CC BY
14
S.P.Zadnova, N.D.Issayev, N.P.Konnov, T.L.Zakharova, N.I.Smirnova.
i
Biochemical Analysis of Two Phenotypically Distinct Clones of Vibrio cholerae Strain Dakka 35 01
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Described in the work are the results of biochemical studies of two phenotypically distinct clones (toxinogenic and non-toxinogenic) of Vibrio cholerae Dakka 35 strain, classical biovariant, differing not only in the production of cholera toxin, but also in hemagglutinin/protease synthesis and
their motility characteristics. The non-toxinogenic clone was, for the first time, shown to contain an additional layer (polysaccharide in its nature) absent in toxinogenic clones, which could be associated with the alterations in colony morphology. These observations together with the ability of non-toxinogenic clones to produce an outer-membrane protein, OmpU, manifesting protective activities, may be suggestive of a possibility for such kind of clones to develop among the population of Dakka 35 strain due to the unfavourable environmental conditions outside the human organism.
Поступила 27.02.04
УДК 616.932.576.809.7
И.М.Кобкова, Л.Ф.Ливанова, А.В.Осин, Н.И.Смирнова
ПОЛУЧЕНИЕ АВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА 0139-СЕРОГРУППЫ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ИММУНОГЕННУЮ В-СУБЪЕДИНИЦУ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
С помощью конъюгационных скрещиваний на основе авирулентного штамма V. с!го1егае 170 Н1у~ 0139-серогруппы сконструирован штамм с высоким уровнем биосинтеза В-субъединицы холерного токсина и 0139-антигена, которые обеспечивают, соответственно, формирование антитоксического и антибактериального иммунитета при холере. Созданный штамм V. сНокгае 170 Н1у”(р1ЕМЗ) может быть использован в качестве носителя других генов протективных антигенов и в качестве продуцента для получения В-субъединицы холерного токсина, входящей в состав диагностических тест-систем, позволяющих выявлять токсигенные клоны холерно-
го вибриона разных серогрупп.
Неожиданное появление в 1992 г. в Индии и Бангладеш нового варианта возбудителя холеры 0139-серогруппы (синоним Бенгал), имеющего ранее неизвестные поверхностные антигены (0139-антиген и полисахаридную капсулу), обусловило необходимость создания холерных вакцин нового поколения, способных предотвратить возникновение эпидемий, вызванных бенгальскими штаммами [12, 15].
К настоящему времени уже описан ряд живых и инактивированных вакцин против холеры, вызываемых Vibrio cholerae 0139 [1, 7, 14]. Однако эти вакцины малоэффективны или характеризуются остаточной реактогенностью, вызывая у части вакцинированных развитие диареи.
Цель нашей работы - создание авирулентного штамма V. cholerae 0139 с высоким уровнем биосинтеза В-субъединицы холерного токсина, которая обеспечивает формирование антитоксического иммунитета при холере.
Материалы и методы
В работе использовали нетоксигенный штамм 0139-серогруппы V. cholerae 170 Н1у+ с полисахаридной капсулой, выделенный в 1999 г. из воды открытых водоемов (Московская обл.), а также штамм Escherichia coli KS164(pIEM3) KjnrTcr.
Для введения мутации в ген ЫуА клетки штамма V. cholerae 170 обрабатывали нитрозогуаниди-ном [6]. Присутствие в геноме штамма V. cholerae 170 генов вирулентности определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием различных пар праймеров для тестирования фрагментов генов ctxA, асе, zot и регуляторных ге-
нов 1срА, юхТ, юхЯ, ПхА, ИарА, а также нуклеотидной последовательности аШ181 [4, 8]. Конъюгаци-онные скрещивания, определение продукции В-субъединицы холерного токсина и 0139-антиге-на, резистентность штамма к антибиотикам, популяционный анализ осуществляли по общепринятым методам [3, 9].
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы с помощью ПЦР-ана-лиза определено отсутствие в хромосоме структурных генов МхА, асе, гог, кодирующих биосинтез различных токсинов и входящих в состав профага СТХ. Кроме того, в геноме не обнаружено присутствия генов 1срА, определяющих биосинтез второго ключевого фактора вирулентности - токсин-корегу-лируемых пилей адгезии, а также регуляторного гена юхТ, локализованных на острове патогенности УР! Этот штамм лишен и последовательности аКИЗ1.
Из анализа полученных данных очевидно, что из-за отсутствия токсин-корегулируемых пилей адгезии, служащих рецептором для фага вирулентности СТХф, а также аиЛБ 1 -сайта, штамм V. ско1егае 170 Н1у+не может реверсировать в токсигенный путем фаговой конверсии.
В то же время штамм V. сИо1егае 170 продуцировал значительное количество гемолизина, который согласно данным последних исследований, является сильным цитотоксином [5]. Для получения Н1у~-клона клетки штамма V. сНо1егае 170 Н1у+обработаны нитрозогуанидином. В результате среди выживших клеток был обнаружен штамм Н1у“, лишенный гемолитической активности (рис. 1). Этот штамм
Рис. 1. Продукция гемолизина штаммами V. cholerae:
1,2- 569В; J, 4 - 170 Н1у+; 5,6-170 Н1у‘; 7,5-Дакка35 Тох~; 9-26- 170 Н1у-(рГЕМЗ)
продуцировал достаточное количество 0139-антиге-на, так как титр развернутой реакции агглютинации клеток этого штамма с холерной поликлональной 0139-антисывороткой составил 1:800.
Для получения авирулентного штамма, продуцирующего не только 0139-антиген, который отвечает за образование антибактериального иммунитета при холере, но и В-субъединицу холерного токсина, формирующего антитоксический иммунитет, в клетки созданного штамма V. cholerae 170 Hly"Spr (спектиномициновая устойчивость была введена при использовании спонтанного мутагенеза) с помощью конъюгационного скрещивания была введена рекомбинантная плазмида рШМЗ, созданная ранее Т.С.Ильиной с соавт. [2], с геном В-субъедини-цы холерного токсина и маркированная геном резистентности к тетрациклину и канамицину. Плазмида р1ЕМЗ представляет собой конъюгативный коинте-грат, состоящий из двух плазмид pIEM ] (Km1) и рСТД27(Тсг).
Плазмида рСТД27 - производная плазмиды pBR322, несущая ген резистентности к тетрациклину (Тс1) и клонированный фрагмент хромосомы холерного вибриона биовара эльтор V. cholerae RV79 с геном ctxB, детерминирующим синтез В-субъеди-ницы холерного токсина. В качестве донора плазмиды использовали штамм Е. coli KS164(pIEM3). Контрселекция донорного штамма обеспечивалась наличием в среде спектиномицина (Sp1), к которому был чувствителен донор, но резистентен реципиент. В результате проведенного эксперимента установлено, что клетки штамма V. cholerae 170 Hly" Spr могут приобретать плазмиду с генами В-субъединицы холерного токсина в условиях in vitro с частотой 9-10-7. Все изученные Тсг-клоны оказались одновременно и Kmr. Такой фенотип трансконъюгантов (Kmr, Тс1) указывает на присутствие в клетках штамма V. cholerae 170 Hly' Spr коинтегрантной плазмиды
12 3 4
Рис. 2. Плазмидный состав трансконъюгантов V. cholerae 170 Н1у~(р1ЕМЗ), определенный по методу C.J.Kado и S.T.Liu [13]:
1 - V. cholerae 170 Hly ; 2-4 - V. cholerae 170 Н1у"(рГЕМЗ)
рШМЗ (Kmr, Тс1). Наличие плазмиды в клетках реци-пиентного штамма подтвердилось при изучении плазмидного профиля трансконъюгантов [13]. Оказалось, что в клетках изучаемого штамма плазмида рШМЗ сохраняется в автономном состоянии (рис. 2).
Для изучения экспрессии введенного в составе плазмиды гена ctxB у полученных трансконъюгантов была определена продукция В-субъединицы холерного токсина двумя способами - в РПИГ [10] (рис. 3) и ELISA [16]. Оказалось, что проверенные трансконъюганты V. cholerae 170(р1ЕМЗ) по уровню продукции В-субъединицы холерного токсина (в РПИГ) были неоднородны, о чем свидетельствует различная ширина зоны лизиса эритроцитов вокруг макроколоний (от 1 до 3,0 мм). Было отобрано два трансконъюганта, вокруг макроколоний которых формировались наибольшие зоны гемолиза, проверен их популяционный состав. В результате были отобраны клоны с однородной популяцией клеток, характеризующиеся высоким уровнем продукции секретируемой В-субъединицы и 100 % стабильностью наследования плазмиды рШМЗ.
Уровень продукции В-субъединицы холерного токсина у штамма V. cholerae 170(р1ЕМЗ) по данным ELISA составил 8,5-8,8 мкг/мл, что свидетельствует об активной экспрессии генов ctxB в клетках авирулентного штамма.
Далее, полученные клоны проверяли на стабильность наследования рекомбинантной плазмиды вибрионами в условиях как in vitro, так и in vivo. С этой целью клетки выращивали в течение 24-72 ч в жидкой питательной среде без антибиотиков, пересевали на твердые питательные среды до получения моноколоний. Проверка 300 полученных трансконъюгантов на резистентность к тетрациклину показала, что стабильность наследования плазмиды рШМЗ в указанных условиях культивирования составила 100 %.
Рис. 3. Продукция В-субъединицы холерного токсина, определенная с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза штаммом V. cholerae 170 Н1у~, содержащим рекомбинантную плазмиду, определяющую биосинтез В-субъединицы холерного токсина:
1-2- V. cholerae 569В; 3-49 - V. cholerae 170 Н|у"(р1ЕМЗ)
В связи с большой важностью вопроса о сохранении плазмиды рГЕМЗ в клетках штамма V. cholerae 170(рШМЗ) в условиях in vivo мы определили наследование указанной плазмиды при пассировании в организме кроликов-сосунков. С этой целью названные биомодельные животные заражались исследуемым штаммом в дозе 109 м. к. При последующем высеве из тонкого и толстого кишечника вибрионов на простые среды со спектиномицином были получены изолированные колонии. Всего выделено 235 колоний из толстого кишечника и 182 колонии из тонкого, которые затем проверены на резистентность к тетрациклину. Установлено, что плазмида в этом случае сохраняется в 85 % случаев. Из этого следует, что стабильность наследования плазмиды с генами В-субъединицы холерного токсина вибрионами в условиях in vivo также высока.
Принимая во внимание тот факт, что при введении в авирулентный штамм V. cholerae 170 Н1у“ рекомбинантной плазмиды существует теоретическая возможность изменения экспрессии собственных генов этого штамма, включая и ранее неактивные дополнительные гены патогенности на биомодели, была определена безвредность сконструированного штамма V. cholerae 170(р1ЕМЗ) [11]. Использовали крольчат-сосунков, которым внутрики-шечно вводили клетки штамма V. cholerae 170 (рШМЗ) в дозах МО9 и 5-109. Установлено, что при введении данного штамма не наблюдалось развития диареи или гибели животных. У всех забитых через '4 сут животных в просвете кишечника было минимальное количество обычного по консистенции содержимого. На серозной и слизистой оболочках отсутствовали кровоизлияния. Поверхность слизистой выглядела бархатистой. Пейеровы бляшки не реду-
цированы. Анализ полученных данных указывает на безвредность сконструированного штамма V. cholerae 170 Н1у“(рШМЗ).
Таким образом, из полученных данных следует, что авирулентный штамм 0139-серогруппы V. cholerae 170(р1ЕМЗ) не содержит основных генов вирулентности, авирулентен для лабораторных животных, обладает высоким и стабильным уровнем продукции В-субъединицы холерного токсина, а также 0139-антигена, которые, соответственно, обеспечивают формирование антитоксического и антибактериального иммунитета при холере. Указанные свойства штамма позволяют использовать его в качестве носителя других генов протективных антигенов для создания на его основе живых оральных вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V. cholerae 0139. Кроме того, штамм может использоваться в качестве продуцента для получения В-субьединицы холерного токсина, входящей в состав диагностических тест-систем, позволяющих выявлять токсиген-ные клоны холерного вибриона разных серогрупп.
Работа частично поддержана грантом Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1531.2003.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Громова О.В., Дятлов И.А.//Холера. Матер. УШ Российск. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д., 2003. - С. 227-229. - 2. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий V. cholerae продуцент В-субъединицы холерного токсина. А.С. № 1505022 от 18.09.87 г.- 3. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. - М: Мир. - 1976. - 436 с. - 4. Осин А.В. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов. - 2002. - 12 с. - 5. Телесманич Н.Р., Ми-шанькин М.Б. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д., 2002. - Вып. 15. - С. 46-49. - б. Adelberg Е.А., Mandel М., Chen G.G. И Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1965. - Vol. 18, N 5. - P. 788-795.-7. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. et al.ll Lancet. - 1993. -
8.Boyd E.F., Heilpern J., Waldor M.K.//J. Bacteriol. -2000. - Vol. 182, N 19 - P. 5530-5538. - 9. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R.//J. Bacteriol. - 1980. - Vol. 143, N3.-P. 1466-1470.-10. Bramucci M.G., Holmes R.K.//J. Clin. Microbiol. - 1978. - Vol. 2, N 2. - P. 252-255. - 11. Dutta N.K., Habbu M.K. // Brit. J. Pharmacol. - Vol. 25.6, N23. -P. 12252-12256. - 12. Farfan М., Minina-Galbis D., Fuste M.C. et al. II J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 184, N 5. - P. 1304-1313,- 13. Kado C.I., Liu S.T. // J. Bacteriol. - 1981. -Vol..145, N3.- P. 1365-1373. - 14. Mel S.F., Fullner K.J., Wimer-Mackin S. // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68. -P. 6487-6492. - 15. Ramamurthy Т., Garg S., Sharma R. et al. II Lancet. - 1993. - Vol. 341. - P. 703-704. - 16. Svenner-cholm A.M., Wiklung G. t! J. Clin. Microbiol. - 1983. — Vol. 17.-P. 262-270.
I.M.Kobkova, L.F.Livanova, A.V.Ossin, N.I.Smimova
Obtaining of an Avirulent Vibrio cholerae Strain, Serogroup 0139, Producing Cholera Toxin Immunogenic B-Subunit
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
A cholera vibrio strain producing high levels of cholera toxin B subunit and antigen 0139 which promote the formation of anticholera antitoxic and antibacterial immunity, respectively, was constructed by the method of
conjugative crossing on the basis of V. cholerae avirulent strain 170 Hly‘ eluded into diagnostic test systems designed to detect toxigenic V. cholerae
serogroup 0139. V. cholerae 170 Hly' (рГЕМЗ) strain thus obtained, can be strains among various serogroups.
used as a carrier for other genes coding for protective antigens, and as a
producing strain that is capable of synthesizing cholera toxin В subunit in- Поступила 16.02.04
УДК 616.981.51
А.Ю.Корсакова, Н.И.Микшис, Ю.А.Попов, Н.П.Коннов, М.Н.Киреев, Н.А.Подборонова, Т.А.Полунина, О.В.Новикова, О.М.Кудрявцева
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ Б-СЛОЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Осуществлено выделение белков с молекулярной массой 94 кДа из культуральных фильтратов и клеточных стенок бесплазмидных штаммов возбудителя сибирской язвы. Проведена идентификация выделенных белков биохимическими и электронно-микроскопическими методами. Установлено, что выделенные белки являются
компонентами S-слоя Bacillus anthracis.
Введение
Bacillus anthracis - возбудитель острой зооан-тропонозной инфекции, представляет собой грампо-зитивные спорообразующие бактерии, синтезирующие токсин и капсулу. Помимо капсулы, вегетативные клетки сибиреязвенного микроба окружены S-слоем. Наличие S-слоя характерно для многих представителей бактериальных видов. Его функции состоят в сохранении формы клеток, защите от агрессивных факторов среды, участии в молекулярной адгезии и фильтрации, во взаимодёйствии с клетками про- и эукариот [5, 11, 12].
S-слой возбудителя сибирской язвы составляет почти 10 % от всей массы клеточного белка и представлен двумя белками, обозначенными Sap и ЕА1 [6, 9]. Белки S-слоя В. anthracis имеют одинаковую молекулярную массу - 94 кДа. Их синтез детерминирован хромосомными генами sap и eag, идентифицированными Etienne-Toumelin I. et al. в 1995 г. [6]. Установлено, что белки Sap и ЕА1 последовательно присутствуют на клеточной поверхности. На начальных стадиях роста синтезируется Sap, затем в течение стационарной фазы роста сибиреязвенного микроба происходит замещение Sap на ЕА1 и выделение Sap в супернатант [6, 10, 11]. По данным ряда авторов, антигены S-слоя В. anthracis обладают им-муногенными свойствами и, следовательно, могут быть использованы в создании сибиреязвенных вакцин [4, 7, 11].
Задачей настоящего исследования было получение в препаративных количествах очищенных белков S-слоя В. anthracis с целью дальнейшего их использования в конструировании диагностических и профилактических препаратов.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использованы бесплазмид-ный производный вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2 - В. anthracis Sterne 34F2AT (рХОГ рХ02~) и его протеазонегативный дериват - В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ (Государственная коллекция
патогенных бактерий «Микроб», Саратов).
Питательные среды. В качестве питательных сред использовали L-агар («Difco», США) и среду, предложенную J.Farchaus et al. [8] для выращивания культур при выделении белков S-слоя (S-бульон).
Лабораторные животные. В работе использовали кроликов весом около 2 кг.
Выделение и очистка белка Sap. Выделение и очистку белка Sap проводили согласно процедуре, описанной J.Farchaus et al. [8].
Выделение и очистка белка ЕА1. Штамм
В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ выращивали в S-бульоне 16 ч с аэрацией при 37 °С. Затем бульонную культуру центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин и температуре 4 °С, отбирали супернатанты, а осадки обрабатывали по методу, предложенному J.Ezzel, T.Abshire [7]. Супернатант, содержащий экстрагированный белок, фильтровали через мембранные фильтры (Millipore, 0,22 мкм) и подвергали процедуре осаждения и очистки по М.В.Безносову [1] с собственными модификациями. Экстракт диализовали при 4 °С в течение суток с периодической сменой буферного раствора, содержащего 0,1 М Трис-гидрохлорида и ингибиторы протеаз (pH 8,0). Затем белки сорбировали на гид-роксиапатите (Bio-Rad) в течение 1 ч при 4 °С. Элюцию очищенного белка ЕА1 проводили градиентом концентрации фосфата фосфатного буфера. На последнем этапе препарат диализовали против бидистиллированной воды в течение ночи при 4 °С.
Электрофорез выделенных белков проводили в течение 5 ч в 10 % полиакриламидном геле.
Негативное контрастирование препаратов белков S-слоя для электронной микроскопии. Перед электронной микроскопией дополнительно проводили диализ очищенных препаратов белков Sap и ЕА1 против 10 мМ фосфатного буфера (pH 8,0) - в течение ночи при 4 °С, а затем против 5 мМ ацетата натрия (pH 5) в течение ночи при 4 °С. Очищенный диализом препарат центрифугировали, осадок ре-суспендировали в первом диализном буфере, и разводили 1:10 тем же буфером. Подготовленный таким образом препарат наносили на сетку с углерод-
