CC BY
106
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.843.1:616-097:57.089.33
Евдокимова В.В., АлексееваЛ.П., Кретенчук О.Ф., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Бурша О.С.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМ ПОВЕРХНОСТНЫМ АНТИГЕНАМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1- И О139-СЕРОГРУППЫ
ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 344002,
г. Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40
Получена панель из 9 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), направленные к поверхностным терморезистентным антигенным детерминантам холерных вибрионов Эль-Тор и О139. Установлено методом имму-ноблоттинга, что большая часть из полученных МКА взаимодействует с соответствующими им эпитопами белковой природы на уровне 38-42 кДа. Выявлены различия в специфической направленности МКА к холерным вибрионам: 1-я группа МКА выявляет антигенные детерминанты, представленные только у штаммов V. cholerae О1, О139 с генетической характеристикой ctx+ tcp+ и ctx tcp+, и не выявляет штаммы ctx- tcp-; 2-я группа МКА выявляет общие эпитопы для холерных вибрионов Эль-Тор и О139 независимо от наличия генов ctx и tcp. Новая панель МКА может быть применена для изучения тонкой антигенной структуры холерных вибрионов Эль-Тор и О139 и детекции в имму-ноферментных методах эпидемически опасных штаммов с генотипом ctx+ tcp+.
Ключевые слова: холерный вибрион; гибридизация; моноклональные антитела; антигенная детерминанта; твердофазный иммуноферментный анализ; дот-иммуноанализ; иммуноблоттинг; белки наружных мембран.
Для цитирования: Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 20 (3): 51-57.
Evdokimova V. V, Alekseeva L. P., Kretenchuk O. F., Kruglikov V. D., Arkhangelskaya I. V., Bursha O.S.
MONOCLONAL ANTIBODIES TO THERMOSTABLE SURFACE ANTIGENS OF VIBRIO CHOLERAE Ol AND 0139
SEROGROUPS
Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision, 117/40, Maksima
Gorkogo Str, Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002
There is delivered the panel of 9 hybridomas producing monoclonal antibodies directed to surface thermo-resistant antigenic determinants of V. cholerae El Tor and O139. By immunoblotting method most of MCA were established to react with the corresponding epitopes of protein nature at the level of38-42 kDa. There were revealed differences in the specific orientation of the MCA to Vibrio cholerae: the first group of MCA identifies antigenic determinants presented only in strains of V. cholerae O1, O139 with genetic characteristic ctx+ tcp+ and ctx- tcp+, but fails to identify strains ctx- tcp-; the second group of MCA identifies common epitopes for V. cholerae El Tor and O139 regardless of ctx and tcp genes. The new panel of MCA can be used as well for the study of the fine antigenic structure of V. cholerae El Tor and O139 as detection of epidemically dangerous strains genotype ctx+ tcp+ with ELISA methods
Key words: Vibrio cholerae; hybridization; monoclonal antibodies; antigenic determinant; enzyme linked immunosorbent assay; dot-immunoassay; immunoblotting; outer membrane proteins.
Citation: Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. 2015; 20(3): 51-57. (In Russ.)
Достоверная иммунодиагностика возбудителей особо опасных инфекций может быть осуществлена только с применением высокоспецифичных антител. На сегодняшний день признано, что эффективной основой для производства высокоактивных иммуно-диагностических препаратов являются моноклональные антитела (МКА). Гибридомная биотехнология позволяет получать высокоаффинные антитела уникальной специфичности к отдельным антигенным детерминантам (в отличие от поликлональных сывороток) диагностически значимых антигенов возбудителя холеры. Зарубежными учеными в конце прошлого столетия проводились работы по получению МКА к поверхностным антигенам Vibrio cholerae О1 и О139 (ЛПС, белки внешних мембран, пили адгезии), а также холерному токсину, с последующим конструированием на их основе высокоэффективных тест-систем: для слайд-агглютинации [1], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [2], дот-блот-ИФА (им-муноферментный анализ) [3], флуоресцирующие им-
Для корреспонденции: Евдокимова Вероника Вячеславовна, [email protected]
муноглобулины [4]. В последние годы исследователи сосредоточили внимание на создании тест-систем в формате иммуносенсоров (биомикрочипов), имму-нохроматографических полосок (ИХ-стрипов, "дип-стиков") и дот-ИФА-тестов, поскольку время их постановки находится в пределах от 5-15 мин до 1,2 ч, что особенно актуально при исследовании большого количества проб в эндемичных по холере районах. Так, Chen W. и соавт. [5] разработали для ускоренной диагностики холерных вибрионов серовара Огава им-мунохроматографический тест, основанный на паре МКА, одно из которых специфически взаимодействует с эпитопами ЛПС штаммов Огава, т. е. тест-система позволяет дифференцировать серовары V. cholerae О1. J. Jyoung и соавт. сконструировали иммуносенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса, используя МКА к V. cholerae О1 с чувствительностью 1 • 105—1 • 109 м.кл/мл [6]. Группа тайландских исследователей создала панель МКА для обнаружения и дифференциации V. cholerae О1, О139 и О141 методом дот-блоттинга [7]. Этими же авторами разработан для прямой детекции V. cholerae О139 в образцах морепродуктов высокочувствительный (104 КОЕ мл-1) иммунохроматографический стрип-тест на основе
двух МКА [8]. При совместной работе таиландских и японских ученых сконструирован 5-минутный имму-нохроматографический тест на основе МКА к липопо-лисахариду V. cholerae О139 с чувствительностью 106 КОЕ/мл, который исключает перекрестные реакции с холерными вибрионами О1, не О1/не О139 [9].
В нашей стране также проводятся работы по получению МКА к холерным вибрионам и экспериментальные разработки иммунологических тест-систем: коагглютинационный и иммунофлуоресцентный диагностикум для выявления V. cholerae О1 [10], дот-иммуноанализ для экспресс-диагностики токси-генных штаммов V. cholerae [11], иммунофермент-ная тест-система для детекции возбудителя холеры О139 [12], ТИФА и дот-ИФА для контроля биосинтеза О-антигена V cholerae О1 при производстве бивалентной химической вакцины [13], иммунофермент-ный анализ двойных антител (ИФА-2АТ) для оценки токсинопродукции штаммов холерных вибрионов О1 и О139 [14]. Зарегистрированными на сегодняшний день являются два набора диагностических препаратов на основе МКА (свидетельство о государственной регистрации № РЗН 2014/2142 от 16.12.14, № РЗН 2015/2336 от 26.01.15) для ускоренной диагностики V cholerae О1 и О139 в реакциях иммунофлуоресцен-ции и слайд-агглютинации. На современном этапе, учитывая актуальные направления в диагностике особо опасных инфекций, во ФГУН ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) для обнаружения холерных вибрионов О1 разработаны иммунохроматографические тест-системы на основе МКА, полученных в Ростовском противочумном институте [15]. Также Е.В. Баранова и соавт. [16] сконструировали, используя МКА к холерному токсину, диагностикум «Тест-полоска V cholerae tox+». Следует отметить, что ИХ-тесты наряду с их преимуществами (получение результата в пределах 15 мин, простота постановки) не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108-109 м.кл/мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. В связи с этим актуальным является разработка препаратов на основе высокоспецифичных МКА, направленных к диагностически значимым антигенам холерных вибрионов, для постановки ИФА и дот-иммуноанализа, которые позволяют выявлять и дифференцировать V cholerae О1 и О139 при концентрации их в пробе 105-106 м.кл/мл. Нами разработаны и сконструированы экспериментальные серии пероксидазных конъюгатов на основе видоспецифиче-ских МКА, направленных к эпитопам О-полисахарида холерных вибрионов О1-серогруппы (ПХ-МКА О1) и соответственно серогруппы О139 (ПХ-МКА О139). Моноклональные конъюгаты в ТИФА и дот-ИФА имеют чувствительность порядка 105—106 м.кл/мл, и строгую специфичность в отношении штаммов V. cholerae 01, 0139 при отсутствии перекрестных реакций с представителями близкородственных и гетерологич-ных микроорганизмов [17]. Однако практический интерес представляют не только видоспецифические, но и серовароспецифические пероксидазные конъюгаты для дифференциации холерных вибрионов О1 Огава и Инаба в прямых вариантах дот-ИФА и ТИФА. Ви-до- и серовароспецифические детерминанты входят в состав термостабильного О-антигена, локализованного на поверхности холерных вибрионов О1. Поэтому цель данной работы - получение набора МКА к поверхностным антигенным детерминантам холерных вибрионов и оценка возможности их применения в научных ис-
следованиях и для разработки диагностических препаратов.
Материалы и методы
Штаммы микроорганизмов. В работе были использованы 24 штамма V. cholerae О1: 8 - V cholerae El Tor ctx+ tcp+, 8 - V cholerae El Tor ctx- tcp+, 8 - V cholerae El Tor ctx- tcp-; 11 штаммов V. cholerae 0139: 5 - V cholerae 0139 ctx+ tcp+, 6 - V. cholerae 0139 ctx- tcp; 10 штаммов V cholerae не 01/не 0139; 3 - E. coli, 2 - Salmonella spp., 4 - Aeromonas. Взвеси холерных вибрионов и гетеро-логичных микроорганизмов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича 10 ед. (ОСО 42-28-85П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1 • 109 м.кл/мл; клетки обеззараживали кипячением в течение 30 мин.
Лабораторные животные. Для получения пери-тонеальных макрофагов, иммунных спленоцитов использовали инбредных самок мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16-20 г в возрасте 8-10 нед. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/EU. Умерщвление животных проводили с помощью ингаляционного наркоза хлороформом.
Иммуноген. Для иммунизации мышей Balb/c, служащих донорами иммунных спленоцитов, использовали цельные клетки токсигенного штамма V. cholerae El Tor 13020 (Инаба), обеззараженные кипячением в течение 30 мин. Иммунизацию проводили троекратно с интервалом в 14 дней. Бустерную инъекцию вводили за 3 дня до слияния.
Получение гибридом. Получение гибридных клеток в соответствии с методикой Fazekas de St. и соавт. [18] проводили с помощью сливающего агента полиэтилен-гликоля 1500 (Fluka, Sigma-aldrich, США). Использовали мышиную миеломную линию P3-X63/Ag8.653, полученную из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Тестирование антителопродуцирующих гибридом проводили в непрямом ТИФА [19] с использованием цельных микробных клеток штамма V. cholerae 13020, убитых кипячением. Мышиные иммуноглобулины выявляли пероксидазным конъюгатом BioRad (США). Результаты ТИФА учитывали с использованием спектрофотометра BioTek (США) по оптической плотности (0П) при длине волны 450 нм (референс-волна 630 нм), считая позитивными лунки с образцами, интенсивность сигнала которых в 2 раза превышала ОП контрольных образцов. Из лунок, в которых регистрировали достоверно положительную реакцию, отбирали гибридомные клетки и клонировали их трижды методом предельных разведений [20] в HT-среде (среда DMEM Gibco с 20% эмбриональной телячьей сыворотки HyClone). Для кри-оконсервирования гибридом применяли среду, содержащую 90% эмбриональной телячьей сыворотки Hyclone (Thermo scientific, Англия) и 10% диметилсульфоксида (Panreac).
Очистка специфических иммуноглобулинов. Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей гибридом осуществляли преципитацией сульфатом аммония [21]. Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 0,01%. После проверки титра антител препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре -20oC.
Взаимодействие в ИФА моноклональных антител с холерными вибрионами El Tor и О139
Штамм V. cholerae (обеззараженный кипячением) МКА (положительная реакция в ИФА)
H2F6 A5D8 E5F5 G3F5 B3A5 A5B6 D6 F11H2 4F5
V cholerae El Tor ctx+ tcp+ 8/8* 8/8 8/7 8/7 8/8 8/8 8/8 8/7 8/8
V cholerae El Tor ctx" tcp+ 8/8 8/8 8/7 8/7 8/8 8/8 8/8 8/7 8/8
V cholerae El Tor ctx- tcp- 8/0 8/8 8/0 8/0 8/8 8/0 8/8 8/0 8/8
V cholerae О139 ctx+ tcp+ 5/5 5/5 5/4 5/4 5/5 5/5 5/5 5/4 5/5
V cholerae О139 ctx- tcp- 6/0 6/6 6/1 6/1 6/6 6/0 6/6 6/1 6/6
E. coli 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0 3/0
V. cholerae не 01/не 0139 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Aeromonas spp. 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0
Salmonella spp. 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0
П р и м е ч а н и е. ствующих с МКА.
отношение числа исследованных штаммов к числу штаммов, взаимодеи
Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез бактериальных взвесей проводили по U. Laemmli [22] в пластинах 12,5% полиакриламидного геля размером 70 х 100 х 0,7 мм в денатурирующих условиях при постоянном напряжении (концентрирование 50 В, разделение 120 В) на приборе Helicon. Использовали белковые маркеры молекулярной массы от 10 до 250 кДа (BioRad). Полусухой перенос фракций бактериальных лизатов из геля на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) (BioRad, США) проводили при постоянной силе тока 200 мА (в течение 30 мин) на приборе Helicon. Для окраски белков на мембране использовали краситель Ponceau S (Reanal, Будапешт). Постановку имму-ноблоттинга осуществляли, как описано H. Towbin и соавт. [23].
Результаты и обсуждение
Для иммунизации мышей в качестве иммуногена использовали микробные клетки, инактивированные кипячением, принимая во внимание, что специфический О-антиген устойчив к термообработке. После бустер-ного введения бактериальной взвеси V. cholerae El Tor 13020 титры специфических антител в гипериммунных сыворотках мышей в ИФА составили 1:80 000—1:160 000. После проведения гибридизации (парное слияние) было засеяно 760 лунок, в 190 из них обнаружены гибридные клеточных культуры, устойчивые в селективной среде НАТ. При первичном тестировании в ТИФА культу-ральных жидкостей (КЖ) гибридом положительными оказались 180 клонов. Повторные скрининги КЖ показали, что большинство гибридных клеток утратили способность продуцировать МКА. В результате клонирования положительных гибридом отобрали 9, которые показали при длительном культивировании стабильную анти-телопродукцию и хорошие ростовые свойства. Данные клоны были масштабированы путем последовательного пересева в культуральные флаконы возрастающего объема и заложены на хранение в жидкий азот в сосуды Дьюара.
В задачи исследования входило получение диагностически значи-
мых гибридом, поэтому в ТИФА первоначально оценили специфическую активность МКА и частоту представленности соответствующих им антигенных детерминант на поверхности холерных вибрионов О1-, О139-серогрупп. Испытуемые штаммы холерных вибрионов Эль-Тор и О139 из коллекции музея живых культур института, выделенные от человека и из объектов окружающей среды, отличались по наличию генов ctx, tcp. Как видно из результатов ТИФА (см. таблицу), определяющим для условного разделения МКА на группы явилось наличие в клетках гена tcp. По этому критерию в 1-ю группу входят МКА гибридом H2F6, F11H2, G3F5, E5F5, A5B6, вступающие в реакцию со штаммами V cholerae El Tor, V cholerae О139, имеющих генотип ctx+tcp+ и ctx-tcp+. Эти же МКА не взаимодействуют с клетками исследуемых штаммов, лишенных генов ctx, tcp. Другая группа включает МКА гибридом А5D8, В3А5, D6, 4F5, выявляющих общие эпитопы штаммов V. cholerae El Tor, О139, с которыми зарегистрирована положительная реакция, независимо от присутствия в клетках генов ctx, tcp. Отсутствие перекрестной реактивности с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов - свидетельство специфичности МКА в отношении холерных вибрионов О1-, О139-серогрупп.
Очевидно, что в плане диагностики первоочередной интерес представляют МКА 1-й группы. Подтверждение тому - результаты дот-ИФА на примере МКА гибридо-мы H2F6 (рис. 1), которые позволяют наглядно увидеть, что эти МКА только со штаммами V. cholerae El Tor и О139 tcp+ образуют на НЦМ интенсивно окрашенные пятна. Положительная реакция не регистрируется с холерными вибрионами, не содержащими генов ctx, tcp.
Для определения химической природы антигенных детерминант, узнаваемых МКА и их эпитопной направленности мы использовали препарат ЛПС из штамма V cholerae El Tor 5879 (выделен по О. Westphal и соавт. [24]) и общую белковую фракцию внешних мембран, выделенную из клеток штамма V. cholerae Classical 1395 (согласно методике Kabir S. [25]). При постановке ИФА, где на твердую фазу сенсибилизировали препарат ЛПС, у всех полученных МКА зарегистрирована отрицательная реакция. В качестве положительного
12 3 4 -- 5 i 11 12 13 14 15 16 17
• •• о •
6 7 8 9 10 18 19 г 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
• •в • • •• • • 1
Рис. 1. Результаты определения специфичности МКА гибридомы H2F6 в дот-ИФА:
I-5 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx+tcp+ - 13020, 18826, 18895, 15261, 17834; 6-10 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx-tcp+ - 18780, 18775, 18781, 18786, 18778;
II-17 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctxtcp-- 19435, 18898, 18512, 18776, 18729; 18-22 - Vibrio cholerae 0139 ctx+tcp+ - 16488, 16485, 16131, 16485, 16063; 23-26 -Vibrio cholerae 0139 ctxtcp- - 17682, 17780, 17780, 17785, 17788; 27 - Vibrio cholerae 022; 28 - Salmonella spp.; 29 - E. coli.
250 kD isT" H2F6 H2F6 A5D8 A5D8 F8G12 F8G12
20—-
21— Шшж > * # P
2L_
20
JO
метч. 2 i 2 1 J
Рис. 2. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами:
1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+),
2 - Vibrio cholerae El Tor 19435 (ctx-tcp-).
контроля использовали МКА гибридомы F8G12, направленные к эпитопам О-антигена холерных вибрионов О1-серогруппы [10]. Отсутствие специфической реакции исследуемых МКА с препаратом ЛПС также подтвердилось и при проведении иммуноблоттинга, так как не были выявлены специфические окрашенные зоны на нитроцеллюлозной мембране (рис. 2). Когда антигеном в ТИФА служили белки внешней мембраны, то окрашенные лунки были зарегистрированы только в отношении МКА D6 и 4F5, т. е. двух из девяти испытуемых. Из полученных данных следует, что терморезистентные антигенные детерминанты не принадлежат ЛПС. В то же время большая часть имеющихся МКА не вступала в реакцию с белковой фракцией наружных мембран, выделенных из штамма классического холерного вибриона.
Для получения дополнительных сведений по вопросу природы и локализации антигенных детерминант, выявляемых комплементарными им МКА, была осуществлена постановка иммуноблота с клеточными
лизатами штаммов V. cholerae El Tor 13020 (ctx+ tcp+) и 19435 (ctx- tcp-), которые подвергли электрофорезу в ПААГ с Na-ДДС, затем осуществили перенос на НЦМ и проинкубировали с испытуемыми МКА (рис. 3).
Как видно, МКА гибридом H2F6, G3F5, E5F5, A5B6 взаимодействовали только с tcp+-штаммами, образуя интенсивную полосу, локализованную на уровне маркерных белков 38-42 кДа; у tcp--штаммов аналогичная полоса не выявлена. Общие для tcp+- и tcp--холерных штаммов эпитопы выявляли МКА гибридом A5D8 и В3А5 в районе маркерных белков 38-42 кДа, МКА гибридомы D6 узнает «свои» антигенные детерминанты в виде тонкой полосы на уровне примерно 6065 кДа. В отличие от других МКА гибридомы 4F5 у tcp+^тамма выявляла 3 полосы, соответствующие 3842, 14 и 10 кДа, тогда как у tcp--штамма выявлялись только две нижние полосы - 10 и 14 кДа. Отечественные авторы при исследовании полипептидного профиля наружных мембран вирулентных и авирулентных штаммов V cholerae О1- и О139-серогрупп установили, что полипептиды с мол. массой 35-46 кДа имеются у всех штаммов V. cholerae О1 и О139, обусловливая характерный вид электрофореграмм [26]. Из всего состава мажорных белков наружных мембран наибольшим уровнем экспрессии отличаются белки, мигрирующие в виде комплекса полипептидов с мол. массой 37-42 кДа. После проведения электрофореза и переноса белков из геля на НЦМ мембрана была окрашена красителем Ponceau S, в результате чего у всех трех штаммов визуализировалась интенсивная белковая полоса на уровне 38-42 кДа. В результате обработки НЦМ МКА на блотограмме обнаружены интенсивные полосы на уровне 38-42 кДа; и в связи с этим мы предположили, что полученные нами МКА специфически взаимодействуют с определенными белками наружных мембран. Из вышеприведенных данных следует (см. таблицу), что 1-я группа МКА, взаимодействующих в ТИФА с холерными вибрионами tcp+, не выявляет на блотограмме антиген 38-42 кДа у tcp'-штаммов, т. е. очевидны их различия по этим белкам. Установлено также, что белки наружных мембран у холерных вибрионов О139-серогруппы отличаются более высокой гетерогенностью в сравнении с холерными вибрионами О1, что видно на электрофореграмме после переноса на мембрану и окраски ее красителем Ponceau S. При постановке иммуноблоттинга клеточного лизата V. cholerae 0139 16064 (ctx+ tcp+) с МКА 1-й группы на блотограмме выявляется, помимо основной интенсивной полосы 38-42 кДа, несколько полос в диапазоне 20-37 кДа (рис. 4).
Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований получена панель гибридом-продуцентов МКА, направленых к поверхностным терморезистентным эпитопам холерных вибрионов Эль-Тор и О139.
К числу поверхностных структур относят и белки наружных мембран. Из имеющихся публикаций следует, что в результате электрофореза протеинов внешней мембраны представителей V. cholerae О1 регистрируется от 8 до 10 полос
Рис. 3. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами:
1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+),
2 - Vibrio cholerae El Tor - 19435 (ctxtcp-).
Рис. 4. Иммуноблот МКА с бактериальными лизатами:
1 - Vibrio cholerae El Tor - 13020 (ctx+tcp+),
2 - Vibrio cholerae 0139 16064 (ctx+tcp+).
в диапозоне 94-27 кДа с мажорной полосой 40-45 кДа [27]. Другие исследователи отмечают, что у холерных вибрионов О1, О139 наибольшим уровнем экспрессии отличаются белки наружных мембран, мигрирующие в виде комплекса полипептидов с мол. массой 37-42 кДа [26]. Нами в результате иммуноблоттинга обнаружено, что МКА, включенные в 1-ю группу, узнают соответствующие им антигенные детерминанты на уровне 38-42 кДа у штаммов V. cholerae El Tor и О139 с генотипом ctx+ tcp+ и ctx- tcp+. Аналогичные белки не обнаружены в составе поверхностных структур штаммов V cholerae El Tor и О139 ctxtcp". Поскольку установлено разделение холерных штаммов по признаку наличия гена tcp, то вполне вероятной представлялась возможность выявление с помощью определенных МКА белка токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТКПА). Однако данные литературы [28] свидетельствуют, что мол. масса этого белка 20,5 кДа, тогда как различия между холерными штаммами tcp+ и tcp- наблюдаются в отношении белков 38-42 кДа. Среди белков наружных мембран наибольший интерес представляют OmpT и OmpU соответственно с мол. массой 40 и 38 кДа [27, 29]. Вполне возможно, что в имеющемся у нас наборе есть МКА, направленные к эпитопам белков OmpT или OmpU. Последние являются протеинами, участвующими в образовании пор во внешней мембране, способствующими поступлению питательных веществ [27]. Они также обеспечивают устойчивость к антибиотикам, гидролитическим ферментам, солям желчных кислот и другим стрессовым воздействиям. Кроме того, установлено, что OmpU является важным протективным антигеном, обладает свойствами адгезинов, которые играют существенную важную роль в патогенезе холеры [30]. Данные в публикациях Б.Н. Мишанькина и соавт. (2013) свидетельствуют, что белок OmpT наделен протеолитической активностью, расщепляет протамин, фибрин, желатин, казеин, коллаген и активирует плазминоген человека в плазмин, что обеспечивает известные преимущества вибрионам во время пребывания в кишечнике чувствительного хозяина [31]. Дальнейшие исследования с помощью МКА позволят более точно определиться и выяснить, о каких поверхностных белках идет речь. В нашей работе клетки V. cholerae El Tor 13020, используемые в
качестве иммуногена, инактивиро-вали кипячением и при этом белки наружных мембран сохранили свою активность, что позволяет отнести их к термостабильным антигенам. Большая часть из полученных МКА направлена к поверхностным терморезистентным белковым антигенам с мол. массой 38-42 кДа. МКА специфически взаимодействуют с клетками V. cholerae El Tor и О139, поэтому могут быть использованы для эпитопного анализа поверхностных антигенов холерных вибрионов О1 и О139, а также в иммуно-ферментных методах для детекции эпидемически опасных штаммов. Кроме того, создание панели МКА к антигенам холерных вибрионов позволит оценивать с помощью имму-ноферментных методов эффективность экспрессии диагностически значимых генов и генов вирулентности по наличию или отсутствию их продуктов. Это позволит проводить в совокупности с генетическими методами многофакторный анализ природных штаммов холерного вибриона. Изучение иммунобиологических свойств МКА позволит ответить на вопрос, какую функцию в клетке выполняют комплементарные им антигены. Последние можно выделить с помощью иммуносорбентов, приготовленных на основе специфических МКА.
ЛИТЕРАТУРА
1. Adams L.B., Henk M.C., Siebeling R.J. Detection of Vibrio cholerae with monoclonal antibodies specific for serovar О1 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 1988; 26 (9): 1801-9.
2. Colwell R.R., Hasan J.A., Huq A., Loomis L., Siebeling R.J., Torres M. et al. Development and evaluation of a rapid, simple, sensitive, monoclonal antibody-based co-agglutination test for direct detection of Vibrio cholerae 01. FEMS Microbiol. Lett. 1992; 76 (3): 215-9.
3. Supawat K., Huttayananont S., Kusum M., Kalambaheti T., Chaicumpa W. A monoclonal antibody-based dot-blot ELISA diagnostic kit for the detection of Vibrio cholerae О1 in stools of diarrheic patients and household contacts. Asian Pac. J. Allergy Immunol. 1994; 12 (2): 155-9.
4. Hasan J.A., Bernstein D., Huq A., Loomis L., Tamplin M.L., Colwell R.R. Cholera DFA: an improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of Vibrio cholerae О1. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 120 (2): 143-8.
5. Chen W., Lu J.Zh.G., Yuan Z., Wu Q., Li J., Xu G. et al. Development of an immunochromatographic lateral flow device for rapid diagnosis of Vibrio cholerae О1 serotype Ogawa. Clin. Biochem. 2014; 47 (6): 448-54.
6. Jyoung J.Y., Hong S., Lee W., Choi J.W. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae O1 using surface plasmon resonance. Siosens. and Bioelectron. 2006; 21 (12): 2315-9.
7. Pengsuk C., Longyant S., Rukpratanporn S., Chaivisuthangkura P., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Differentiation among theVibrio cholerae serotypes O1, О139, О141 and non-O1, non-O139, non-O141 using specific monoclonal antibodies with dot blotting. J Microbiol. Meth. 2011; 87 (2): 224-33.
8. Pengsuk Ch., Chaivisuthangkura P., Longyant S., Sithigorngul P. Development and evaluation of a highly sensitive immunochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae О139 in seafood samples. Biosens. and Bioelectron. 2013; 42: 229-35.
9. Thattiyaphong A., Okada K., Khangrang S., Nispa W., Sawanpanyalert P., T. Honda T. Development of a 5-minute rapid test for detecting Vibrio cholerae О139. Southeast Asian J. Trop. Med. Publ. Hlth J. 2013; 44 (3): 448-55.
10. Бурлакова О.С. Моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры: Дис. ... канд. мед. наук. Ростов-на-Дону; 1993.
11. Михеева Е.А., Девдариани З.Л., Терешкина Н.Е. Получение и применение моноклональных антител для обнаружения холерного токсина. В кн.: Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на ЧС в области обще-
ственного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера. Саратов; 2012: 162-4.
12. Терешкина Н.Е. Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio Ло1егае О139 с использованием поли- и моноклональных антител: Дисс. ... канд. мед. наук. Саратов; 2004.
13. Сырова Н.А. Получение, характеристика и биотехнологические аспекты применения поли- и моноклональных антител к антигенам Vibrio cholerae О1 Инаба и Огава: Дисс. ... канд. биол. наук. Саратов; 2005.
14. Маркина О.В. Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae О1 и Vibrio cholerae О139 с помощью им-муноферментного анализа и культуры клеток: Дисс. ... канд. биол. наук. Ставрополь; 2008.
15. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Храмов М.В., Крутиков В.Д., Агафонова В.В и др. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов О1 серогруппы. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 6: 88-93.
16. Баранова Е.В. Федюкина Г.Н., Соловьев П.В., Колосова Н.В., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. и др. Разработка иммунохроматогра-фических тестов для выявления штаммов серогруппы О1 и ток-синобразующих штаммов холерного вибриона. В кн.: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону; 2013; 26: 215-8.
17. Алексеева Л.П., Козлова Г.А., Маркина О.В., Кретенчук О.Ф., Яговкин М.Э., Бурша О.С. Использование моноклональных пе-роксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов О1, О139 в реакции дот-иммуноанализа. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3: 26-9.
18. Fazekas de St., Groth S. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics J. Immunol. Meth. 1980; 35: 1-21.
19. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа; 1991.
20. Underwood P.A., Bean P.A. Hazards of the limiting-dilution method of cloning Hybridomas. J. Immunol. Meth. 1988; 107: 119-28.
21. Кэтти Д., ред. Антитела: Методы. М.: Мир; 1991; кн. 1.
22. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5.
23. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding. Current status and outlook. J. Immunol. Meth. 1984; 72: 313-40.
24. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Meth. Carbo-hydr. Chem. 1965; 5: 83-91.
25. Kabir S. Composition and immunochemical properties of outermembrane proteins of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 1980; 144: 382-9.
26. Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Куликалова Е.С. и др. Полипептидный профиль наружных мембран вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2007; 3 (55), прил.: 52-6.
27. Kelley J.T., Parker Ch.D. Identification and preliminary characterization of Vibrio cholerae outer membrane proteins. J. Bacteriol. 1981; 145 (2): 1018-24.
28. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G., Mekalanos J.J., Taylor R.K., Levine M.M. Toxin, toxin-coregulated pili, and thetoxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans. J. Exp. Med. 1988; 168 (4): 1482-92.
29. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Sen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: Purification and characterization of OmpU. J. Bacteriol. 1996; 178 (2): 524-30.
30. Provenzano D., Klose K.E. Altered expression of the ToxR-regulated porins OmpU and OmpT diminishes Vibrio choleraebile resistans, virulence factors expression and intestinal colonization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97 (18): 10 220-4.
31. Мишанькин Б.Н., Дуванова О.В., Шипко Е.С., Романова Л.В., Водопьянов А.С., Ерибекян А.К. и др. Система активации плазми-ногена у Vibrio cholerae. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2013; 5: 13—20.
Поступила 20.05.15
REFERENCES
1. Adams L.B., Henk M.C., Siebeling R.J. Detection of Vibrio cholerae with monoclonal antibodies specific for serovar O1 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 1988; 26 (9): 1801-9.
2. Colwell R.R., Hasan J.A., Huq A., Loomis L., Siebeling R.J., Torres M. et al. Development and evaluation of a rapid, simple, sensitive, monoclonal antibody-based co-agglutination test for direct detection of Vibrio cholerae 01. FEMS Microbiol. Lett. 1992; 76 (3): 215-9.
3. Supawat K., Huttayananont S., Kusum M., Kalambaheti T., Chaicumpa w. A monoclonal antibody-based dot-blot ELISA diagnostic kit for the detection of Vibrio cholerae О1 in stools of diarrheic patients and house-
hold contacts. Asian Pac. J. Allergy Immunol. 1994; 12 (2): 155-9.
4. Hasan J.A., Bernstein D., Huq A., Loomis L., Tamplin M.L., Colwell R.R. Cholera DFA: an improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of Vibrio cholerae Ol. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 120 (2): 143-8.
5. Chen W., Lu J.Zh.G., Yuan Z., Wu Q., Li J., Xu G. et al. Development of an immunochromatographic lateral flow device for rapid diagnosis of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa. Clin. Biochem. 2014; 47 (6): 448-54.
6. Jyoung J.Y., Hong S., Lee W., Choi J.W. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae o1 using surface plasmon resonance. Siosens. andBioelectron. 2006; 21 (12): 2315-9.
7. Pengsuk C., Longyant S., Rukpratanporn S., Chaivisuthangkura P., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Differentiation among theVibrio cholerae serotypes O1, O139, O141 and non-O1, non-O139, non-O141 using specific monoclonal antibodies with dot blotting. J Microbiol. Meth. 2011; 87 (2): 224-33.
8. Pengsuk Ch., Chaivisuthangkura P., Longyant S., Sithigorngul P. Development and evaluation of a highly sensitive immunochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae O139 in seafood samples. Biosens. and Bioelectron. 2013; 42: 229-35.
9. Thattiyaphong A., Okada K., Khangrang S., Nispa W., Sawanpanyalert P., T. Honda T. Development of a 5-minute rapid test for detecting Vibrio cholerae O139. Southeast Asian J. Trop. Med. Publ. Hlth J. 2013; 44 (3): 448-55.
10. Burlakova O.S. Monoclonal Antibodies to the O-antigen of the Cholera Causative Agent: Diss. Rostov-na-Donu; 1993. (in Russian)
11. Mikheeva E.A., Devdariani Z.L., Tereshkina N.E. Production and use of monoclonal antibodies for cholera toxin detection. In: Present Day Technologies in the Advancement of Preventive and Response Measures in Case of Emergency Situations of Sanitary-epidemiological Nature in the Sphere of Public Health. Proceedings of the XI International Scientific Practical Conference. Saratov; 2012: 162-4. (in Russian)
12. Tereshkina N.E. Study of Capsular and Non-capsular Vibrio Cholerae O139 Forms with the Use of Poly- and Monoclonal Antibodies: Diss. Saratov; 2004. (in Russian)
13. Syrova N.A. Production, Characterization andBiotechnologicalAspects of Usage of Poly- andMonoclonal Antibodies to Antigens of Vibrio Cholerae O1 Inaba and Ogawa: Diss. Saratov; 2005. (in Russian)
14. Markina O.V. Study of the Toxin-producing Ability of Vibrio Cholerae O1 and Vibrio Cholerae O139 Strains with the Use of Immunoenzyme Assay and cell Culture: Diss. Stavropol'; 2008. (in Russian)
15. Alekseeva L.P., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M., Khramov M.V., Kruglikov V.D., Agafonova V.V. et al. Comparative evaluation of dot-immunoassay and immunochromatographic methods in detection of Vibrio cholerae O1 serogroup. Zhurnal mikrobiolobii, epidemiologii i immunobiologii. 2010; 6: 88-93.
16. Baranova E.V., Fedyukina G.N., Solov'ev P.V., Kolosova N.V., Mironova L.V., Kulikalova E.S. et al. The development of immunochromatographic tests for the detection of O1 and toxin-forming Vibrio cholerae strains. In: Cholera and Vibrios Pathogenic to Humans: The Commission on Scientific Problem. [Problemnaya komissiya "Kholera i patogennye dlya cheloveka embriony]. Rostov-na-Donu; 2013; 26: 215-8. (in Russian)
17. Alekseeva L.P., Kozlova G.A., Markina O.V., Kretenchuk O.F., Ya-govkin M.E., Bursha O.S. The use monoclonal peroxidase conjugate for identification of Vibrio cholerae O1, O139 in the reaction of the dot-immunoassay. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2013; 3: 26-9. (in Russian)
18. Fazekas de St., Groth S. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 1980; 35: 1-21.
19. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiev B.B., Gavrilova E.M. Theory and Practics of Immunoenzyme Analysis. Teoriya i praktika immunoferment-nogo analiza]. Moscow: Vysshaya shkola; 1991. (in Russian)
20. Underwood P.A., Bean P.A. Hazards of the limiting-dilution method of cloning Hybridomas. J. Immunol. Meth. 1988; 107: 119-28.
21. Ketti D., ed. Antibodies: Methods. [Antitela: Metody]. Moscow: Mir; 1991; book 1. (in Russian)
22. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5.
23. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding. Current status and outlook. J. Immunol. Meth. 1984; 72: 313-40.
24. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Meth. Carbo-hydr. Chem. 1965; 5: 83-91.
25. Kabir S. Composition and immunochemical properties of outermembrane proteins of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 1980; 144: 382-9.
26. Nikolaev V.B., Markov E.Yu., Urbanovich L.Ya., Maramovich A.S., Gol-ubinskiy E.P., Kulikalova E.S. et al. Polypeptide profile of outer membranes of virulent and avirulent Vibrio cholerae O1 and O139 strains. Byulleten' VSNTs SO RAMN. 2007; 3 (55), pril. 52-6. (in Russian)
27. Kelley J.T., Parker Ch.D. Identification and preliminary characterization of Vibrio cholerae outer membrane proteins. J. Bacteriol. 1981; 145 (2): 1018-24.
28. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G., Mekalanos J.J., Taylor R.K., Levine M.M. Toxin, toxin-coregulated pili, and thetoxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans. J. Exp. Med. 1988; 168 (4): 1482-92.
29. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Sen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: Purification and characterization of OmpU. J. Bacteriol. 1996; 178 (2): 524-30.
30. Provenzano D., Klose K.E. Altered expression of the ToxR-regulated porins ompU and ompT diminishes Vibrio choleraebile resistans, virulence factors expression and intestinal colonization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97 (18): 10 220-4.
31. Mishan'kin B.N., Duvanova O.V., Shipko E.S., Romanova L.V., Vodop'yanov A.S., Eribekyan A.K. et al. The system of plasminogen activation in Vibrio cholerae. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2013; 5: 13-20. (in Russian)
Сведения об авторах:
Евдокимова Вероника Вячеславовна, науч. сотр. гр. гибридом лаб. микробиологии холеры, [email protected]; Алексеева Людмила Павловна, д.б.н., проф., рук. гр. гибридом лаб. микробиологии холеры; Кретенчук Оксана Федоровна, к.б.с., н.с. гр. гибридом лаб. микробиологии холеры; Бурша Ольга Сергеевна, науч. сотр. гр. гибридом лаб. микробиологии, к.м.н., зав. лаб. микробиологии холеры; Кругликов Владимир Сергеевич, к.м.н., зав. лаб. микробиологии халеры; Архангельская Ирина Викторовна, н.с. лаб. микробиологии холеры.
ОБМЕН ОПЫТОМ
© НИКОЛАЕВА Л.И., БЕХЗАДПУР Д.Н., 2015 УДК 616:36-002-022-036.22(55)
Николаева Л.И.1, Бехзадпур Д.Н.2
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ С ГЕПАТИТОМ С В ИРАНЕ
1ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16; 2Исламский Университет Азада, отделение Решт, Иран, 41335-3516, г. Решт, ул. Поле телешан, 17
Цель - представить современные данные по эпидемиологии гепатита С в Исламской Республике Иран. В обзоре рассмотрены основные пути передачи инфекции, группы риска и структура генотипов вируса гепатита С. Ключевые слова: гепатит С; эпидемиология; Иран.
Для цитирования: Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 20 (3): 57-60.
Nikolaeva L.I., Behzadpour D.N.
EPIDEMIOLOGICAL SITUATION WITH HEPATITIS C IN IRAN
JN.F. Gamaleya Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology, 16, Gamaleya Str., Moscow, Russian Federation, 123098
2Islamic Azad University, Rasht branch, 17, Pole teleshan Str., Rasht, Iran, 41335-3516
The aim of the review was to present modern data on epidemiology of hepatitis C in Islamic Republic of Iran. In the review there are considered main routs of the infection transmission, groups of high risk and structure of hepatitis C genotypes. Key words: hepatitis C; epidemiology; Iran.
Citation: Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. 2015; 20(3): 57-60. (In Russ.)
Введение
Вирусный гепатит С - повсеместно распространенное инфекционное заболевание, передающееся через кровь и препараты крови, а также половым и вертикальным путями. Хронический гепатит С является наиболее частой причиной тяжелых заболеваний печени: цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы.
Показатель распространенности гепатита С по странам сильно варьирует: от 0,2 до 40% [1-4]. В развитых странах он достигает 0,2-2,2%, а в развивающихся -
Для корреспонденции: Николаева Людмила Ивановна,
руководитель лаб. генно-инженерных препаратов, доктор биол. наук, e-mail: [email protected]. 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16. Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского при ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», e-mail: [email protected].
почти 7% [3]. Высокая частота выявления инфицированных лиц (более 3,5%) характерна для большинства стран Северной Африки, Среднего Востока, Центральной и Восточной Азии, наименьшая (менее 1,5%) - для государств Северной Америки, островов азиатской части Тихого океана и тропической части Латинской Америки [4]. В остальных государствах доля инфицированных лиц составляет от 1,5 до 3,5% всего населения страны.
В начале и середине прошлого века распространение гепатита С происходило более интенсивно из-за двух глобальных войн, процедур переливания крови на фоне отсутствия диагностических тест-систем для выявления маркеров этой инфекции и инъекционной наркомании. Первые диагностикумы для обнаружения маркеров гепатита С появились в начале 1990-х годов. Процесс распространения этой инфекции особенно интенсифи-
