Применение 2D-электрофореза для получения белкового спектра фракций экзопротеинов возбудителей чумы и холеры

Полунина Т.А.; Заднова С.П.; Краснов Я.М.

Пробл. особо опасных инф. 2017; 2:40-44. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-40-44

УДК 616.98:579.842.23+616.932

Т.А.Полунина, с.П.Заднова, Я.м.краснов

применение 2D-ЭЛEКTP0Ф0PEЗA для получения белкового спектра фракций экзопротеинов возбудителей чумы и холеры

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,

Российская Федерация

цель работы. Применение 2D-электрофореза для получения белкового спектра фракций экзопротеинов, а также идентификации и сравнения активности экспрессии биомаркеров основных факторов патогенности возбудителей чумы и холеры. материалы и методы. 2D-гели фракций экзопротеинов получали на модели штаммов V. chо1егае Inaba 569В, V. сЫ1егае El Tor M888 Ctx+ и Ctx-, а также Y. pestis EV НИИЭГ. В качестве биомаркеров основных экзопротеинов возбудителей чумы и холеры использовали капсульный антиген F1 и холерный токсин. результаты и выводы. При исследовании холерного токсина 2D-электрофорезом на IPG стрипах с градиентом рН 3-10 антиген разделялся на ряд белковых пятен, два из которых близки к параметрам домена A1 (MW 20,309 кДа и pI 6,51) и мономера субъединицы В (MW 11,091 кДа и pI 7,68). При сравнении белкового спектра фракций экзопротеинов штаммов V. chо1егае Inaba 569В, V. сЫ1егае El Tor M888 Ctx+ и Ctx- обнаружены пятна с аналогичными параметрами, за исключением штамма V. chо1егае M888 Ctx . При анализе 2D-гелей образцов капсульного антигена и фракций экзопротеинов штамма Y. pestis EV было отмечено, что белковые пятна, соответствующие параметрам субъединичной формы и димеру антигена, присутствуют в образце 37 °С культуры. В образце 28 °с культуры присутствует субъединица F1 в значительно меньшей концентрации. на модели токси-генного штамма V. chо1егае Inaba 569В, изогенной системы штаммов V. chо1егае El Tor M888 Ctx+ и Ctx , штамма Y pestis EV НИИЭГ показана высокая эффективность 2D-электрофореза для получения белкового спектра фракций экзопротеинов этих культур, а также идентификации и сравнения экспрессии биомаркеров основных экзопротеинов возбудителей чумы и холеры.

Ключевые слова: 2D-электрофорез, экзопротеины, Vibrio с^1егае, Yersinia pestis.

Корреспондирующий автор: Полунина Татьяна Алексеевна, e-mail: [email protected].

T.A.Polunina, S.P.Zadnova, Ya.M.Krasnov

2D-Electrophoresis in Protein Spectrum Construction for Exoprotein Fractions of Plague and Cholera Agents

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation

Objective of the study is to apply 2D-electrophoresis for imaging protein spectrum of exoprotein fractions, as well as identification and comparison of biomarker expression of the key pathogenicity factors in plague and cholera agents. Materials and methods. 2D gels of exoprotein fractions were obtained on the model of Vibrio cholerae Inaba 569B, V. cholerae El Tor M888Ctx+ and Ctx-strains, and also Y. pestis EV NIIEG strain. Capsular antigen F1 and cholera toxin were used as biomarkers of major exoproteins of plague and cholera agents. Results and conclusions. While studying cholera toxin through 2D-electrophoresis on IPG strips with pH 3-10 gradient, the antigen fell into a number of protein spots, two of which were close to A1 domain parameters (MW 20.309 kDa and pI 6.51) and B-subunit monomer (MW 11.091 kDa and pI 7.68). Comparative protein spectrum analysis of the exoprotein fractions of V. cholerae Inaba 569B, V. cholerae El Tor M888 Ctx+ and Ctx- has revealed the spots with similar parameters, excluding the strain V. cholerae M888 Ctx-. Investigation of 2D gels of capsular antigen and exoprotein fractions of Y. pestis EV strain has demonstrated that protein spots corresponding to the parameters of the subunit form and diameter of the antigen are present in 37 °C culture patterns. 28 °C culture sample contains F1 subunit in a far lesser concentrations. On the model of toxigenic V. cholerae Inaba 569B strain, isogenic system of V. cholerae El Tor M888 Ctx+ and Ctx- strains, and Y. pestis EV NIIEG strain, high efficiency of 2D-electrophoresis in protein spectrum construction for exoprotein fractions of the cultures, as well as identification and comparison of biomarker expression of major exoproteins of plague and cholera agents is established.

Key words: 2D-electrophoresis, exoproteins, Vibrio cholerae, Yersinia pestis.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Tatiana A. Polunina, e-mail: [email protected].

Citation: Polunina T.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M. 2D-Electrophoresis in Protein Spectrum Construction for Exoprotein Fractions of Plague and Cholera Agents. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 2:40-44. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-40-44

Экзопротеины бактериальных культур, секре-тируемые во внешнюю среду, играют важную роль в жизнедеятельности таких патогенов как Vibrio cholerae и Yersinia pestis, т.к. участвуют в построении капсулы, выполняют защитную функцию, а также взаимодействуют с макроорганизмами.

Эпидемические штаммы V. cholerae продуци-

руют во внешнюю среду значительное количество экзопротеинов, относящихся к факторам патогенности, которые способствуют колонизации возбудителя в тонком кишечнике, развитию острого воспалительного процесса и диареи. Способность заселять тонкий кишечник обусловлена продукцией холерным вибрионом адгезивных молекул,

включающих токсинкорегулируемые пили, а также маннозофукорезистентные и маннозочувствитель-ные гемагглютинины-адгезины. После адгезии начинается интенсивная продукция холерного токсина (СТ) - одного из ключевых факторов патогенно-сти. СТ состоит из субъединицы А, отвечающей за токсическую активность всей молекулы, и В субъединиц, которые обеспечивают связывание токсина с клеточными рецепторами энтероцитов (ганглио-зидами Gm1), а также несут антигенные детерминанты. Цитопатогенный эффект СТ усиливается продукцией эндотоксина и действием различных ферментов [3].

Циркуляция У. pestis в природных очагах обеспечивается целым рядом факторов патогенности, одним из которых является способность возбудителя при температуре 37 °С формировать капсулу, образованную капсульным антигеном F1. На продукцию F1 влияет не только температура, но также рН и состав питательной среды. При температуре 37 °С толщина капсульной оболочки может в несколько раз превосходить толщину самой бактериальной клетки, однако использование высокочувствительных методов позволило также обнаружить капсулу на поверхности клеток чумного микроба, выращенных при 28 °С [1]. Использование сканирующей электронной микроскопии [17] показало, что капсула представляет собой аморфное вещество ячеистой структуры или внеклеточный фибриллярный матрикс, непрочно связанный с микробной клеткой. Отмечено, что 30-50 % синтезируемого антигена легко переходит в среду культивирования [8]. Это позволило выделять капсульный антиген также из культуральной жидкости, увеличив выход и качество конечного продукта по сравнению с классической методикой получения F1 из ацетонвысу-шенных клеток по Е.Е.Вакег et а1. [9], и получать препарат, лишенный компонентов клеточной стенки и протоплазмы, с молекулярным весом (MW) до 2,0 МДа и субъединицей 13,5-17,7 кДа и изоточкой р1 4,3-4,8 [2, 6, 8, 12].

высокая вариабельность геномов возбудителей чумы и холеры, возможность существования в различных экосистемах определяет необходимость поиска и совершенствования методов выявления изменений компонентного состава белков в результате фенотипической адаптации патогенов к условиям окружающей среды.

2D-электрофорез, обеспечивая одновременно первичный анализ и максимальное разделение денатурированных белков образца по заряду и молекулярной массе, является одним из базовых методов пробоподготовки в интенсивно развивающихся направлениях протеомного анализа, позволяющего выявлять, идентифицировать и регистрировать уровень экспрессии белков. в связи с этим, актуальным является использование метода для изучения белкового спектра фракций экзопротеинов бактериальных культур, в том числе штаммов возбудителей особо

опасных инфекций.

Целью работы является применение 2D^eKrpo-фореза для получения белкового спектра фракций экзопротеинов, а также идентификации и сравнения активности экспрессии биомаркеров основных факторов патогенности возбудителей чумы и холеры.

Материалы и методы

2D-гели фракций экзопротеинов получали на модели токсигенного штамма V. cholerae Inaba 569В, изогенной системы штаммов V. cholerae El Tor M888 Ctx+ и Ctx-, а также штамма Y. pestis EV НИИЭГ, полученных из государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов).

Культуру клеток штамма Y. pestis EV НИИЭГ выращивали в бульоне LB (pH 7,2-7,4) при 28 и 37 °С в течение 48 ч. Культуру клеток штамма V. cholerae Inaba 569В выращивали в бульоне LB (pH 7,2-7,4) при 30 °C с аэрацией в течение 18 ч. Культуры клеток штаммов V. cholerae El Tor M888 Ctx+ и Ctx- выращивали согласно описанной методике [13].

Из бульонной культуры бактериальные клетки удаляли центрифугированием при 8000 об./мин в течение 20 мин при 4 °С (центрифуга Awel MF 20-R). Фракцию экзопротеинов осаждали из культуральной жидкости добавлением 50 % трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 10 % и инкубацией на льду в течение 30 мин. Осадок дважды промывали холодным ацетоном и подсушивали на воздухе. Осадок растворяли в 10 мл холодного 10 тМ Трис-HCl буфера (рН 8-5), затем процедуру осаждения повторяли. Агрегированные белки подсушивали на воздухе и растворяли в буфере для SDS или 2D-электрофореза.

В качестве биомаркеров основных экзопро-теинов возбудителей чумы и холеры использовали лиофилизированные препараты капсульного антигена F1 (любезно предоставленного д.б.н. Т.М.Та-раненко) [6] и холерного токсина (MW ~85,000 кДа, pI 6,6, «Sigma»).

Концентрацию белка в пробах измеряли по методу М.М.Бредфорда на сканирующем спектрофотометре Biowave II (Biochrom, UK) при длине волны 595 нм [11].

SDS-PAGE электрофорез проводили классическим методом W.K.Lаemmli [15], 2D-электрофорез по методике, описанной ранее [5].

2D-гели анализировали с помощью программного обеспечения (ПО) Dymension мультифункцио-нальной системы гель-документирования Syngene (G:BOX Chemi XT4, UK). При сравнении 2D-гелей путем наложения их изображений контуры совпадающих пятен обозначены синим цветом, а несовпадающих - голубым. Результаты компьютерного анализа содержат информацию об общем количестве выявленных и совпадающих пятен образцов, их порядковый номер, а также характеристику каждого пятна по интенсивности, MW и pI.

Результаты и обсуждение

В настоящее время известно, что CT представляет собою олигомерный белок (MW 82,00085,620 кДа и pI 6,6-7,0), состоящий из двух субъединиц. Субъединица A, обладающая токсичностью и каталитической активностью (MW 27,215-30,000 кДа; pI 6,1), имеет два домена A1 (MW 21,817-24,000 кДа) и A2 (MW 5,398-5,700 кДа), соединенных дисуль-фидной связью. В-субъединица, несущая рецептор-ную функцию (MW 53,000-58,387 кДа; pI 7,8), представляет собой нековалентно ассоциированный комплекс из пяти мономеров с MW 10,500-14,000 кДа каждая [10, 14, 16, 18].

Под действием таких денатурирующих агентов, как мочевина, 2-меркаптоэтанол, детергенты SDS и CHAPS, холерный токсин подвергался различной степени диссоциации в зависимости от времени инкубации и температуры. Так, предварительная экспозиция в регидратационном буфере (8 M Urea, 2 % CHAPS, 50 mM DTT, 0,2 % Ampholytes рН 3-10, 0,001 % Bromphenol blue) в течение 2 ч и анализ SDS-PAGE электрофорезом без кипячения позволили обнаружить полосы с MW 28,000 и 55,000 кДа, соответствующие субъединицам А и В. Только после кипячения в течение 3 мин в нативном буфере без SDS, а также в буфере для образцов с SDS (31,5 mM Tris-HCI, pH 6,8, 10 % glycerol, 1 % SDS, 0,005 % Bromophenol Blue) антиген максимально диссоциировал до домена A1 и мономера В1, образуя две полосы с MW 21,000 и 11,000 кДа соответственно.

Капсульный антиген F1, выделенный из цен-трифугата бульонной культуры штамма Y pestis EV НИИЭГ методом одноэтапной гель-хроматографии на биогеле A-50m, представляет собой монокомпонентную белковую систему без полисахаридных примесей [2, 6].

В отличие от CT, применение только денатурирующих агентов (мочевины, 2-меркаптоэтанола, детергентов SDS и CHAPS) не приводило к изменению нативной конформации белковой макромолекулы капсульного антигена. Прогревание образца F1 при 100 °С в течение 3 мин вызывало диссоциацию антигена до отдельных белковых субъединиц с MW ~17,000 кДа, его охлаждение до комнатной температуры уже через 1 ч позволило зарегистрировать процесс реассоциации субъединиц с образованием

олигомеров с различной MW. Процедура термообработки в течение 3 мин в буфере для образцов с SDS приводила к необратимой диссоциации до субъединиц. эффекта торможения реассоциации на стадии субъединицы удалось также достигнуть при добавлении к образцам F1 сразу после кипячения раствора SDS до конечной концентрации 0,5 %. это объясняется способностью SDS связываться с солюбили-зированными белками, что приводит к увеличению их отрицательного заряда и вызывает отталкивание друг от друга, блокируя процесс агрегации [4, 7].

Таким образом, наибольшей силой денатурирующего воздействия на нативную структуру белковых макромолекул CT и F1 обладает процедура термообработки при 100 °С не менее 3 мин, приводящая к полному распаду антигенов до составляющих субъединиц. структурной особенностью капсульного антигена является способность субъединиц спонтанно агрегировать при восстановлении физиологических условий с образованием набора олигомеров. Ранее замечено, что при тепловом разворачивании белковой полимерной структуры F1 происходит формирование термодинамически устойчивых тетрамеров, которые при охлаждении распадаются до субъединиц, способных к последующей реассоциации с сохранением серологической активности. это позволило предположить, что полимерная структура F1 имеет специфический механизм приспособления к изменениям окружающей среды. Возможно, здесь имеет место эволюционно обусловленный способ сохранения функционально активных структурных единиц, несущих информацию о макромолекуле антигена [19].

При исследовании CT 2D-электрофорезом на IPG-стрипах с градиентом рН 3-10 антиген разделялся на ряд белковых пятен, два из которых близки, по литературным данным, к параметрам домена А1 (MW 20,309 кДа и pI 6,51) и мономера субъединицы В (MW 11,091 кДа и pI 7,68). При сравнении белкового спектра фракций экзопротеинов токсигенного штамма V. cholerae Inaba 569В и изогенной системы штаммов V. cholerae El Tor M888 Ctx+ и Ctx- обнаружены пятна с аналогичными параметрами, за исключением штамма V. cholerae El Tor M888 Ctx- (рис. 1, 2).

При анализе 2D-гелей фракций экзопротеинов штаммов V. cholerae Inaba 569В, V. cholerae El Tor M888 Ctx+ и Ctx- было выявлено в среднем 334, 597

Рис. 1. «Белковые портреты» фракции экзопротеинов изогенной системы штаммов V. cholerae El Tor M888 Ctx+ и Ctx- на стри-пах длиной 17 см с градиентом pH 3-10

ffl UP t 'il as>- af-r « ï®3

CÖgto f i* D ОС? о 9 о О 'i о о » S ,!.0 Ss'i3 M -¡¿m § " 14% oO ù t. та.4 ол

Compl CT ...HS»

Match Spot Ho. » MW,,,, =„„„„. .1 M»,.„ » MW„,

1- 7,68 20309- ils- — 7,68 20216- Î24- -61 ,926 - -

Рис. 2. «Белковые портреты» фракции экзопротеинов токсигенного штамма V. cholerae 1паЬа 569В и штамма V. Ло1е-rae Е1 Тог М888 С1х+ на стрипах длиной 17 см с градиентом рН 3-10

и 466 белковых пятен соответственно. Сравнение электрофореграмм штамма V. choleraе El Tor M888 Ctx+ и Ctx- показало 260 совпадающих пятен, среди которых повышение интенсивности окрашивания в 2 и более раза отмечалось у 52 белковых пятен токсигенного и 64 атоксигенного штамма.

Исследование капсульного антигена чумного микроба 2D-электрофорезом в диапазоне рН 3-10 показало, что под влиянием денатурирующих условий происходит диссоциация агрегированной формы F1 с образованием субъединичной формы антигена и набора олигомеров с различными молекулярными массами. Отмечено, что при фракционировании капсульного антигена имеется ряд белковых пятен с pI 4,06-4,45 и MW 16,500-17,200 и 34,10034,400 кДа, что соответствует, по литературным данным, субъединице и димеру антигена. Для достижения наибольшего разрешения белковых пятен в зоне фракционирования F1 мы провели исследование также на стрипах с диапазоном рН 4-7. При анализе электрофореграмм образцов капсульного антигена и фракций экзопротеинов штамма Y. pestis EV НИИЭГ отмечено, что белковые пятна, соответствующие параметрам субъединичной формы и димеру антигена, присутствуют в образце 37 °С культуры. Во фракции экзопротеинов штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного при 28 °с, присутствует субъединица F1 в значительно меньшей концентрации (рис. 3).

При анализе 2D-гелей фракций экзопротеинов штамма Y. pestis EV НИИэГ, выращенного при 28 и 37 °С, на стрипах с градиентом рН 4-7 было детектировано соответственно 323 и 578 белковых пятен. Среди 254 совпадающих пятен повышение интенсивности окрашивания в 2 и более раза отмечалось у 116 в образце 28 °С культуры и 16 в образце штам-

ма, выращенного при 37 °С. Кроме того, в образце 37 °С культуры отмечено повышение интенсивности окрашивания в 3,8 раз белкового пятна с параметрами субъединичной формы F1, что коррелирует с увеличением биосинтеза капсульного антигена при данной температуре.

Таким образом, компьютерный анализ с помощью ПО Dymension системы гель-документирования Syngene полученных 2D-гелей образцов антигенов ХТ и капсульного антигена F1, фракций экзопротеинов токсигенного штамма V. choleraе Inaba 569В, изогенной системы штаммов V. choleraе El Tor M888 Ctx+ и Ctx-, а также штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного в различных условиях, дает возможность получения белкового спектра этих культур, идентификацию и сравнение экспрессии биомаркеров основных экзопротеинов возбудителей чумы и холеры.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Авторы выражают благодарность лаборанту-исследователю Котовой Н.В. за практическую помощь при выполнении работы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кадникова Л.А., Копылов П.Х., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Капсульный антиген чумного микроба. Инфекция и иммунитет. 2015; 5(3):201-18. DOI: 10.15789/2220-7619-20153-201-218.

2. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Кравцов А.Л., Гусева Н.П., Полунина Т.А., Подборонова Н.А., Клюева С.И., Шмелькова Т.П. Структурно-функциональные свойства препаратов капсульного антигена Ф1 в процессе хранения. Биотехнология. 2005; 5:41-3.

3. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология холеры. Саратов; 1995. 69 с.

4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеи-

®|»r 1« иВШ « лт 'ч 4FW e m Y « Я0

я» Ä» *?>• J * Г/* **D & а öS' а © &F1 _ _ SF1

Рис. 3. «Белковые портреты» фракции экзопротеинов штамма У. pestis ЕУ НИИЭГ, выращенного при 28 и 37 °С, на стрипах длиной 17 см с градиентом рН 4-7

новых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука; 1981. 288 с.

5. Полунина Т. А., Варшавская Ю.С., Заднова С.П., Краснов Я.М. Применение 2D-электрофореза для получения «белковых портретов» лизатов бактериальных культур возбудителей особо опасных инфекций. Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:97-101. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-1-97-101.

6. Сердобинцев Л.Н., Тараненко Т.М., Веренков М.С., Наумов А.В. Получение капсульного антигена методом одно-этапной гелевой фильтрации. В кн.: Вопросы профилактики природно-очаговых инфекций.

7. Шуколюков С.А. Нативный электрофорез в протеомике клетки: BN- и CN-PAGE. Цитология. 2011; 53(2j:159-65.

8. Andrews G.P., Heath D.G., Anderson G.W., Welkos S.L., Friedlander A.M. Fraction 1 capsular antigen (F1) purification from Yersinia pestis CO92 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge. Infect. Immun. 1996; 64(6):2180-7.

9. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E., Meyer E., Meyer K.F. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of the Pasteurella pestis. J. Immunol. 1952; 68(2):131-45.

10. Bharati K., Ganguly N.K. Cholera toxin: a paradigm of a multifunctional protein. Indian J. Med. Res. 2011; 133:179-87.

11. Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54.

12. Chromy B.A., Choi M.W., Murphy G.A., Gonzales A.D., Corzett C.H., Chang B.C., Fitch J.P., McCutchen-Maloney S.L. Proteomic characterization of Yersinia pestis virulence. J. Bacteriol. 2005; 187(23):8172-80. DOI: 10.1128/JB.187.23.8172-8180.2005.

13. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986; 30:1075-83.

14. Gill D.M. The arrangement of subunits in cholera toxin. Biochemistry. 1976; 15:1242-8.

15. Laemmli W.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:80-5.

16. Mekalanos J.J. Production and purification of cholera toxin. Methods Enzymol. 1988; 165:169-75.

17. Runco L.M., Myrczek S., Bliska J.B., Thanassi D.G. Biogenesis of the F1 capsule and analysis of the ultrastructure of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 2008; 190(9):3381-5. DOI: 10.1128/ JB.01840-07.

18. Spanglert B.D. Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol. Rev. 1992; 56(4):622-47.

19. Vorontsov E.D., Dubichev A.G., Serdobintsev L.N., Naumov A.V. Association-dissociation processes and supermolecu-lar organization of the capsule antigen (protein F1) of Yersinia pestis. Biomed. Sci. 1990; 1(4):391-6.

References

1. Kadnikova L.A., Kopylov P.Kh., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. [Capsular antigen of plague microbe]. Infektsiya i Immunitet. 2015; 5(3):201-18. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2015-3-201-218.

2. Kireev M.N., Taranenko T.M., Khramchenkova T.A., Kravtsov A.L., Guseva N.P., Polunina T.A., Podboronova N.A., Klyueva S.I., Shmel'kova

T.P. [Structural-functional properties of capsular antigen F1 preparations during the storage process]. Biotekhnologiya. 2005; 5:41-3.

3. Naumov A.V., Ledvanov M.Yu., Drozdov I.G. [Cholera Immunology]. Saratov; 1995. 69 p.

4. Osterman L.A. [Methods of Investigation of Proteins and Nucleic Acids: Electrophoresis and Ultracentrifugation (Practice Guidelines)]. M.: "Nauka"; 1981. 288 p.

5. Polunina T.A., Varshavskaya Yu.S., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M. [Application of 2D- electrophoresis for the construction of '"protein profiles" of bacterial cultures lysates of particularly dangerous infections agents]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2016; 1:97-101. DOI: 10.21055/0370-10692016-1-97-101.

6. Serdobintsev L.N., Taranenko, T.M., Verenkov M.S., Naumov A.V. [Production of capsular antigen using single-stage gel filtration]. In: [Problems of Prophylaxis of Natural-Focal Infections]. Saratov; 1983. P. 37-41.

7. Shukolyukov S.A. [Native electrophoresis in cell proteomics: BN-and SN-PAGE]. Tsitologiya. 2011; 53(2):159-65.