CC BY
50
УДК 616.932:576.809.7
Т.Л.Захарова, С.П.Заднова, Л.Ф.Ливанова, М.Н.Киреев, Н.И.Смирнова
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ НЕСКОЛЬКИХ ОЧИЩЕННЫХ ОСНОВНЫХ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Предложен способ выделения и очистки одновременно трех ключевых факторов патогенности холерного вибриона (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1-антигена Инаба или Огава), являющихся и основными протективными антигенами, из сконструированных ранее рекомбинантных штаммов Vibrio cholerae 2415 серовара Инаба и КМ 206 серовара Огава. Иммунологическая активность препаратов подтверждена поликлональными высокоактивными специфическими антисыворотками, полученными на их основе. Очищенные антигены могут быть использованы для создания и усовершенствования профилактических и диагностических препаратов.
Ключевые слова: рекомбинантные штаммы Vibrio cholerae, протективные антигены, очистка, антисыворотки, специфичность.
Проблема борьбы с холерой - опасной эпидемической болезнью, причиной смертности людей во многих странах, не перестает быть актуальной. В последнее время эпидемическая обстановка по холере во всем мире усложнилась за счет формирования новых эндемичных очагов в Азии и Африке [4]. В связи с этим, а также с усиленной миграцией населения возрастает возможность проникновения возбудителя этой особо опасной инфекции в Россию. Очевидна необходимость создания более эффективных средств и методов диагностики и профилактики холеры.
В процессе эволюции возбудителя холеры в пределах вида образовалось три эпидемически опасных варианта с разным сочетанием генов патогенности и иммуногенности: холерные вибрионы О1-серогруппы классического биовара сероваров Огава и Инаба, вызвавшие первые шесть пандемий азиатской холеры (с 1817 по 1923 год); холерные вибрионы О1-серогруппы биовара эльтор сероваров Инаба и Огава - возбудителя текущей 7-й пандемии (с 1961 г. по настоящее время) и внезапно появившиеся в 1992 г. высоковирулентные штаммы Vibrio cholerae О139 серогруппы [8]. В системе эпидемиологического надзора за холерой важнейшее значение имеет не только своевременное выделение штаммов холерного вибриона, но и оценка их эпидемической значимости, основанная на определении продукции основных факторов патогенности.
К наиболее значимым факторам патогенности холерного вибриона, являющимся и важными протективными антигенами, относятся холерный токсин (ХТ), вызывающий развитие диареи (основного клинического симптома при холере); токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА) - основной фактор колонизации холерного вибриона; основной соматический антиген О1 (сероваров Инаба и Огава) и О139 серогрупп [8]. Данные антигены формируют соответственно антитоксический, антиколонизирующий и антибактериальный иммунитет при холере.
В ранее проведенных исследованиях сконструи-
рованы рекомбинантные штаммы V. ско!ете, имеющие высокий уровень синтеза основных протектив-ных антигенов - ХТ, ТКПА и О1-антигена [6, 12]. В результате введения в клетки природных токси-генных штаммов V. сholerae 569В Инаба и Дакка 35 Огава рекомбинантной плазмиды рСТ105 с клонированными генами с^ЛБ продукция ХТ возросла более чем в четыре раза. Присутствие в клетках указанной плазмиды не только обусловило активный синтез ХТ, но и привело к повышению продукции ТКПА за счет увеличения экспрессии глобального регуляторного гена ^охЯ. Полученные штаммы обладают также повышенным уровнем экспрессии гена м>Ъе, кодирующего синтез О1-антигена. Эти свойства позволяют использовать их в качестве продуцентов всех трех указанных протективных антигенов одновременно. Наличие рекомбинантных штаммов О1-серогруппы сероваров Инаба и Огава дает возможность получать тот или иной серовар О1-антигена в зависимости от выращиваемого штамма.
Разработка эффективной технологии получения протективных антигенов в чистом виде является важнейшей задачей, так как очищенные антигены могут быть использованы для создания и усовершенствования профилактических и диагностических препаратов.
Цель данной работы - выделение и очистка трех основных протективных антигенов (ХТ, ТКПА и О1-антигена) из одного рекомбинатного штамма холерного вибриона при однократном выращивании.
Материалы и методы
В работе использованы следующие сконструированные ранее рекомбинантные штаммы V. ско!ете: 2415, классический биовар, О1-серогруппа серо-вара Инаба, содержащий рекомбинантную плазмиду рСТ105::тт>кап (Кта, Тса) с клонированными структурными генами ЛБ, кодирующими ХТ [12];
КМ 206 (2416), классический биовар, О1-серогруппа
серовара Огава, полученный в результате элиминации плазмиды pCT105::mini-kan из плазмидного клона Дакка 35 (pCT105::mini-kan).
Штаммы имеют повышенную экспрессию резидентных генов ctxAB, tcpA-F и wbe, кодирующих соответственно ХТ, ТКПА и О1-антиген [6]. Штаммы депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».
Выращивание штаммов проводили в бульоне LB (pH 6,8) при температуре 30 °С методом глубинного культивирования с аэрацией в ферментере «New Brnnsvik» (США) в течение 10 ч.
Источником ХТ и О1-антигена служил обработанный формалином центрифугат жидкой культуры указанных штаммов. Для выделения ТКПА использовали бактериальную массу. Технология выделения ХТ состояла из осаждения белка с помощью модифицированной процедуры, описанной в [11], и последующей очистки методом ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе [10].
Препараты О-антигена О1 серогруппы серова-ров Инаба и Огава получали с помощью поэтапного выделения растворенного в культуральной среде антигена. Культуральную жидкость подвергали мембранной ультрафильтрации и проводили разделительную хроматографию на TSK-геле HW-60 (Toyo Soda MFG, Co LTD, Япония) [1].
Выделение белка пилей (ТКПА) проводили по разработанной ранее методике [2]. Содержание белка в пробах контролировали методом Лоури, количество полисахарида определяли с помощью тимолового реактива. Специфическую активность очищенных антигенов определяли в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) [3]. Изучение белкового состава выделенных и очищенных протективных антигенов проводили, используя электрофорез в полиакриламидном геле [9].
Кроличьи антисыворотки к выделенным и очищенным препаратам протективных антигенов (ХТ, ТКПА, О1-антигену сероваров Инаба и Огава) получали с помощью модифицированных нами методов иммунизации [5, 7, 13]. Каждым препаратом иммунизировали группу из пяти кроликов породы шиншилла массой 2,5 кг. Антисыворотки к ХТ получали двукратной иммунизацией животных с интервалом в один месяц путем введения 200 мкг очищенного препарата. Антисыворотку к О1-антигену сероваров Инаба и Огава получали путем 3-кратной иммунизации кроликов с интервалами в 4 дня нарастающими дозами антигена (50, 100, 150 мкг). Через 7 дней проводилась повторная 3-кратная иммунизация большими дозами препарата (400-500 мкг) с интервалами в 1 день. Антисыворотку к ТКПА получали 4-кратной внутривенной иммунизацией возрастающими дозами антигена (100, 150, 200 и 250 мкг) с интервалом в 7 дней. Антигенную активность полученных сывороток определяли в РИД с соответствующими очищенными препаратами антигенов.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы были подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие эффективную продукцию штаммами V. cholerae КМ 206 и 2415 всех трех основных протективных антигенов (ХТ, ТКПА, О1-антигена) в производственных условиях, что позволило получить достаточное количество бактериальной массы и супернатанта.
Штамм V cholerae КМ 206 (2416) использовали для выделения ХТ, ТКПА и О1 антигена серовара Огава. О1 антиген серовара Инаба получали из культуры штамма V. cholerae 2415, который также является продуцентом и ХТ, и ТКПА.
Получение очищенных антигенов начинали с выделения ХТ. Для этого белковые фракции из фильтрата бульонной культуры, предварительно обработанного формалином (0,25 %), осаждали в присутствии 0,25 % гексаметафосфата натрия при рН 4,0, перемешивая в течение 2 ч при комнатной температуре. Осадок собирали центрифугированием, растворяли и диализовали против 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,0. Очистка препарата методом ионообменной хроматографии основана на способности ХТ связываться с фосфоцеллюлозой при рН 7,0. Для этого препарат наносили на предварительно подготовленную колонку с обработанной и уравновешенной тем же буфером фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman). Адсорбированный на колонке ХТ элюировали 0,2 М фосфатным буфером, рН 7,4. Профиль элюции имел два пика: пик 1 появлялся в уравновешивающем 0,01 М буфере при рН 7,0, а пик 2 элюировался после изменения молярности и рН буфера. ХТ содержался во 2-м пике, что подтверждалось положительным результатом РИД с антитоксической сывороткой. Фракции 2-го пика объединяли и диализовали против 0,9 % раствора хлорида натрия с 0,02 % азида натрия в качестве консерванта. Выход очищенного токсина от общего количества белка в исходном препарате составил 12 %.
Специфическую активность полученного ХТ определяли в РИД с моноспецифической антитоксической сывороткой. Полученный токсин образовывал одну линию преципитата, титр реакции составлял 1:64 (3 мкг/мл). Чистоту и гомогенность препарата контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Результаты показали, что в очищенном нами препарате обнаруживались две белковые полосы, идентичные по расположению А-(27,2 кДа) и В-субъединице (58 кДа) коммерческого препарата ХТ (Sigma, США) (рис. 1).
Для получения препаратов О1-антигена Огава и О1-антигена Инаба применяли способ поэтапного выделения растворенного в культуральной среде антигена, позволяющий сохранить антиген на всех этапах очистки в нативном растворенном виде, избегая изменения его фазового состояния, которое происходит при общепринятых методах выделения
1 2 3
В субъединица
А субъединица
Рис. 1. Электрофореграмма очищенного препарата холерного токсина
1 - маркеры молекулярной массы (150, 100, 75, 50, 35, 25, 15 кДа);
2 - очищенный препарат холерного токсина; 3 - холерный токсин
(фирма Sigma, США), содержащий B- субъединицу 58 кДа и A - 27,2 кДа
О-антигена (например, при фракционировании сульфатом аммония).
Фильтрат бульонной культуры штаммов после осаждения белковых фракций (из которых был выделен ХТ) выдерживали 30 сут при температуре 8-10 °С для снижения токсичности. Затем использовали ультрафильтрационную установку АУФ-01 (Россия) с полыми волокнами, осуществляющую частичную очистку центрифугата мембранной ультрафильтрацией (с удалением частиц молекулярной массы менее 100 кДа) и его одновременное концентрирование в 5-10 раз. Полученный концентрат анализировали на содержание О-антигена и очищали на колонке с TSK-гелем HW-60 при рН 7,2. О-антиген обнаруживался в первом пике (рис. 2).
Очищенные препараты О-антигена содержали от 14 до 16 мкг/мл полисахаридов, специфическая активность в РИД с соответствующими О-сыворотками составляла 1:64.
Чистоту полученных препаратов О-антигена проверяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Выделенные прапараты содержали только полисахариды О антигена без примесей белков.
Пили отделяли от клеток с помощью встряхи-вателя (Vortex) со скоростью 2500 об/мин. Для освобождения от балластных белков препарат, содержащий ТКПА, растворяли в 125 мМ этаноламине (рН 10,5) при 4 °С и диализовали против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4). Выход продукта составлял в среднем 6,3 %.
По данным белкового электрофореза (рис. 3), выделенный препарат кроме ТКПА содержал белок внешней мембраны OmpU, который также обладает адгезивными свойствами. Методом иммуноблоттинга с коммерческой сывороткой к основной субъединице токсин-корегулируемых пилей адгезии - ТсрА было подтверждено присутствие в препарате иммунологически активной полосы, соответствующей субъединице пилей ТсрА с молекулярной массой 20,5 кДа.
ОГІ280
1 . 1 1
2 А
1 / \
і
Номер фракции
Рис. 2. Гель-фильтрация препарата О1 антигена из штамма V еНо1егае КМ 2415 на колонке TSK-геля Б^60.
О1-антиген V. еНо1егае содержится в пике 1
По оси ординат - элюция препарата при X 280 нм
Иммунологическую активность выделенных очищенных препаратов протективных антигенов (ХТ, ТКПА, О1-антигена сероваров Инаба и Огава) подтверждали получением кроличьих антисывороток. Животных иммунизировали по разработанным ранее схемам, описанным в разделе «Материалы и методы».
Антигенную активность приготовленных антисывороток определяли в РИД с соответствующими очищенными препаратами протективных антигенов. Было установлено, что антитоксическая сыворотка образовывала линию преципитации в разведениях 1:64 - 1:128, сыворотка против ТКПА - 1:32, сыворотки против О1-антигена Инаба и Огава - 1:16 -1:32. Эти данные указывают на способность выделенных протективных антигенов образовывать специфические антитела в достаточно высоких титрах.
Поскольку полученные нами антисыворотки к О1-антигену серовара Инаба (АС) и Огава (АВ),
OmpU
ТКПА
1 2 3
Рис. 3. Электрофореграммы лизата клеток штамма - продуцента протективных антигенов и выделенного из него белкового препарата, содержащего токсин-корегулируемые пили адгезии
1 - маркер молекулярной массы - 17,8 кДа; 2 - белковый препарат из V еНо1егае КМ206; 3 — общая белковая фракция штамма
V еНо1егае КМ206
помимо специфических антител к антигенам С или В, содержали антитела к общему антигену А, то на следующем этапе была проведена работа по их удалению. Для этого сыворотки Инаба адсорбировали клетками штаммов V. cholerae М41 и R3122 серо-вара Огава, а сыворотки Огава - клетками штамма V. cholerae 569В серовара Инаба. После проверки полученных антисывороток в развернутой реакции агглютинации установлено, что антисыворотки Инаба агглютинировали только клетки штаммов V. cholerae серовара Инаба в диагностическом титре 1:400, а антисыворотки Огава реагировали лишь с клетками штамма V. cholerae серовара Огава (диагностический титр 1:800).
Результатом этого этапа работы явилось получение поликлональных антисывороток, содержащих в высоком титре специфические антитела к антигенам - ХТ, ТКПА, О1 антигену сероваров Инаба и Огава.
Таким образом, использование сконструированных ранее рекомбинантных штаммов V. смієте позволило за один цикл выращивания выделить и очистить модифицированными нами эффективными способами три основных протективных антигена - ХТ, ТКПА и О1-антиген, а также получить на их основе поликлональные высокоактивные специфические антисыворотки. Наличие рекомбинантных штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава О1 се-рогруппы с повышенной продукцией основных про-тективных антигенов дает возможность получать тот или иной серовар О1-антигена в зависимости от используемого штамма.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. и др. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических антисывороток. Биотехнология. 2002; 2:42-6.
2. ЗадноваС.П., ТопорковА.В.,НовиковаО.В., СмирноваН.И. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона. Биотехнология. 2003; 1:79-84.
3. Иммунологические методы. Под ред. Г.Фримеля. М.: Медицина; 1987. 471 с.
4. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др. Холера в начале XXI века, прогноз. Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунобиол. 2005; 3:44-8.
5. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М.,
Богоявленская Л.Б. Научные основы производства диагностических препаратов. Киев: Наукова думка; 1980. 195 с.
6. Топорков А.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM 206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов. Патент РФ 2222594, C12N 1/21 A61 K39/106//(C12N 1/21 C12R 1:63), 2004.
7. Шагинян И.А., Маракуша В.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки. Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол. 1983; 2:92-6.
8. Kaper J.B., Morris J.G., LevinM.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-89.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the head of the bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(15):680—5.
10. Mekalanos JJ., Collier R.J., Romig W.R. Purification of cholera toxin and its subunits: new methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants. Infect. Immun. 1978; 20:552—9.
11. Rappoport R.S., Bonde G., McCann T. et al. Development of a purified cholera toxoid. Infect. Immun. 1974; 9:304—17.
12. Smirnova N., Zadnova S.P., Toporkov A.V., Kutyrev V.V. Construction of strains producting the main protective antigens of Vibrio cholerae based on altered expression of the global regulatory gene toxR. In: New Research on Biotechnology and Medicine. A.M.Egorov, G.E.Zaikov, editors. New York; 2006. P 177—88.
13. Sun D., Mekalanos J.J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model. J. Infect. Dis. 1990; 161:1231—6.
Об авторах:
Захарова Т.Л., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Киреев М.Н., Смирнова Н.И. Российской научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, Университетская, 46. Тел.: (845-2) 26-21-31. E-mail: [email protected]
T.L.Zakharova, S.P.Zadnova, L.F.Livanova, M.N.Kireev, N.I.Smimova
Recombinant Strains Application for Simultaneous Preparation of Several Purified Cholera Vibrio Antigens
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
Proposed is the method for simultaneous isolation and purification of three cholera vibrio key pathogenicity factors (cholera toxin, toxin-co-regu-lated adhesion pili, O1 antigen Ogawa or Inaba), which are main protective antigens, from previously constructed recombinant Vibrio cholerae strains 2415 Inaba and KM 206 Ogawa. Immunologic activity of the preparations was confirmed using polyclonal high-active specific antisera. Purified antigens can be used for creation and improvement of prophylactic and diagnostic preparations.
Key words: recombinant Vibrio cholerae strains, protective antigens, purification, antisera, specificity.
Authors:
Zakharova T.L., Zadnova S.P., Livanova L.F., Kireev M.N., Smirnova N.I. Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: [email protected]
Поступила 11.11.08.
