CC BY
17
биотехнология, иммунология
УДК 616.932:615.372
А.В.Комиссаров, С.А.Еремин, О.А.Волох, О.В.Громова, Ю.А.Алешина, Е.М.Кузнецова, Н.Г.Авдеева,
Л.Ф.Ливанова, А.к.никифоров
совершенствование технологии получения в-субъединицы холерного токсина
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
В статье рассмотрено внедрение современных фильтрационных технологий для масштабированного получения В-субъединицы холерного токсина, продуцируемой рекомбинантным штаммом Vibrio cholerae non O1 КМ93. Проведен выбор оптимального типа микро- и ультрафильтрационных мембран для использования в технологическом процессе. Исследованы свойства В-субъединицы холерного токсина, полученного по разработанной технологии. Разработанный способ масштабированного получения В-субъединицы холерного токсина делает процесс более технологичным за счет внедрения метода тангенциальной микро- и ультрафильтрации на этапах его очистки и концентрирования позволяет исключить трудоемкие операции хроматографической очистки и сохранить свойства В-субъединицы. Проведенные исследования позволяют получать В-субъединицу холерного токсина в производственных условиях с характеристиками, аналогичными при разработке технологии, и использовать ее в качестве компонента холерной химической вакцины.
Ключевые слова: В-субъединица холерного токсина, тангенциальная фильтрация, свойства.
A.V.Komissarov, S.A.Eremin, O.A.Volokh, O.V.Gromova, Yu.A.Aleshina, E.M.Kuznetsova, N.G.Avdeeva, L.F.Livanova, A.K.Nikiforov
Improvement of Technology of Cholera Toxin B-Subunit Production
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Consideration is given to implementation of state-of-the-art filtration technologies for up-scaled manufacturing of cholera toxin B-subunit, produced by recombinant Vibrio cholerae non O1 KM93 strain. Selected are micro- and ultra-filtration membranes to be incorporated into manufacturing method. Investigated are the properties of cholera toxin B-subunit, obtained applying the pilot technology. The engineered method for up-scaled manufacturing of cholera toxin B-subunit makes the procedure easier-to-maintain due to tangential micro- and ultra-filtration, performed at the stage of purification and concentration. It excludes labor-consuming chromatographic purification, while retaining B-subunit properties. The studies undertaken make it possible to manufacture cholera toxin B-subunit with the same characteristics as in the case of the pilot technology, but under production conditions, and use it as a component for chemical cholera vaccine.
Key words: cholera toxin B-subunit, tangential filtration, properties.
В-субъединица холерного токсина (В-ХТ) является одним из основных иммуногенных компонентов, формирует антитоксический иммунитет. В-ХТ I типа входит в состав холерной вакцины Дюкорал, лицензированной для применения более чем в 70 странах [11]. В литературе описан способ получения очищенной В-ХТ из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae [2], при котором основная стадия очистки осуществляется с помощью ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе. Недостатком этого метода является то, что только небольшая часть от исходной концентрации В-ХТ связывается с катио-нообменником в процессе хроматографии, а большее количество антигена утрачивается.
данного недостатка лишен способ, описанный в патенте РФ № 2456996 [3]. В предлагаемом способе получения очищенной В-ХТ применяют следующие последовательно сменяющиеся операции. Проводят глубинное культивирование рекомбинантного штамма V. cholerae KM93 - продуцента В-ХТ I типа [4, 8]. Источником В-ХТ служит фильтрат бульонной культуры указанного штамма. Из фильтрата бульонной культуры штамма осаждают общую белковую фракцию снижением рН до 4,0 в присутствии 0,25 % гекса-метафосфата натрия, перемешивая в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее отделяют осадок центрифугированием и суспендируют его в 0,1 М фос-
фатном буфере (рН 7,0). Затем полученную суспензию диализуют против 50 объемов 0,007 М фосфатного буфера (рН 7,0) в течение 24 ч и удаляют нерастворимые примеси центрифугированием. Полученный препарат подвергают гельпроникающей хроматографии на колонке с TSK-гелем HW-60 в три ступени. Элюцию осуществляют 0,007 М фосфатным буфером (рН 7,0), фракционируя по 5 мл. Фракции спектрофотометри-руют при 280 нм и анализируют в реакции иммуно-диффузии по Оухтерлони (РИД) с антисывороткой к В-ХТ. На второй ступени фракции, содержащие В-ХТ, объединяют, концентрируют и вновь наносят на колонку. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока В-ХТ не сходит с колонки одним самостоятельным пиком. Для этого требуется три ступени очистки на TSK-геле HW-60. Полученный целевой продукт диализуют против 0,9 % хлорида натрия, разливают в ампулы и лио-фильно высушивают.
Недостатком вышеуказанного способа, ограничивающим его использование для получения В-ХТ как компонента вакцины, является высокая продолжительность технологического процесса и большое количество стадий процесса.
одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях концентрирования и очистки антигенов, является использование метода тангенциальной фильтрации на установках с плоскорамными
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ
фильтрующими элементами [1, 6, 7, 9, 10].
Современный рынок предлагает достаточно широкий спектр биотехнологического оборудования и материалов для методов микро- и ультрафильтрации, обладающих различной производительностью, в том числе и отечественного (Справочник технического директора фармацевтического предприятия, 2009).
Все вышеперечисленное определило перспективность использования новых фильтрационных технологий и оборудования для разработки масштабированного способа получения В-ХТ.
материалы и методы
Исходным материалом для выделения В-ХТ являлись обработанные формалином центрифугаты бульонной культуры штамма V. cholerae КМ93 [4, 8], выращенных в пилотном и производственном биореакторах вместимостью 20 и 500 дм3 соответственно, на бульоне из ферментативного гидролизата казеина с 1 % раствора пептона. Очистку и концентрирование В-ХТ проводили с использованием установки для тангенциальной фильтрации на базе фильтродер-жателя АСФ-009 (Владисарт, Владимир).
Содержание В-ХТ определяли в РИД с антихо-лерогенной сывороткой (АХС) и иммуноферментным методом с GM1 ганглиозидами (GM^ELlSA) [14]. Иммунохимическую активность in vitro устанавливали с применением дот-иммуноанализа (ДИА), используя конъюгат диагностикума эритроцитарно-го холерного антительного с коллоидным золотом. Молекулярную массу определяли методом электрофореза по U.K.Laemmli [12] в 12 % полиамилакрид-ном геле в присутствии додецил сульфата натрия с использованием системы «Bio-Rad» (США) для белкового электрофореза и маркеров молекулярной массы «Fermentas» (Литва). Для обнаружения белков использовали окраску кумасси синим R-250. определение концентрации белка осуществляли по Лоури [13].
результаты и обсуждение
Технологический процесс фракционирования и концентрирования складывался из ряда последовательно выполняющихся операций:
- отделение балластных примесей методом тангенциальной микрофильтрации с использованием мембран с порогом отсечки 0,22 мкм. При этом целевым продуктом является фильтрат. кроме того, на данной стадии происходит полное удаление клеток холерного вибриона из В-ХТ;
- выделение В-ХТ методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе (НОММ) 100 кДа. В фильтрате, полученном после проведения процесса, отсутствует О-антиген;
- концентрирование В-ХТ методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с НОММ 10 кДа. После концентрирования В-ХТ проводится диафильтрация 10 объемами 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0±0,1.
По разработанной методике были получены 4
фракционирование и концентрирование безмикробного центрифугата штамма V. cholerae км93
Образец Белок, мг/мл РДП, титр GMjELISA, мкг/мл Объем, дм3
Сырье 0,64 1/2 2,65 14,0
0,2 мкм 0,2 1/2 2,65 14,0
100 кДа 0,18 1/2 2,65 14,0
10 кДа:
фильтрат 0,04 0 0 -
концентрат 3,0 1/16 20,1 2,0
концентрат после диафильтрации 0,33 1/16 20,1 2,0
экспериментально-производственные серии препара-
та В-ХТ, характеристика которых представлена ниже.
Анализируя данные таблицы, можно констатировать о том, что последовательное применение мембран 0,2 мкм и 100 кДа позволяет проводить очистку В-ХТ от балластных примесей без его потерь. Использование мембран 10 кДа позволяет проводить концентрирование и диафильтрацию В-ХТ с сохранением количества целевого продукта и его дополнительной очисткой.
Далее белковую фракцию, содержащую В-ХТ, осаждали из концентрата гексаметафосфатом натрия в кислой среде (рН 4,0±0,1). Для установки необходимого уровня рН использовали 18,5 % раствор соляной кислоты. После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре и 4 ч при 4 °С проводили центрифугирование при 12000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок растворяли в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0±0,1) и проводили диализ против 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,0±0,1) при 4 °С в течение 24 ч с последующим центрифугированием при 3000 об/мин для освобождения от нерастворен-ных частиц. Полученный препарат стерилизовали через фильтры 0,22 мкм и лиофильно высушивали.
содержание белка в сухом препарате в среднем составляло (82±2) %. Все серии препарата проявляли высокую иммунохимическую активность - титр в дот-иммуноанализе 1/512-1/1024 (0,5-1 мкг) (рис. 1).
В-ХТ представляет собой белок молекулярной массой 58 кДа, с мономерами молекулярной массой 11,6 кДа, которые образуют димеры, тримеры, тетра-меры и пентамеры, регистрируемые в электрофоре-тическом анализе. Используемый в работе рекомби-нантный штамм-продуцент синтезирует В-ХТ в виде пентамера, который в белковом электрофорезе регистрировался в виде полос с молекулярной массой 58 кДа и может содержать полосы с молекулярной массой 34, 23 кДа (рис. 2).
Иммунохимическая специфичность всех полученных серий В-ХТ была подтверждена в иммуно-
блоттинге со специфической поливалентной кроли-
--1
2 ;'(
3 '0 ф • # ф ф ф О О ф
4
Рис. 1. Дот-иммуноанализ серий В-субъединицы холерного токсина: 1 - серия 1; 2 - серия 2; 3 - серия 3; 4 - серия 4
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 4, 2015
HRIV
Рис. 2. Электрофореграмма (я) и иммуноблоттинг (б) серий В-субъединицы холерного токсина:
(я) окраска Кумасси 11-250: 1 - маркеры молекулярной массы «Регте^ав» (Литва); 2, 3 — серия 1; 4, 5 - серия 2; 6, 7 - серия 3; 8,9- серия 4. (б) 1 - серия 1; 2 - серия 2; 3 - серия 3:4 - серия 4
1 23456789 12
чьей сывороткой к В-ХТ (рис. 2).
По разработанной экспериментальной технологии из обработанной формалином центрифугата бульонной культуры штамма V. cholerae КМ93 в количестве 250 дм3, выращенного в производственном биореакторе, была получена серия В-ХТ с показателями, аналогичными при разработке технологии. Это дает основание для внедрения описанного способа получения В-ХТ в технологический процесс производства.
В подтверждение разработанных методических приемов говорят результаты иммунобиологической оценки препаратов В-ХТ, полученных различными способами: по предложенному в данной статье; полученный с помощью технологии дифференциальной ультрафильтрации; хроматографически очищенная В-ХТ. Было показано, что все препараты В-ХТ не токсичны для биомоделей и не вызывают в их органах и тканях значимых патоморфологических изменений, а также способны инициировать иммунитет по наличию синтеза антител к В-ХТ [5].
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Брахт К., Каталевский Е.Е., Савельева С.П. Фильтрация кросс-флоу. Фармацевтические технологии и упаковка. 2009;
2. Захарова Т.Л., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Получение очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae. Биотехнология. 2003; 5:53-56.
3. Захарова Т. Л., Киреев М.Н., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae. Патент 2456996 РФ. опубл. 27.07.2012 г. Бюл. № 21.
4. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIEM3, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae - продуцент В-субъ-единицы холерного токсина. Авторское свидетельство 1505022 СССР, опубл. 15.10.1991 г. Бюл. № 28.
5. Клюева С.Н., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А. Смирнова Н.И., Волох О.А., Захарова Т.Л., Белякова Н.И., Еремин С.А., Никифоров А.К. Иммунобиологическая характеристика В-субъединицы холерного токсина. Пробл. особо опасных инф. 2012; 3(113):67-70.
6. Комиссаров А.В Еремин С.А., Ульянов А.Ю., Алешина Ю.А., Никифоров А.К., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В Ннаба методом тангенциальной ультрафильтрации. Пробл. особо опасных инф. 2011; 3(109):75-7.
7. Комиссаров А.В., Еремин С.А., Алешина Ю.А., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Экспериментальная оценка использования метода ультрафильтрации по принципу «кросс-флоу» для концентрирования О-антигена в производстве холерной бивалентной химической вакцины. Пробл. особо опасных инф. 2011; 2(108):83-6.
8. Смирнова Н.И Крепостнова И М., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Еремин С.А., Ильина Т.С. Авирулентный штамм Vibrio cholerae - продуцент B-субъединицы холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2007; 4:7-13.
9. Arockiasamy A., Krishnaswamy S. Purification of integral
outer-membrane protein OmpC, a surface antigen from Salmonella typhi for structure-function studies: a methoa applicable to enterobacterial major outer-membrane protein. Anal. Biochem. 2000; 283(1):64-70.
10. Barrett P., Mundt W., Kistner O., Howard M. Vero cell platform in vaccine production: moving towards cell culture-based viral vaccines. Expert. Rev. Vaccines. 2009; 8:607-18.
11. Cholera vaccines: WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec. 2010, 85(13):117-28.
12. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of bacteriophage T4. Nature. 1970;
227:680-5.
13. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-75.
14. Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1978; 1:19-23.
References
1. Brakht K., Katalevsky E.E., Savel'eva S.P. [Cross-flow filtration]. Farmatsevt. Tekhnol. Upakovka. 2009; 6:47-51.
2. Zakharova T.L., Livanova L.F., Zadnova S.P., Smirnova N.I. [Production of purified cholera toxin B-subunit from recombinant Vibrio cholerae strain]. Biotekhnologia. 2003; 5:53-6.
3. Zakharova T.L., Kireev M.N., Livanova L.F., Zadnova S.P., Smirnova N.I. [Method for the production of purified cholera toxin B-subunit from recombinant Vibrio cholerae strain]. RF Patent 2456996, 27.07.2012.
4. Il'ina T.S., Smirnov G.B., Smirnova N.I., Livanova L.F. [Recombinant plasmid pIEM3 DNA, encoding cholera toxin B-subunit synthesis, method for its construction and Vibrio cholerae strain - producer of cholera toxin B-subunitj. USSR Certificate of Authorship 1505022. 15.10.1991.
5. Klyueva S.N., Shchukovskaya T.N., Shmel'kova T.P., Kravtsov A.L., Bugorkova S.A., Smirnova N.I., Volokh O.A., Zakharova T.L., Belyakova N.I., Eremin S.A., Nikiforov A.K. [Immunobiological characteristics of cholera toxin B-subunit]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; 3(113):67-70.
6. Komissarov A.V., Eremin S.A., Ul'yanov A.Yu., Aleshina Yu.A., Nikiforov A.K., Vasin Yu.G., Klokova O.D., Belyakova N.I. [Development of the experimental technology for protective antigens of Vibrio cholerae 569B Inaba concentration by means of tangential ultrafiltration]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; 3(109):75-7.
7. Komissarov A.V., Eremin S.A., Aleshina Yu.A., Vasin Yu.G., Klokova O.D., Beliakova N.I. [Experimental evaluation of application of "cross-flow" ultrafiltration method for O-antigen concentrating in cholera chemical bivalent vaccine production]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; 2(108):83-6.
8. Smirnova N.I., Krepostnova I.M., Livanova L.F., Zadnova S.P., Eremin S.A., Il'ina T.S. [Avirulent Vibrio cholerae strain - producer of cholera toxin B-subunit: engineering and molecular-genetic analysis]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2007; 4:7-13.
9. Arockiasamy A., Krishnaswamy S. Purification of integral outermembrane protein OmpC, a surface antigen from Salmonella typhi for structure-function studies: a method applicable to enterobacterial major outer-membraneprotein. Anal. Biochem. 2000; 283(1):64-70.
10. Barrett P., Mundt W., Kistner O., Howard M. Vero cell platform in vaccine production: moving towards cell culture-based viral vaccines. Expert. Rev. Vaccines. 2009; 8:607-18.
11. Cholera vaccines: WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec. 2010; 85(13):117-28.
12. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680-5.
13. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-75.
14. Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1978; 1:19-23.
Authors:
KomissarovA.V., Eremin S.A., Volokh O.A., Gromova O.V., Aleshina Yu.A., Kuznetsova E.M., Avdeeva N.G., Livanova L.F., Nikiforov A.K. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru
об авторах:
Комиссаров А.В., Еремин С.А., Волох О.А., Громова О.В., Алешина Ю.А., Кузнецова Е.М., Авдеева Н.Г., Ливанов Л.Ф.а, Никифоров А.К. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 03.04.14.
