CC BY
72
5. Altarescu G., RachmilewitzD., Zevin S. // Isr. Med. Assoc. J. - 2011.
- Vol. 13, N 2. - P. 87-90.
6. Ananthakrishnan A. N., McGinley E. L., Binion D. G., Saeian K. // Inflamm. Bowel. Dis. - 2010. - Vol. 16, N 9. - P. 1532-1540.
7. BenazzatoL., D'IncaR., GrigolettoF. et al. // Dig. Liver Dis. - 2004.
- Vol. 36, N 7. - P. 461-466.
8. Cosnes J., CarbonnelF., BeaugerieL. et al. // Gut. - 2002. - Vol. 51, N 6. - P. 803-807.
9. FalkR. J., TerrellR., CharlesL. A., Jennette J. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol. 87. - P. 4115-4119.
10. Fraga X. F., Vergara M., Medina C. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1997. - Vol. 9, N 7. - P. 683-687.
11. Heide F., Wassenaar M., Linde K. et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 2011. - Vol. 23, N 3. - P. 255-261.
12. Hoie O., Wolters F., Riis L. et al. // Am. J. Gastroenterol. - 2007. -Vol. 102, N 8. - P. 1692-1701.
13. KaminagaN., Satake Y. // Nippon, Rinsho. - 1999. - Vol. 57, N 11. -P. 2437-2442.
14. Karoui S., Serghini M., Chaieb M. et al. // Tunis Med. - 2009. -Vol. 87, N 2. - P. 115-119.
15. Liu X., Yu T, Zhao M. et al. // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. - 1999. -Vol. 38, N 7. - P. 451-454.
16. Mallolas J., EsteveM., RiusE. et al. // Gut. - 2000. - Vol. 47, N 1. -P. 74-78.
17. Naganuma M., Iizuka B., Torii A. et al. // Am. J. Gastroenterol. -2001. - Vol. 96, N 4. - P. 1123-1126.
18. Osangthamnont C., Manatsathit S., Pongprasopchai S. et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. - 2001. - Vol. 16, N 8. - P. 866-871.
19. Preda С. М., Vermeire S., RutgeertsP. et al. // Rom. J. Gastroenterol.
- 2005. - Vol. 14, N 4. - P. 357-360.
20. Reinisch W., Sandborn W. J., BalaM. et al. // Inflamm. Bowel Dis. -2007. - Vol. 13, N 9. - P. 1135-1140.
21. Sandborn W. J. // Inflamm. Bowel Dis. - 2005. - Vol. 11, N 8. -P. 707-712.
22. Selby W. S., Griffin S., Abraham N., Solomon M. J. // Am. J. Gastroenterol. - 2002. - Vol. 97, N 11. - P. 2834-2838.
23. SiciliaВ., VicenteR., ArroyoM. T. et al. // Gastroenterol. Hepatol. -2005. - Vol. 28, N 2. - Р. 55-59.
24. SolbergI. C., LygrenI., CvancarovaM. et al. // Inflamm. Bowel Dis.
- 2009. - Vol. 15, N 3. - P. 406-414.
25. Stange E. F., Travis S. P. L., Vermeire S., Reinisch W. // J. Crohn's Colitis. - 2008. - Vol. 2, N 1. - P. 1-23.
26. Sutherland L. R., Martin F., Greer S. et al. // Gastroenterology. -1987. - Vol. 92, N 6. - P. 1894-1898.
27. Truelove S. C, Witts L. J. // Br. Med J. - 1959. - Vol. 14, N 5119. -P. 387-394.
28. Vergara Т., Cofr@e P., Cifuentes S. et al. // Rev. Med. Chil. - 2006.
- Vol. 134, N 8. - P. 960-964.
29. Zhou F., XiaВ., WangF. et al. // Clin. Chim. Acta. - 2010. - Vol. 411, N 19-20. - P. 1461-1465.
Поступила 16.03.12
© коллектив авторов, 2013
УДК 616.932-078.33
Л. П. Алексеева, Г. А. Козлова, О. в. маркина, О. Ф. Кретенчук, м. Э. Яговкин, О. С. Бурша
использование моноклональных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов СЕрОГрУПП О1, О139 в реакции дот-иммуноанализа
ФКУз Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Источником моноклональных антител (МКА) служила культуральная жидкость (КЖ) гибридом-продуцентов, депонированных в специализированной коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург) под номерами РККК(П) 386Д и РККК(П) 674Д. Специфические иммуноглобулины (Ig) из КЖ концентрировали путем осаждения их насыщенным раствором сульфата аммония. Схема получения МКА-пероксидазных конъюгатов включала активацию пероксидазы (ПХ), конъюгацию активированной ПХ с Ig, удаление несвязавшихся белков, хранение и контроль. Сохранность активности конъюгатов обеспечивали с помощью БСА (10%) или глицерина (50%), причем использование последнего для этих целей предпочтительнее. Испытание МКА-О1 и МКА-О139 пероксидазных конъюгатов на наборе штаммов холерных вибрионов О1 и О139 показало их строгую специфичность, так как они взаимодействовали только с соответствующими им серогруппами при отсутствии перекрестных реакций с представителями гетерологичных микроорганизмов. Постановка прямого дот-иммуноанализа осуществляется в течение 1,5 ч, чувствительность его находится в пределах 105-106. Применение диагностических моноклональных пероксидазных конъюгатов О1, О139 в лабораторной практике будет способствовать повышению специфичности серологического анализа на холеру и сокращению сроков его выполнения.
Ключевые слова: моноклональные антитела, пероксидазные конъюгаты, дот-иммуноанализ, холерный вибрион, диагностика
L.P. Alekseyeva, G.A. Kozlova, O.S. Bursha, O.V. Markina, O.F. Kretentchuk, M.E. Yagovkin
THE APPLICATION OF MONOCLONAL PEROXIDASE CONJUGATES TO IDENTIFY COMMA BACILLUS
OF SERUM GROUPS 01 AND 0139 IN THE REACTION OF DOT-IMMUNE ANALYSIS.
The .source ofmonoclonal antibodies was chosen the culturalfluid of hybridoma-producers deposited in the .specialized collection of cell cultures of vertebrates (St. Petersburg) with numbers RKKK(P) 386D and RKKK(P) 674D. The specific immunoglobulin (Ig) from culturalfluid was concentrated by precipitation with saturated solution of ammonium sulfate. The scheme of obtaining monoclonal antibodies included activation ofperoxidase, conjugation of activated peroxidase with Ig, removal of unbounded proteins, storage and control. The preservation of activity of conjugates was supported with BSA (10%) or glycerin (50%). The last on is preferable to be applied for this purpose. The test of monoclonal antibody-01 and monoclonal antibody-0139 ofperoxidase conjugates with kit of strains of comma bacillus 01 and 0139 demonstrated their strict specificity because they interacted only with corresponding serum groups under absence of crossed reactions with representatives of geterologic microorganisms. The direct dot-immune analysis is carried out during 1.5 hour and its sensitivity is within the limits 105-106. The application of diagnostic monoclonal peroxidase conjugates 01, 0139 in laboratory practice can promote the increase of specificity of serologic analysis of cholera and saving time-frame of its application.
Key words: monoclonal antibody, peroxidase conjugate, dot-immune analysis, comma bacillus, diagnostic
Основным направлением повышения чувствительности, специфичности и экспрессности лабораторной диагностики особо опасных инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику методов, основанных на достижениях микро- и нанотех-нологий, протеомного, геномного анализов. Проблема специфичности может быть решена за счет монокло-нальных антител (МКА), которые обладают рядом преимуществ перед поликлональными сыворотками: имеют одинаковую специфичность, аффинность, один изотип и субизотип [6]. Перечень препаратов, разработанных на основе МКА за рубежом, достаточно широк: меченые ФИТЦ-МКА для обнаружения Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлюорес-ценции [8, 11, 13], иммобилизованные на полимерные носители MKA для слайд-агглютинации, различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА), в первую очередь прямые, т. е. для взаимодействия с клетками холерного вибриона используют моноспецифические иммуноглобулины, меченные пероксидазой [10, 12, 14]. Дот-иммуноанализ (ДИА) - перспективный метод для детекции холерных вибрионов. Он является одним из наиболее эффективных и доступных методов экспресс - анализа, характеризуется высокой чувствительностью, быстротой выполнения [9]. Потребность в таких методах обусловлена современной ситуацией. Так, по данным Л. В. Григоренко и соавт. (2011), в ходе мониторинга за 2010 г. выделено 40 штаммов холерных вибрионов, дававших положительный результат в реакции слайд-агглютинации на стекле, но при последующей идентификации отнесенных к V. cholerae non01/non0139. Необходимы более специфичные тесты дифференциации холерных вибрионов О1- и nonО1/nonО139-серогрупп, включая иммунохроматографические и иммунофер-ментные методы. В лаборатории гибридом РПЧИ выведены стабильные гибридомы. Их свойства детально охарактеризованы, и результаты исследований опубликованы [1-4]. На штаммы культивируемых гибридных клеток, продуцирующих МКА к О-антигену холерных вибрионов О1-серогруппы и к холерных вибрионов О139-серогруппы, получены два патента № 2425874 от 13.04,2012 и № 2425875 от 07.06.2010.
В настоящее время в России отсутствуют зарегистрированные моноклональные препараты для иммунодиагностики холеры, поэтому представляются актуальными исследования, касающиеся оценки МКА как диагностических реагентов и возможности внедрения в практическое здравоохранение тест-систем на их основе.
Цель исследования - получение видоспецифических моноклональных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов О1- и О139-серогрупп в ИФА и ДИА и оценка возможности использования их в лабораторной диагностике холеры.
Материалы и методы. В работе использовали набор штаммов, включающий 25 штаммов V. cholerae eltor, 2 штамма V. cholerae cholerae, 6 штаммов V. cholerae 0139, 18 штаммов V. cholerae non01/non0139, 4 штамма V. cholerae eltor RO-варианта, V. cholerae О22. Холерные
Для корреспонденции:
Алексеева Людмила Павловна, д-р биол. наук, проф., рук. группы гибридом
Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: (863)240-27-03 E-mail: [email protected]
вибрионы выращивали на щелочном агаре Мартена при рН 7,7 и 370С в течение 18-20 ч. Культуры в экспериментах использовали как нативные (необеззараженные), так и инактивированные термическим способом.
Гибридомы - продуценты МКА хранятся в азоте на базе РостНИПЧИ, и к их подъему прибегали по мере необходимости. Для накопления клеток, продуцирующих специфические иммуноглобулины в условиях in vitro, гибридомы пассировали многократно в жидких питательных средах RPMI («Sigma», США), или DMEM («Sigma») с 10-15% сыворотки плода коровы («Пан ЭКО») в СО2-инкубаторе («Nuare»). Препарат концентрированных МКА получали путем осаждения их из культуральной жидкости (КЖ) насыщенным раствором сульфата аммония, от которого освобождались путем диализа [15]. Концентрат моноклональных иммуноглобулинов хранили при -200С. Количественное определение белка проводили по методу Лоури.
Cepoлoгичeскую активность МКА оценивали в реакциях непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) и ИФА, которые выполняли по общепринятым методикам. МКА конъюгировали с пероксидазой хрена (ПХ) («Sigma», RZ > 3.0) по методу Nakane [13].
Постановку ДИА осуществляли следующим образом. На предварительно расчерченную на квадраты 5 x 5 мм нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) наносили клетки по 2 мкл на точку из исследуемых микробных взвесей, концентрация которых равнялась 107, 108, 109 м.кл/мл, и затем подсушивали в течение 3-5 мин, при комнатной температуре. Если наносили живую культуру, то НЦМ помещали в 960 этанол на 30 мин для обеззараживания. НЦМ после подсушивания, обработки 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и отмывания инкубировали с МКА-пероксидазными конъюгатами в течение 40 мин. Визуализацию реакции осуществляли с помощью диаминобензидина («Sigma»). После появления коричневых пятен, учет проводили по четырехкрестовой системе.
Результаты и обсуждение. В работе использованы гибридома F8G12, продуцирующая Ig класса G, узнающие видоспецифические эпитопы О-антигена V. cholerae 01 (МКА-01), и гибридома Д11, продуцирующая Ig класса М, направленные к детерминантам ЛПС V. cholerae 0139 (МКА-0139). Гибридомы хранятся в жидком азоте и их выемку осуществляли по мере необходимости. Гибридомы с жизнеспособностью не ниже 60-70% успешно восстанавливались из глубокого замораживания, и в течение короткого времени происходило их накопление в виде массовой культуры. Источником МКА служила КЖ гибридом-продуцентов, так как они накапливаются в больших объемах в процессе пассирования гибридом in vitro для последующего введения мышам гибридомных клеток, чтобы индуцировать образование асцитических жидкостей (АЖ). Концентрат специфических Ig из КЖ получали преципитацией с помощью насыщенного сульфата аммония. Технология получения МКА пероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активации ПХ, иммобилизации активированной ПХ с Ig, очистки от несвязавшихся компонентов, хранения и контроля (рис. 1).
Описаны различные методы конъюгирования МКА с ПХ, в которых используются различные молекулярные соотношения Ig и ПХ [5-7]. В работе апробировано 3 варианта этого соотношения. Мечение антител пероксида-зой проводили в идентичных условиях. Концентрированный препарат МКА каждой гибридомы конъюгировали с эквимолярным количеством пероксидазы, двукратным и
ПХ МаНС030,ЗМ 1% ФДНБ
1
Инкубация 1 ч при перемешивании
Инкубация 30 мин при перемешивании 0,08 М периодата натрия
1
Инкубация 1 ч при перемешивании <- 0,16 М этиленгликоля
1
Диализ против 0,01 М раствора Ма2С03 рН 8,5
Активированный раствор ПХ
Иммуноглобулины
Инкубация 3 ч при перемешивании
Инкубация в холодильнике при 2-8 С в течение ночи
Бромид натрия
Очистка при помощи гель-фильтрации на сефадексе С-25 или диализ против 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,3
Заморозка 1% БСА; 50% глицерин + '
Контроль
Рис. 1. Схема получения моноклонального пероксидазного конъюгата.
четырехкратным ее избытком. Активность полученных конъюгатов исследовали методом прямого твердофазного ИФА (ТИФА). Реакцию ставили одновременно с ПХ-МКА О1- и ПХ-МКА О139-конъюгатами в идентичных условиях. Проверяли способность каждого конъюгата
110 кД 84 кД
47 кД
33 кД 16 кД
1 2 3 4 5
Рис. 2. Иммуноблоттинг моноклональных пероксидазных О1-, О139-конъюгатов.
1 - маркеры молекулярных весов; 2 - реакция моноклонального пероксидазного конъюгата О139 в разведении 1:80 с V. Ло1егае О139 (16077); 3 - реакция моноклонального пероксидазного конъюгата О139 в разведении 1:80 с V. Ло1егае О1 (5879); 4 - реакция моноклонального пероксидазного конъюгата О1 в разведении 1:80 с V. Ло1егае 01 (5879); 5 - реакция моноклонального пероксидазного конъюгата О1 в разведении 1:80 с V. с^1егае О139 (16077).
связываться со специфическим антигеном и способность к неспецифической сорбции. Конъюгаты начинали титровать с разведения 1:5 до 1:320. Самый высокий титр для обоих конъюгатов, равный 1:160, получен при соотношении ПХ и ^ 1:2. Очистку конъюгатов проводили методом гель - фильтрации на сефадексе 0-100 или путем диализа против 0,01 М фосфатного буфера. Если пропускали через колонку, они выходили в виде 1-й и 2-й фракции. Анализ специфической активности конъюгатов ПХ-МКА 01 и ПХ-МКА О139 в отношении соответствующих групп холерных вибрионов показал, что в обоих случаях она максимально представлена в 1-й фракции.
О чистоте и специфичности полученных конъюгатов судили на основании блотограм-мы, представленной на рис. 2.
Как видно на рисунке, при взаимодействии ПХ-МКА О139 со своим штаммом выявлена только одна полоса ниже 16 кД, что соответствует локализации ЛПС. Детерминанты О-антигена ЛПС V. сИо1егае 01 обнаруживают, согласно данным литературы [7], в районе 35-40 кД, и подтверждением тому является наличие в этом месте одной широкой полосы в результате взаимодействия конъюгата ПХ-МКА 01 с V. сИо1егае е11ш 5879. Отсутствие перекрестной реактивности конъюгатов (на блотограмме части 3,5) является показателем их специфичности.
С целью стабилизации и сохранности конъюгатов использовали 1% БСА или 50% глицерин и в виде аликвот содержали при -200С. После хранения в течение 2 и 6 мес проводили повторные исследования активности МКА-пероксидазных конъюгатов. Оказалось, что в аликвотах с глицерином она осталась на исходном уровне, тогда как в присутствии БСА зарегистрировано ее снижение (см. таблицу).
Оценку специфичности и чувствительности полученных конъюгатов проводили методом ДИА. Визуальная оценка взаимодействия испытуемых штаммов с моноклональными конъюгатами представлена на рис. 3. Отсутствие окрашенных или еле заметные окрашенные пятна на НЦМ у представителей Я0-штаммов, V. сИо1егае поп01/поп0139, V. сИо1егае 022 - показатель отрицательной реакции в ДИА и свидетельство строгой специфичности конъюгатов. Также установлено, что с помощью МКА О1- и МКА О139-пероксидазных конъюгатов в прямом варианте ДИА можно выявить холерные вибрионы соответствующих серогрупп, если
Активность моноклональных пероксидазных о1- и о139-конъюгатов в процессе хранения
Срок наблюдения, мес
Стабилизаторы 2 6 2 6
ПХ-МКА О1-конъюгат, чувствительность м.кл/мл ПХ-МКА О139-конъюгат, чувствительность м.кл/мл
Исходная активность 2 • 105 2 • 105
1% БСА 2 • 106 2 • 107 2 • 106 2 • 107
50% глицерин 2 • 105 2 • 105 2 • 105 2 • 105
• 2 * 3 • 4 • ю
• 6 * 7 • 00 9 • 10
11 12 13 14 15
• 16 • 17 18 # 19 • 20
ш 25
26 27 28 ■ ^ 29 30
ПХ-МКА 01 1:80
ПХ-МКА 0139 1:80
кации холерных вибрионов О1-, О139-серогрупп в ДИА и прямом ТИФА МКА-пероксидазные конъюгаты в рабочем разведении 1:80-1:160.
4. Испытание видоспецифических МКА-пероксидазных конъюгатов на штаммах холерных вибрионов О1, О139 и представителях гетерологичных микроорганизмов показало отсутствие перекрестной реактивности, подтвердив тем самым их строгую специфичность.
Рис. 3. Результаты визуальной оценки испытуемых штаммов в ДИА.
Штаммы: 1-5, 22-23 - V. сИо1егае еИог Огава; 6-0, 25 - V. сИо1егае еког Инаба; сИо1егае сИо1егае Инаба; 11-12, 16-21 - V. сИо1егае О139; 13, 28-30 - V. сИо1егае 0139; 14, 24 - V. сИо1егае еког ЯО-варианта; 15, 27 - V. сИо1егае 022.
ЛИТЕРАТУРА
10, 26 - V. non Ol/non
их количество в испытуемых пробах равняется 105-106 м.кл. Использование ДИА особенно уместно, когда одновременно тестируется большое число штаммов, так как в короткие сроки на небольшом участке мембраны можно не только получить ответ о наличии холерных вибрионов, но и визуально сравнить количественную представленность специфического О-антигена в составе поверхностных структур. Его применение полезно также в ходе мониторинга воды поверхностных водоемов для обнаружения представителей V. сИо1егае 01, 0139.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований дают основание оценивать экспресс-метод ДИА на основе моноклональных ПХ-конъюгатов как высокоспецифический и чувствительный. Его применение наряду с другими методами будет способствовать повышению качества и достоверности лабораторных исследований на холеру.
Выводы. 1. В результате экспериментальных исследований установлено, что количество моноклональных иммуноглобулинов, выделенных из культуральной жидкости, является достаточным для приготовления конъюгатов.
2. В процессе отработки процедуры конъюгации обнаружено, что ее эффективность обеспечивается соотношением пероксидаза : МКА (1:2) при условии содержания последних в пробе не менее 5 мг/мл.
3. Использование КЖ в качестве источника иммуноглобулинов позволяет получить для идентифи-
1. Алексеева Л. П., Бурлакова О. С., Балахнова В. В. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1992; 54 (6): 50-4.
2. Алексеева Л. П., Мазрухо Б. Л., Маркина О. В., Сальникова О. И., Ишина Е. В. Клиническая лабораторная диагностика. 2002; 12: 50-1.
3. Алексеева Л. П., Мазрухо Б. Л., Сальникова О. И., Маркина О. В., Лобанов В. В. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002; 4: 25-9.
4. Алексеева Л. П., Сальникова О. И., Мазрухо Б. Л., Маркина О. В., Лобанов В. В. Биотехнология. 2002; 4: 79-84.
5. Антитела. Методы. кн. 2 / Под ред. Д. Кэтти; Пер. с англ. М.: Мир; 1991.
6. Теория и практика иммуноферментного анализа: Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б. и др. М.: Высшая школа. 1991.
7. Книрель Ю. А. Строение липополисахаридов грамотрицатель-ных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор). Биохимия. 1994; 59 (12): 1784-851.
8. Castillo L., Castillo D., Silva W., Zapata L., Reid M., Ulloa M. T. et al. Hybridoma. 1995; 14 (3): 271-8.
9. Chaicumpa W., Srimanote P., Sacolvaree Y. J. Clin. Microbiol. 1998; 36 (12): 3595-600.
10. Colwell R. R., Hasan J. A., Huq A., Loomis L., Siebeling R. J., Torres M. et al. FEMS Microbiol. Lett. 1992; 76 (3): 215-9.
11. Hasan J. A., Bernstein D., Huq A., Loomis L., Tamplin M. L., Colwell R. R. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 120 (1-2): 143-8.
12. Nakane P. K., Kawaoi Akira. Peroxidase - labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22 (12): 1084-91.
13. QadriF., Azim Т., ChowdhuryA., Hossain J., SackR. B., AlbertM. J. Clin. Diagn. Immunol. 1994; 1: 51-4.
14. Qadri F., Chowdhury A., Hossain J., Chowdhury K., Azim Т., Shi-mada Т. et al. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 509-10.
15. ReikL. M., Maines. S. L. J. Immunol. Meth. 1987; 100: 123.
Поступила 25.06.12
