CC BY
9
УДК 616.981.452:615.371/.372
А.К.Никифоров, О.А.Волох, С.А.Еремин, Т.В.Алёнкина Сравнительная оценка штАммов YERSINIA PESTIS
по уровню продукции капсульного антигена чумного микроба
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Рекомбинантный штамм Yersinia pestis KM277(EV11MpFSK-3) Kmr, является перспективным штаммом-продуцентом капсульного антигена (Ф1) поскольку его продуктивные свойства и иммунохимическая активность синтезируемого им антигена Ф1 была выше, чем у Y pestis EV и его производных. Несомненным преимуществом штамма Y. pestis КМ277 является его способность к синтезу Ф1 при температуре 28 °С и отсутствие у него собственных плазмид чумного микроба. Разработана схема масштабированного культивирования рекомбинантного штамма и получения препарата капсульного антигена.
Ключевые слова: Yersinia pestis, капсульный антиген (Ф1), культивирование.
A.K.Nikiforov, O.A.Volokh, S.A.Eremin, T.V.Alenkina
Comparative Assessment of Yersinia pestis Strains
on the Level of Plague Microbe Capsular Antigen Production
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Yersinia pestis recombinant strain KM277 (EV11MpFSK-3) Kmr is a potential producer-strain of capsular antigen (Fl), since its productive properties and immunochemical activity of Fl-antigen, synthesized by it, are higher than in Y. pestis EV and its derivatives. The apparent advantage of the Y. pestis KM277 strain is the ability to synthesize F1 antigen at 28 °C, and the absence of its own plague-microbe plasmids in cells. Worked out is the scheme of scaled cultivation of the recombinant strain and obtainment of capsular antigen preparation.
Key words: Yersinia pestis, capsular antigen (Fl), cultivation.
Существование природных очагов чумы, занимающих значительные территории (6-7 % суши), в т.ч. на территории Российской Федерации имеется 11 природных очагов (общей площадью более 250 тыс. км2), обусловливает потенциальную опасность эпидемических вспышек заболевания чумой [7], и в этой связи необходимость усовершенствования диагностических и профилактических препаратов. Одним из практически значимых антигенов чумного микроба является видоспецифический капсульный антиген - фракция 1 (Ф1), на основе которого созданы и длительное время успешно применяются на практике антигенные и иммуноглобулиновые диагностикумы для постановки серологических реакций [6], и интенсивно разрабатываются новые тест-системы [10].
В качестве штаммов продуцентов Ф1 нами были изучены изогенные производные штамма У. реи^и ЕУ, утратившие ряд собственных плазмид, но несущих плазмиду pFra: У. pestis КМ225 (pFra+ pCad-
pPst-); У. реи^и КМ226 ^га+ pCad+ рРз1^); У. реи-tis КМ227 ^га+ pCad- pPst+), сконструированные О.А.Проценко, и генно-инженерный штамм У. реи^и 277 (ЕV11МpFSK-3) Ктг. Ранее сообщалось о суперпродукции антигена Ф1 генно-инженерными штаммами У. реи^и со встроенной плазмидой pFSK3 по результатам серологических реакций и при выращивании на плотных питательных средах [1].
Выращивание на твердых питательных средах штаммов-продуцентов нетехнологично, поэтому сравнительная оценка испытуемых штаммов по способности накапливать биомассу и продукции Ф1 была
проведена в условиях бифазного и глубинного культивирования (малообъемного и масштабированного).
Материалы и методы
Биомассу выращивали в бифазной системе на флаконах, в качестве питательной среды использовали агар и бульон Хоттингера, рН 7,2 (10:1). Культивирование проводили в течение 72 ч при температуре 37 °С для штаммов У. реи^и ЕУ и изо-генных производных, 28 °С - для У. реи^и КМ277. Малообъемное культивирование штаммов осуществляли в колбах (250 мл) на бульоне Хоттингера (рН 7,2) с механическим перемешиванием на термо-статируемой качалке RC-TK (США) при температуре 37 и 28 °С для КМ277 в течение 24 ч. При культивировании У. реи^и КМ277 во всех случаях в питательную среду добавляли канамицин. Масштабированное культивирование проводили в производственных условиях на реакторе У-6. Препараты капсульного антигена получали из инактивированной формалином биомассы. Выделение Ф1 из культуральной жидкости проводили методом изоэлектрической преципитации [4, 8] и осаждением сульфатом аммония [2], из клеточной массы - экстракцией и осаждением солевыми растворами [9]. Все полученные препараты Ф1 были лиофилизированы.
Контроль продукции капсульного антигена штаммами-продуцентами, а также активность препаратов на этапах получения осуществляли серологически в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с
эритроцитарным чумным иммуноглобулиновым диа-гностикумом (ФГУ ЦНИИ МО РФ, Киров) и реакции диффузионной преципитации (РД11) по Оухтерлони со специфическими чумными сыворотками коммерческих и экспериментальных серий. В качестве контроля использовали препараты Ф1, полученные из клеток агаровой культуры штамма У. рвъиъ ЕУ.
Результаты и обсуждение
При малообъемном культивировании показано (рис. 1), что изогенные производные штамма У рв8й8 ЕУ превосходят по накоплению биомассы родительский штамм в 2,5-5 раз и по интенсивности выделения Ф1 в среду культивирования в 2-2,3 раза. Преимущество У. pestis КМ227 связано, в основном, с высокой скоростью роста и большим накоплением биомассы, хотя по уровню экскреции в среду Ф1 он значительно уступает родительскому штамму, что согласуется с литературными данными [4]. В то же время штамм У. ре8^8 КМ277 превосходит все испытуемые штаммы по интенсивности экскреции Ф1 и отличается способностью продуцировать Ф1 при температуре 28 °С. Кроме того, у него отсутствуют все собственные плазмиды чумного микроба. Все эти качества позволяют считать данный штамм наиболее перспективным для использования в производстве чумной химической вакцины в качестве продуцента Ф1.
При анализе полученных данных обращает на себя внимание несовпадение высокого уровня секреции Ф1 в среду штаммом У pestis КМ277 с незначительным выходом биомассы с единицы объема питательной среды. По нашему мнению, подобный феномен можно объяснить, опираясь на следующие данные: сверхсинтез продуктов метаболизма идет только в ограниченных условиях питания и, как правило, во вторую фазу роста периодических культур, когда рост биомассы замедляется или даже останавливается, а скорость синтеза антигенов увеличивается.
Все препараты Ф1, полученные из супернатанта
бульонной культуры различными методами, во всех испытанных концентрациях (0,25-20 мг/мл) давали в РДП одну зону преципитации, идентичную зоне преципитации, образуемой препаратами Ф1, полученными по методу Е.Вакег [9] из клеток агаровой культуры У. ре8^8 ЕУ, что указывает на иммунохи-мическую гомогенность изучаемых препаратов Ф1. Для доказательства идентичности препаратов капсульного антигена, выделенных из клеток и супернатанта бульонной культуры штаммов У. ре8^8 ЕВ и У. ре8^8 КМ277, провели их сравнительный анализ в SDS-PAG электрофорезе. Полученные данные показали идентичность белкового профиля препаратов Ф1, выделенных из вакцинного и рекомбинантного штаммов осаждением сульфатом аммония и в изоэлектрической точке (рис. 2). Во всех препаратах регистрировался один мажорный белок с молекулярной массой около 17 кДа.
При использовании бифазной системы культивирования для получения биомассы У. ре8^8 КМ277 и У. ре8^8 ЕУ с последующим выделением препаратов Ф1 из клеток и культуральной жидкости были получены аналогичные результаты. Серологическая активность капсульного антигена у У. ре8^8 КМ277 была выше, чем у У. ре8^8 ЕУ как в самой биомассе, так и в культуральной жидкости и клетках: в РПГА в 100, 10 и 4 раза соответственно. Масса ацетонвысу-шенных клеток штамма КМ277 была на 11,5 % больше, чем ЕУ. Концентрация белка в препарате Ф1 из культуральной жидкости КМ277 в 2,2 раза больше, чем из ЕУ, в препаратах из клеток количество белка было одинаково (32±1 мг/мл). Серологическая активность в системе РПГА-РНАт у препаратов Ф1 из штамма КМ277 была выше в 4 раза (из ацетонвысу-шенных клеток) и в 100-200 раз (из культуральной жидкости) по сравнению с препаратами из штамма ЕУ. Показана электрофоретическая (белковый профиль) и иммунохимическая идентичность препаратов Ф1 из штамма КМ277 и ЕУ.
На основе полученных из бульонной культуры препаратов Ф1 приготовлены экспериментальные
Рис. 1. Накопление биомассы и продукция Ф1 различными штаммами У. резйз в условиях малообъемного культивирования
Рис. 2. Электрофореграмма препаратов Ф1, выделенных из штаммов У. резШ КМ 277 и У. резШ ЕУ:
1-3 - Ф1 У. резИз КМ277; 4-6 - Ф1 У. резИз ЕУ (1, 4 - из клеток;
2, 5 - из культуральной жидкости осаждением сульфатом аммония; 3, 6 - из культуральной жидкости изоэлектрической преципитацией); 7 - маркеры молекулярного веса
серии (по 3 из Ф1 каждого штамма) химической чумной вакцины (ХЧВ), состоящей из Ф1 и ОСА (основного соматического антигена) [3]. В «остром» эксперименте показано, что однократная иммунизация препаратами всех серий ХЧВ обеспечивала выживаемость белых мышей при заражении их вирулентным штаммом У. pestis 231 в дозе 5000 м.к. (Шс1 = 25 м.к.). Причем серии вакцины с Ф1, выделенной из штамма У. pestis КМ277, обеспечивали защиту от заражения чумой с такой же активностью, как и серии ХЧВ с Ф1 из штамма У. ре8^8 ЕУ (ЕД50 (0,23±0,1) и (0,16±0,1) ч/д соответственно). Отмечалось достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных животных ((12±0,5) и (16±0,5) сут для серий ХЧВ с препаратами Ф1 из штаммов 277 и ЕУ соответственно) по сравнению с контрольной группой (3,4±0,2) сут.
Следующим этапом было проведение масштабированного культивирования рекомбинантного и вакцинного штаммов с последующим выделением препаратов Ф1. Накопление биомассы У. pestis ЕУ и У. pestis КМ277 осуществляли в реакторе У-6 с объемом питательной среды 125 л в бульоне из гидролизатов животного белка (рН 7,4) при температуре 37 и 28 °С соответственно. В результате через 28 ч культивирования штамма У. ре8^8 ЕУ получено 100 л биомассы с концентрацией 10 млрд м.к./мл, активность Ф1 составила 1/4 в РДП с чумной агглютинирующей сывороткой, 1/104 в РНГА, количество бактериальной массы - (610±5) г, после лиофилиза-ции - (97±2) г. Тогда как через 22 ч культивирования рекомбинантного штамма У. ре8^8 КМ277 получено 100 л биомассы с концентрацией 35 млрд м.к./мл, активность Ф1 в культуральной жидкости составила 1/128 в РДП, 1/106 в РНГА, количество бактериальной массы (2200±5) г, после лиофилизации - (356±2) г.
Использование этапа концентрирования на уль-трафильтрационной колонке F10HPS с полисуль-фоновыми волокнами для получения препарата Ф1 чумного микроба из культуральной жидкости позволяет без потерь сконцентрировать продукт в 40 раз [5]. Концентрация белка и специфическая активность Ф1 в полученных препаратах капсульного антигена из рекомбинантного штамма значительно выше, чем в препаратах из штамма У. ре8^8 ЕУ (белок (15,2±0,1) мг/мл с >109 АЕ/мг и (2,0±0,1) мг/мл с 1,6-106 АЕ/мг соответственно). Из лиофилизирован-ной клеточной массы также были выделены препараты Ф1. В этом случае содержание белка не зависело от штамма-продуцента - (6,9±0,5) мг на 1 г сухих клеток, но активность была выше в 4-8 раз у препарата из рекомбинантного штамма. Учитывая большой выход клеточной массы в последнем случае, получение антигенного препарата из сухих клеток является целесообразным, т.к. увеличивает общий выход продукта на 30-35 %.
В результате проведенных исследований установлено, что штамм У. ре8^8 КМ277 превосходит штамм У. ре8^8 ЕУ и его производные по способно-
сти синтеза в среду капсульного антигена в условиях глубинного культивирования и может быть использован в качестве продуцента Ф1 для оптимизации производства диагностических и профилактических препаратов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимов А.П., Никифоров А.К., Еремин С.А., Дроздов И.Г. Конструирование штамма Yersinia pestis с повышенной про-тективностью. Бюл. эксп. биол. и мед. 1995; 11:27-31.
2. Вейнблат В.И., Дальвадянц С.Н., ВеренковМ.С. Методы выделения и очистки капсульного антигена и эндотоксина возбудителя чумы. Лаб. дело. 1983; 12:37-9.
3. Дальвадянц С.М., ФилипповА.Ф., БелобородовР.А., Огарев Н.Н. Эффективность сочетанной иммунизации морских свинок против чумы препаратами фракции 1 и основного соматического антигена. Пробл. особо опасных инф. 1977; 3(55):105-12.
4. Дятлов И.А., Филиппов А.Ф., Бондаренко Л.Н. и др. Использование изогенной системы штаммов чумного микроба в технологии получения антигенов. В кн.: Генетика, микробиология и совершенствование методов лабораторной диагностики особо опасных инфекций. Саратов; 1991. С. 71-7.
5. Еремин С.А., Волох О.А., Шепелёв И.А. и др. Разработка новых технологических схем и масштабирование процессов получения антигенов чумного и туляремийного микробов. Пробл. особо опасных инф. 2006; 2(92):58-61
6. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: Медицина; 2009. С. 27-61.
7. Попов Н.В., Куклев Е.В., Кутырев В.В. Тенденции эпизоотической активности природных очагов чумы России и стран СНГ в начале XXI столетия. ЭЛидемиол. и инф. бол. 2006; 2:7-10.
8. Титенко М.М., Вейнблат В.И., Веренков М.С., Васенин А.С. Препаративный метод выделения и очистки капсульного антигена возбудителя чумы при помощи изоэлектрической преципитации. В кн.: Диагностика и профилактика особо опасных инфекций. Саратов; 1983. С. 34-9.
9. BakerE.E., SommerH., FosterL.E. et al. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurellapestis. J. Immunol. 1952; 68(2):131-45.
10. Li B.D., Zhou Z., Wang Z. et al. Antibody profiling in plague patients by protein microarray. Microbes Infect. 2008; 10:45-51.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Anisimov A.P., Nikiforov A.K., Eremin S.A., Drozdov I.G. [Constructing of the Yersinia pestis strain with heightened (enhanced) protective capacity]. Byul. Eksp. Biolog. Med. 1995; 11:27-31.
2. Veynblat V.I., Dal'vadyants S.N., VerenkovM.C. [Methods of isolation and purification of plague-agent capsular antigen and intracellular toxin]. Lab. Delo. 1983; 12:37-9.
3. Dal'vadyants S.N., Filippov A.F, Beloborodov R.A., Ogarev N.N. [Effectiveness of the complex Guiney-pig immunization by anti-plague F1 and basic O-antigen preparations]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 1977; 55:105-12.
4. Dyatlov I.A., Filippov A.F., Bondarenko L.N. et al. [Application ofthe isogenic system of plague-agent strains in the process of antigen obtainment]. In: [Genetics, Microbiology, and Development of Methods of Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infections]. Saratov; 1991. P. 71-7.
5. Eremin S.A., Volokh O.A., Shepelev I.A. et al. [Developing ofthe new technological schemes, and scaling of the processes of plague and tularemia antigens’ obtainment ]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2006; 92:58-61.
6. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases. Guidelines]. M.: Meditsina; 2009. P. 27-61.
7. PopovN.V., KuklevE.V., Kutyrev V.V [Tendencies of epizootic activity of plague natural foci in the Russian Federation and CIS countries in early XXI century]. Epidem. Infek. Bol. 2006; 2:7-10.
8. TitenkoM.M., Veynblat VI., VerenkovM.C., VaseninA.S. [Preparation method of isolation and purification of plague-agent capsular antigen by means of isoelectric precipitation]. In: [Diagnostics and Prophylaxis of Particularly Dangerous Infections]. Saratov; 1983. P. 34-9.
Authors:
Nikiforov A.K., Volokh O.A., Eremin S.A., Alenkina T.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Никифоров А.К., Волох О.А., Еремин С.А., Алёнкина Т.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 13.03.10.
