcttccgcaatggac 58, 3 95
1R13 1 1357-1378 ggcatgctgatccgcgattact 59, 5 90 1013/86 65
1F26 1 _366-389 agtagggaatcttccgcaatggac 58, 3 95
1R93 1 490-513 ggctttctggttaggtaccgtcaa 58, 4 89 148/80 63
1F20 1 _278-298 tcaccaaggcaacgatgcgta 58, 5 91
1R103 : 1 377-399 tcagactttcgtccattgcggaa 58, 3 93 122/83 63
1F26_ 1 _366-389 agtagggaatcttccgcaatggac 58, 3 95
1R87 1 _553-577 caataattccggataacgcttgcca 58, 0 88 212/82 63
1F39_ 1 _476-497 aataagctggcaccttgacggt 58, 2 93
1R82_ 1 _628-648 aatgaccctccacggttgagc 58, 8 90 173/82 63
1F37 1 538-557 GCGGTAATACGTAGGTGGCA 59, 9 93
1R37_ 1 _809-828 GTTTACGGCGTGGACTACCA 60, 0 90 291/85 60
1F39_ 1 476-497 aataagctggcaccttgacggt 58, 2 93
1R13_ 1 _1357-1378 ggcatgctgatccgcgattact 59, 5 90 903/86 65
1F37 1 466-489 gtgctagttgaataagctggcacc 58, 4 93
1R82_ 1 _628-648 aatgaccctccacggttgagc 58, 8 90 183/83 64
И
рис. 4 - варианты праймерных систем для амплификации фрагмента гена 16s ribosomal Bacillus cereus group (пунктиром выделена пара олигонуклеотидов, которая была использована в дальнейших исследованиях)
исследуемой «группы Bacillus cereus» была проведена валидация ПЦР. выводы
В результате проведенных исследований были подобраны специфические праймеры на основе гена 16S рРНК для бактерий «группы Bacillus cereus» GCGGTAATACGTAGGTGGCA-GTTTACGGCGTGGACTACCA и параметры постановки полимеразно-цепной реакции с детекцией «в режиме реального времени» со специфическими праймерами (температура отжига на матрице 600С, количество праймеров - 8 пмоль).
Для апробации праймерной системы и параметров постановки ПЦР РВ были проведены исследования по идентификации музейных штаммов Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis. Установлена принадлежность вышеназванных штаммов бактерий к «группе Bacillus cereus». Первичная дифференциация представителей рода Bacillus, проведенная в течение 2,5 - 3,0 часов, позволит исследователям разработать оптимальный алгоритм действий для дальнейшей идентификации, так как методика бактериологического ти-пирования опирается на схему идентификации представителей первой морфологической группы по R. Gordon (1973) («Ключ для определения типичных штаммов видов рода Bacillus»), которая до настоящего времени является основой видовой идентификации вышеназванных микроорганизмов, описанной в «Bergey's Manual of Systematic Bacteriology» (2015) [11-14].
Библиографический список
1. Bacillus anthracis Diverges from Related Clades of the Bacillus cereus Group in 16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Transchibed Spacers Containing tRNA Genes / A. Cerif, S. Borin, A.A. Pizzi [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, №1. - Р. 33-40.
2. Усовершенствование методов идентификации атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и их дифференциация от близкородственных бацилл / Е.И. Еременко, О.И. Цыганкова, А.Г. Рязанова [и др.] // Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 2009. - № 3. - С. 76-80.
3. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera / D. Daffonchio, A. Cherif, L. Brusetti, A. Rizzi, D. Mora, A. Boudabous [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - № 69. - P. 5128-5137.
4. Идентификация бактерий Bacillus cereus
на основе их фенотипической характеристики / Д.А. Васильев, А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова [и др.]. - Ульяновск: НИИЦМиБ УлГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. - С. 24.
5. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis / R. Easterday, M. Van Ert, Т. Simonson, D. Wagner, L. Kenefic, C. Allender, P. Keim // II J. Clin. Microbiol. - 2005. - V.43 (4). - P.1995-1997.
6. Toxin production in a rare and genetically remote cluster of strains of the Bacillus cereus group / A. Fagerlund, J. Brillard, R. Fürst, M.H. Guinebretiere, P.E. Granum // BMC Microbiol. -2007. - № 7. - P. 43.
7. Contzen, M. Isolation of Bacillus cytotoxi-cus from various commercial potato products / M. Contzen, M. Hailer, J. Rau // International Journal of Food Microbiology. - 2014. - № 174. - P.19-22.
8. Heral, V. Bacillus cereus as a cause of alimentary intoxication / V. Heral // Cesk Hyg. - 2013. -№ 8. - Р.303-307.
9. BLAST+: architecture and applications / C. Camacho, G. Coulouris, V. Avagyan, N. Ma, J. Papa-dopoulos, K. Bealer [et al.] // BMC Bioinformatics.
- 2009. - № 10. - P. 421.
10. Ефимочкина, Наталья Рамозановна. Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа: автореф. дис. ... канд. биологических наук: 14.02.01 / Н.Р. Ефимочкина.
- Москва, 2010. - 28с.
11. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). - 1973. -V.1. - P.71-88.
12. Bergey's Manual of Systematics of Ar-chaea and Bacteria [Электронный ресурс] / William B. Whitman, Paul DeVos, Jonsik Chun, Svelt-lana Dedysh, Brian Hedlund, Peter Kämpfer, Fred Rainey, Martha Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015. - URL: https://onlinelibrary.wiley.com/ doi/pdf/10.1002/9781118960608.gbm00530. -дата обращения 12.07.2018.
13. Бактериофаги рода Bacillus: биология и практическое применение / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев [и др.]. - Ульяновск, 2017. -112 с.
14. Выделение бактериофагов, специфичных к Bacillus anthracis / Е.И. Климушкин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин, К.В. Белова // Сборник материалов III Международного форума БИОКИРОВ - 2015. -Киров, 2015. - С. 10-12.
SELECTION OF SPECIFIC PRIMERS BASED ON 16S RRNA GENE FOR BACILLUS CEREUS BACTERIA
Feoktistova N.A., Vasiliev D.A., Mastilenko A.V. FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017, Ulyanovsk, Novyy Venets Boulevard, 1; 8 (8422) 55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: Bacillus cereus group, primers, parameters, PCR RV, method, identification
The article presents results of studies on the selection of specific primers based on 16S rRNA gene for bacteria of "Bacillus cereus group", which includes species of Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus cytotoxicus, Bacillus weihenstephanensis (the gene structure was determined, as well as conservative regions of the given gene represented in the NCBI system (BLAST nucleotide and PRIMER BLAST) of the strains of the above groups, multiple gene alignment and primer selection were performed). Synthesis of primers and probes was performed by chemical concentration method on ASM-800 instrument (Biosset, Novosibirsk). Oligonucleotides that can specifically bind to representatives of the entire "Bacillus cereus group" are GCGGTAATACGTAGGTGGCA-GTTTACGGCGTGGACTACCA. As a result of a series of improvement experiments, the parameters of the polymerase chain reaction were determined, at which the maximum amount of specific reaction product was amplified: annealing temperature of the primers was 60 ° C, and their number was 8 pmol / reaction. PCR validation was performed with application of 16 reference and 116 isolates from the environment of the studied "Bacillus cereus group". As a result, 132 strains were identified as representatives of "Bacillus cereus group". The real-time detection of PCR with application of primers specific for the representatives of "Bacillus cereus group" is recommended as a method of primary identification of the above bacteria and a method of indication in the objects of veterinary and sanitary supervision, its sensitivity is 102-103 ß.k / g.
Bibliography
1. Bacillus anthracis Diverges from Related Clades of the Bacillus cereus Group in 16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Transchibed Spacers Containing tRNA Genes/A. Cerif, S. Borin, A.A. Pizzi et al., Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, No. 1. - P. 33-40.
2. Improvement of identification methods of atypical strains of the causative agent of anthrax and their differentiation from closely related bacilli/ E.I. Eremenko, O.I. Tsygankova, A.G. Ryazanov [et alt] //Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology and Immunology. - 2009. - No. 3. - P. 76-80.
3. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera / D. Daffonchio, A. Cherif, L. Brusetti, A. Rizzi, D. Mora, A. Boudabous [et al.]//Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - No. 69. - P. 5128-5137.
4. Identification of Bacillus cereus bacteria on the basis of their phenotypic characteristics / D.A. Vasiliev, A.I. Kaldyrkaev, N.A. Feoktistova [et alt]. -Ulyanovsk: USAA named after P.A. Stolypin, 2013. - P. 24.
5. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis / R. Easterday, M. Van Ert, T. Simonson, D. Wagner, L. Kenefic, C. Allender, P. Keim //II J Clin. Microbiol. - 2005. - V.43 (4). - P.1995-1997.
6. Toxin production in a rare and genetically remote cluster of strains of the Bacillus cereus group / A. Fagerlund, J. Brillard, R. Fürst, M.H. Guinebretiere, P.E. Granum //BMC Microbiol. - 2007. - No. 7. - P. 43.
7. Contzen, M. Isolation of Bacillus cytotoxicus from various commercial potato products / M. Contzen, M. Hailer, J. Rau // International Journal of Food Microbiology. - 2014. - No. 174. - P.19-22.
8. Heral, V. Bacillus cereus as a cause of alimentary intoxication / V. Heral // Cesk Hyg. - 2013.-No. 8. - R.303-307.
9. BLAST +: architecture and applications / C. Camacho, G. Coulouris, V. Avagyan, N. Ma, J. Papadopoulos, K. Bealer [et al.]// BMC Bioinformatics. - 2009. - No. 10. - P. 421.
10. Efimochkina, Natalia Ramozanovna. New bacterial pathogens in food products: experimental substantiation and development of a control system using the methods of microbiological and molecular genetic analysis: the author's abstract of dissertation of Candiate of Biological Sciences: 14.02.01 / N.R. Efimochkina. - Moscow, 2010. - 28p.
11. Gordon, R. The genus Bacillus/R. Gordon//In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). -1973. - V.1. - P.71-88.
12. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria [Electronic resource] / William B. Whitman, Paul DeVos, Jonsik Chun, Sveltlana Dedysh, Brian Hedlund, Peter Kämpfer, Fred Rainey, Martha Trujillo. - Hoboken, New Jersey: Wiley, 2015. - URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ pdf/10.1002/9781118960608.gbm00530. - access date 12.07.2018.
13. Bacteriophages of Bacillus genus: biology and practical application / N.A. Feoktistova, A.I. Kaldykayev, D.A. Vasiliev [et alt]. - Ulyanovsk, 2017. -156 p.
14. Isolation of bacteriophages specific for Bacillus anthracis / E.I. Klimushkin, N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin, A.V. Aleshkin, K.V. Belova // Collected materials of the III International Forum BIOKIROV - 2015. - Kirov, 2015. - P. 10-12.
