CC BY
39
чительное изменение размера (структуры) ЛПС не только в сторону увеличения [9, 12], но и уменьшения может изменить фолдинг и, соответственно, биологические свойства Pla. Как мы и предполагали, редукция кора ЛПС Y. pestis приводила к исчезновению плазмокоагулазной и фибринолитической активностей у мутантов с нарушениями сборки олигосахарида на стадии присоединения первой и второй L-a-D-Hep.
Таким образом установлено, что укорочение коровой части ЛПС Y. pestis ведет к исчезновению фибринолитической и плазмокоагулазной активностей, тогда как снижение степени ацилирования липида А не влияет на эти свойства.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-49280-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимов А.П. // Мол. генет. - 2002. - № 3. - С. 323. - 2. Еремин С.А., Дроздов И.Г., Ежов И.Н. и др. // Генет., микробиол. и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасных инф. - Саратов, 1991. - С. 55-62. - 3. Руковод -ство по профилактике чумы / Под ред. Н.И.Николаева. - Саратов, 1972. - 200 с. - 4. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Titareva G.M. et al. // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73. -P. 7324-7331. - 5. De Cock H., Brandenburg K., Wiese A. et al. // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 5114-5119. - 6. Ka-wahara K., Tsukano H., Watanabe H. et al. // Infect. Immun. - 2002. - Vol. 70. - P. 4092-4098. - 7. Knirel Y.A., Lind-
ner B., Vinogradov E.V. et al. // Biochemistry. - 2005. -Vol. 45. - P. 1731-1743. - 8. Kukkonen M., Korhonen T.K. // Int. J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol. 294. - P. 7-14. -9. Kukkonen M., Suomalainen M., Kyllonen P. et al. // Mol. Microbiol. - 2004. - Vol. 51. - P. 215-225. - 10. Lah teenmaki K., Kuusela P., Korhonen T.K. // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 25. - P. 531-552. - 11. Laird M.W., Klo-ser A.W., Misra R. // J. Bacteriol. - 1994. - Vol. 176. -P. 2259-2264. - 12. Pouillot F., Derbise A., Kukkonen M. et al. // Microbiology. - 2005. - Vol. 151 (Pt 11). - P. 3759-3768.
S.V.Dentovskaya, M.E.Platonov, I.V.Bakhteyeva, A.P.Anissimov
The Presence of the Complete Lipipolysaccharide Core Structure is Necessary for the Activation of Yersinia pestis Plasminogen
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Lipopolysaccharide (LPS) S-form has previously been shown to inhibit plasminogen activator (Pla) potency in Yersinia pestis. We tried to comparatively estimate the fibrinolytic and plasmocoagulase Pla activities in Y. pestis isolates carrying mutations in the genes responsible for LPS biosynthesis as contrasted to those of the original strain. Shortening of the core LPS was shown to result in the loss of the activities while reduced levels of lipid A acylation produced no effect on the fibrinolytic and plasmocoagulase activities.
Key words: Y. pestis, fibrinolytic and plasmocoagulase activities,
LPS.
Поступила 14.09.06.
УДК 616.932:616-097
С.П.Заднова, О.А.Волох, И.М.Крепостнова, Е.Ю.Щелканова, Л.Ф.Ливанова, Т.Л.Захарова,
И.А.Шепелев, С.А.Еремин, Н.И.Смирнова
ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ РАЗЛИЧНЫМИ ШТАММАМИ VIBRIO CHOLERAE ПРИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Для получения в очищенном виде основных факторов патогенности и иммуногенности - холерных токсинов I и II типов, В-субъединицы холерного токсина II типа, токсин-корегулируемых пилей адгезии, а также О1 и О139 антигенов было проведено малообъемное культивирование сконструированных ранее штаммов V. cholerae О1 (классического и эльтор биоваров), О139, не О1/не О139 серогрупп в условиях производства. В результате отобраны штаммы-продуценты протективных антигенов, предпочтительные для производства и определены оптимальные условия их культивирования для активной экспрессии указанных белков и липополисахаридов, которые будут использованы при создании многокомпонентной диагностической тест-системы.
Ключевые слова: штаммы-продуценты V. cholerae, протективные антигены, малообъемное культивирование.
Холера - острое инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae и широко распространенное в различных странах Азии и Африки. В настоящее время в связи с интенсивным развитием туризма и миграцией населения существует реальная возможность ее завоза на территорию Российской Федерации, о чем свидетельствуют вспышки заболевания в различных регионах страны (Дагестан и Чеченская Республика, 1994; Дагестан, 1998; Приморский край и Сахалинская область, 1999; Астраханская область, Челябинск, 2000; Республика Татарстан, 2001; Краснодарский край, Башкорто-
стан, 2004 и т. д.) [3].
Как известно, в процессе эволюции V. cholerae сформировалось три эпидемически опасных варианта - холерные вибрионы О1 серогруппы классического и эльтор биоваров (сероваров Инаба, Огава, Гикошима) и холерные вибрионы О139 серогруппы [9]. Основными факторами патогенности и иммуногенности холерных вибрионов являются секретируе-мый в среду выращивания или наружу холерный токсин (ХТ), состоящий из А-субъединицы, отвечающей за токсическую активность молекулы, и пяти иммуногенных В-субъединиц, а также располо-
женные на поверхности клетки токсин-корре-гулируемые пили адгезии (ТКПА) и О-антиген, отвечающие соответственно за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. В настоящее время при выделении холерных вибрионов разных серогрупп и биоваров из объектов внешней среды или людей для определения их эпидемической значимости устанавливают наличие в их геноме основных структурных и регуляторных генов патогенности, поскольку инфекционный процесс при холере обусловлен продуцируемыми патогеном факторами вирулентности, обладающими иммуногенными свойствами. В связи с этим встает вопрос о создании многокомпонентной диагностической тест-системы, необходимой для изучения экспрессии основных генов патогенности и включающей очищенные О1 и О139 антигены, ток-син-корегулируемые пили адгезии, холерный токсин классических (I тип) и эльтор (II тип) вибрионов и антисывороток к ним. При добавлении в систему очищенной В-субъединицы ХТ и антисыворотки к ней данный диагностический препарат можно будет использовать для оценки качества холерных химических вакцин и мониторинга поствакцинального иммунитета у иммунизированных людей. Сконструированные нами и изученные в лабораторных условиях штаммы холерного вибриона разных серогрупп и биоваров, являющиеся продуцентами различных факторов патогенности и иммуногенности (ХТ I и II типа, ТКПА, О1 и О139 антигенов) [1, 4, 6, 7, 8], в значительной мере могут способствовать решению данного вопроса.
Цель данной работы заключалась в выборе штаммов-продуцентов и определении оптимальных условий, обеспечивающих эффективную продукцию О1 и О139 антигенов, ТКПА, ХТ I и II типа, В-субъединицы ХТ клетками штаммов холерного вибриона при малообъемном культивировании их в условиях производства.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы холерного вибриона О1 серогруппы классического и эльтор био-варов, а также штаммы О139 и не О1/не О139 серо-групп, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» и представленные в табл. 1. Их культивирование осуществляли в
термостатированной качалке при 37 °С в Г-образ -ных пробирках, содержащих 3 мл питательного бульона LB (рН 6,8), и колбах объемом 250 мл с 20 мл бульонов LB (pH 6,8), или Хоттингера (рН 7,6), или AKI (pH 6,0), или казеинового с пептоном (рН 7,6) и без пептона. Концентрацию выросших микробных клеток определяли турбидимет-рически (с использованием стандарта мутности). Стабильность наследования плазмид и транспозо-нов в клетках после выращивания выявляли путем рассева штаммов на плотные питательные среды и последующей проверки полученных изолированных колоний на резистентность к антибиотикам, которая определялась генами, входящими в состав мобильных генетических элементов, присутствующих в клетках изучаемых клонов. Продукцию ХТ и В-субъединицы измеряли иммуноферментным методом GM1 ELISA [11]. Наличие ТКПА в штаммах определяли методом иммуноблоттинга с антипи-лийной сывороткой по H.Towbin [12], предварительно разделив белки в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу U.K.Laemmli [10]. Синтез О1 и О139 антигенов на поверхности бактериальных клеток устанавливали в реакции диффузионной преципитации с моносыворотками. Учет реакции проводили через 24 ч. Статистическую обработку данных проводили по рекомендациям Н.А.Плохинского [5].
Результаты и обсуждение
В качестве продуцента О1 антигена серовара Инаба был выбран штамм V. c^lerae 2415 классического биовара, имеющий также высокий уровень биосинтеза ХТ I типа и ТКПА [1]. Для получения О1 антигена серовара Огава, а также ХТ I типа и ТКПА использовали штамм классического биовара V. c^lerae 2416 [7]. Продуцентом В-субъединицы ХТ служил авирулентный штамм V. cholerae КМ93, относящийся к не О1/не О139 серогруппе, для выделения ХТ II типа был взят созданный нами штамм V. c^lerae КМ234 эльтор биовара серовара Огава, полученный путем внедрения транспозона Tn5Mob (Kmr) в ген zot профага СТХф исходного штамма МАК757. В качестве продуцентов О139 антигена взяты штаммы V. cholerae О139 серогруппы - ави-рулентный природный КМ230 и вирулентные бес-капсульные КМ137 и КМ138 (табл. 1) [4, 6, 8].
Таблица 1
Характеристика штаммов, использованных в работе
Штамм V. cholerae Характеристика Продукция антигенов Г де описан или депонирован
2415 Классический биовар О1 серогруппы, серовар Инаба, рСТ105::шіпі-кап (KmRTcR) ХТ I типа, ТКПА, О1 антиген Инаба Заднова С.П. и др., 2002 [1]
2416 Классический биовар О1 серогруппы, серовар Огава, с элиминированной плазмидой рСТ105::тіпі-кап (KmRTcR) ХТ I типа, ТКПА, О1 антиген Огава Топорков А.В. и др., 2004 [7]
КМ234 Биовар эльтор О1 серогруппы, серовар Огава, 20^:Тп5-МоЪ (KmR) ХТ II типа ГКПБ «Микроб»
КМ137 О139 серогруппа О139 антиген Смирнова Н.И. и др., 2000 [6]
КМ138 О139 серогруппа, транспозон TnphoA(KmR) О139 антиген Чеховская Г.В., Смирнова Н.И., 2002 [8]
КМ230 О139 серогруппа О139 антиген Осин А.В., 2002 [4]
КМ93 Не О1/не О139 серогруппа, плазмида рСТЛ27(Те^ В-субъединица ХТ II типа Ильина Т.С. и др., 1989 [2]
Очевидно, что эффективность биосинтеза про-тективных антигенов может зависеть от скорости клеточного размножения. В этой связи на первом этапе работы для каждого штамма определено оптимальное время, необходимое для достижения начала стационарного развития популяции при выращивании их в Г-образных пробирках в бульоне ЬБ. В результате установлено, что штаммы V. ско!ете 2415 и 2416 следует культивировать до 10 ч, тогда как V. ско1егае КМ93 и КМ234 - 8 ч, V. ско1егае КМ138, КМ137 и КМ230 - 9 ч, поскольку увеличение срока культивирования последних до 10 ч приводит к лизису культуры. При указанных условиях штаммы продуцируют следующее количество ХТ или его В-субъединицу: V. ско1егае 2416 -
24,6 мкг/мл ХТ I типа, V. ско1егае КМ93 -14,3 мкг/мл В-субъединицы ХТ II типа, V. ско1егае КМ234 - 5,2 мкг/мл ХТ II типа. Что касается синтеза О-антигенов, то, по данным реакции иммунодиффузии, V. ско1егае 2416 продуцировал О1 антиген Огава в титре 1:4, что указывает на присутствие значительного количества О1 антигена на поверхности клеток. V. ско1егае КМ138 также характеризуется высоким уровнем синтеза О139 антигена, так как его титр в реакции агглютинации составил 1:40. При изучении наличия продукции ТКПА штаммами V. ско1егае 2416 и 2415 было обнаружено их присутствие уже после 4 ч выращивания.
Задача следующего этапа работы состояла в выявлении оптимальных условий для синтеза протек-тивных антигенов при культивировании штаммов-продуцентов в колбах Эрленмейера с применением термостатированной качалки ЯС-ТК (США). Исследуемые штаммы выращивали на питательных средах, широко используемых как в лабораторных (ЬБ и АК), так и производственных условиях при получении химической холерной вакцины (бульон Хоттин-гера, рН 7,6; казеиновый бульон, рН 7,6, с 1 % пептона и без пептона). При выращивании штаммов V. ско!егае 2415, КМ234, КМ138, содержащих мобильные генетические элементы (МГЭ), для создания селективных условий в бульон добавляли канамицин
Динамика роста штаммов-продуцентов О139 антигена V. ско1егае 230, КМ138, КМ137 на бульоне ЬБ (рН 7,5) в условиях малообъемного культивирования:
---------230; - ▲ - -КМ 138;
—♦ - - - КМ 137
в концентрации 25 мкг/мл, а при культивировании штамма КМ93 - тетрациклин в количестве 2 мкг/мл. В присутствии указанных антибиотиков в среде происходит размножение лишь клеток, содержащих МГЭ, что способствует повышенной экспрессии антигенов, и подавляется рост клеток, спонтанно утративших их. В результате установлено, что наиболее оптимальной средой для продукции О1 антигена Огава и ХТ штаммом V. ско1егае 2416 является бульон ЬБ (рН 6,8). При культивировании в данной среде штамм образует не только значительное количество бактериальных клеток (20 млрд/мл) с О1 антигеном Огава, но и ХТ (24,6 мкг/мл), табл. 2. Кроме того, методом иммуноблотта установлено, что для синтеза ТКПА клетками этого же штамма пригодны лишь среда Хоттингера (рН 7,6) и ЬБ (рН 6,8). В то же время штамм V. ско1егае 2415 продуцирует О1 антиген Инаба при культивировании на любой из использованных сред, но наибольшая концентрация микробных клеток (18 млрд/мл) с О1 антигеном образуется на среде ЬБ (рН 7,5) с добавлением глюкозы. Отбор штаммов-продуцентов О139 антигена на разных питательных средах показал, что оптимальной средой культивирования для всех штаммов является бульон ЬБ (рН 7,5), дополненный глюкозой. В этих условиях максимальная скорость роста и выход биомассы наблюдались у штамма V. ско1егае 230 (рисунок). Однако для получения О139 антигена более предпочтительным оказался штамм V. ско1егае КМ137, так как динамика удельной скорости его роста была аналогичной таковой для других штаммов, но показатель синтеза антигена в 4-8 раз выше (табл. 2). Что касается продукции секретируемых из клетки В-субъединицы ХТ или ХТ II типа соответственно штаммами КМ93 и КМ234, то эффективный синтез первого антигена (14,3 мкг/мл) наблюдался при выращивании штамма на среде ЬБ (рН 6,8) с добавлением глюкозы, тогда как активная экспрессия второго (19,0 мкг/мл) происходила при использовании специальной среды АЮ (рН 8,0).
При выяснении оптимальных условий для синтеза различных белков и липополисахаридов в условиях производства одним из важных является вопрос о том, каков же популяционный состав используемых штаммов относительно продукции изучаемых протективных антигенов и стабильности наследования МГЭ, определяющих эти свойства. О популяционном составе каждого штамма судили при проверке 100-150 произвольно отобранных клонов, полученных при рассеве их бульонных культур на полноценном агаре по указанным свойствам. Практически ни в одном случае не найдено клона, утратившего продукцию антигенов или МГЭ. Эти данные свидетельствуют о том, что выявленные условия культивирования для каждого штамма действительно являются оптимальными для стабильной продукции антигенов.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штаммы V. ско1егае 2415 и 2416 классического биовара О1 серогруппы при выращивании на среде ЬБ (рН 6,8) и Хоттингера (рН 7,6) в условиях производства стабильно синтезируют высокий уровень основных протективных антигенов - ХТ I типа, ТКПА, а также О1 антигена Огава и Инаба. Среди исследованных различных штаммов О139 серогруппы, являющихся продуцен-
Таблица 2
Образование биомассы и продукция антигенов штаммами холерного вибриона О1 (классического и эльтор биовара)
и О139 серогрупп при малообъемном культивировании
Концентрация Продукция О-антигена Синтез ХТ или
Штамм V. cholerae Используемый бульон микроб. клеток, млрд/мл В-субъединицы ХТ, мкг/мл
2416 ЬБ (рН 6,8)
классический биовар ЬБ (рН 6,8)ЬБ (рН 7,5) с глюкозой
О1 серогруппа ЬБ (рН 6,8) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) Казеиновый с 1 % пептона (рН 7,6) Казеиновый (рН 7,6)
2415 ЬБ (рН 6,8)
классический биовар ЬБ (рН 7,5) с глюкозой
О1 серогруппа ЬБ (рН 6,8) с глюкозой
234 ЬБ (рН 6,8)
эльтор биовар ЬБ (рН 7,5) с глюкозой
О1 серогруппа ЬБ (рН 6,8) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) Казеиновый с 1 % пептона (рН 7,6) Казеиновый (рН 7,6) АК! (рН 8,0)
КМ93 ЬБ (рН 6,8)
не О/не О139 серогруппа ЬБ (рН 7,5) с глюкозой ЬБ (рН 6,8) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) Казеиновый с 1 % пептона (рН 7,6) Казеиновый (рН 7,6)
КМ138 ЬБ (рН 6,8)
О139 серогруппа ЬБ (рН 7,5) с глюкозой ЬБ (рН 6,8) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) Казеиновый с 1 % пептона (рН 7,6) Казеиновый (рН 7,6)
230 ЬБ (рН 6,8)
О139 серогруппа ЬБ (рН 7,5) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) Казеиновый с 1 % пептона (рН 7,6)
КМ137 ЬБ (рН 6,8)
О139 серогруппа ЬБ (рН 7,5) с глюкозой Хоттингера (рН 7,6) АКТ (рН 8,0)
Примечание: н/о - не определяли; н/п - не продуцирует.
тами О139 антигена, предпочтительно использовать для получения данного поверхностного антигена штамм V. ско1егае КМ137, выращивая его на среде ЬБ (рН 7,5) с добавлением глюкозы. Для получения иммуногенной В-субъединицы ХТ II типа штамм V. ско1егае КМ93 не О1/не О139 серогруппы следует культивировать в бульоне ЬБ (рН 6,8) или ЬБ (рН 7,5) с добавлением глюкозы. Что касается ХТ II типа, характерного для холерных вибрионов био-вара эльтор, то активный синтез этого белка происходит при культивировании штамма-продуцента КМ234 в бульоне АЫ (рН 8,0).
Работа поддержана грантом РФФИ ОФИ № 0604-08122.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Заднова С.П., Топорков А.В., Челдышова Н.Б. и др. // Биотехнология. - 2002. - № 2. - С. 3-11. - 2. Иль -
20 1:32 28,6±2,1
30 1:32 3,5± 0,8
22 1:32 4,0±1,3
13 1:8 11,2± 2,5
13 1:32 3,9±0,6
11 1:8 0,24±0,02
12 1:32 45,0±1,8
18 1:32 8,5±2,5
14 1:32 1,5±0,1
20 н/о 13,5±1,0
30 н/о 9,6±2,2
25 н/о 6,7±0,7
14 н/о 11,2± 2,0
15 н/о 0,7± 0,3
15 н/о 0,55±0,02
30 н/о 19,0±3,5
15 н/о 14,3±2,7
18 н/о 13,2±1,4
10 н/о 10,8±2,5
20 н/о 7,6±1,6
20 н/о 3,3±0,8
9 1,8±0,1
25 1:20 н/о
15 1:40 н/о
11 1:40 н/о
5 1:20 н/о
4 н/п н/о
2 н/п
30 1:40 н/о
40 1:40 н/о
30 1:80 н/о
32 1:20 н/о
10 1:160 н/о
25 1:320 н/о
15 1:320 н/о
16 1:160 н/о
ина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIEM3, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae - продуцент В-субъединицы холерного токсина. А.с. №1505022, 1989. - 8 с. -3. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др. // ЖМЭИ. - 2005. - № 3. - С. 44-48. - 4. Осин А.В. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулент-ных штаммов Vibrio cholerae O139: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов, 2002. - 170 с. - 5. Плохинский Н.А. Биометрия. - М: Изд-во МГУ, 1970. - 6. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф. и др. // ЖМЭИ. - 2000. -№ 3. - С. 47-51. - 7. Топорков А.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов. Пат. на изобр. № 2222594, 2004. - 8. Чеховская Г.В., Смирнова Н.И. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ138 серогруппы О139 - продуцент холерного О139 антигена. Пат. на изобр. № 2192463, 2002. -9. Faruque S.M., Asadulghani, Saha M.N. et al. // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 5819-5825. - 10. Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - 11. Svennerholm
A.M., Holmgren J. // Curr. Microbiol. - 1978. - Vol. 1. - P. 1923. - 12. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 3. - P. 4350-4353.
S.P.Zadnova, O.A.Volokh, I.M.Krepostnova, E.Yu.Shchelkanova, L.F.Livanova, T.L.Zakharova, I.A.Shepelev, C.A.Yereomin, N.I.Smirnova
Studying the Main Pathogenicity and Immunogenicity Factors Production by Different Vibrio cholerae Strains While Cultured under the Production Conditions
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov Small-volume cultivation of previously constructed V. cholerae strains O1 (classical and eltor biovariants ), O139, and non-O1 / non O139
was undertaken under the productional conditions in order to obtain purified preparations of the main factors of pathogenicity and immunogenicity, i.e., I and II types of cholera toxins, B subunit of type II cholera toxin, toxin-coregulated adhesion pili, as well as O1 and O139 antigens. Protection anti-gens-overproducing strains preferable for the production were chosen as a result of this procedure, and optimal conditions for their cultivation were determined facilitating active expression of the proteins and lipopolysaccha-rides that should be used as a base for the development of a multi-component diagnostic test system.
Key words: V. cholerae overproducing strains, protective antigens, small-volume cultivation.
nocTynn^a 28.12.06.
УДК 616.981.452:575.191(7/8)
Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, Н.Ю.Шавина, А.И.Павлова, В.В.Кутырев
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА АМЕРИКАНСКОМ КОНТИНЕНТЕ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Изучены молекулярно-генетические особенности штаммов, выделенных на территории Северной и Южной Америки. Установлено, что они несут делецию размером 93 п.н. в гене глицерофосфатдегидрогеназы (glpD), что является «генетической меткой» восточного биовара чумного микроба. По данным ПЦР (ERIC) типирова-ния, большая часть изученных американских изолятов близка штаммам восточного биовара. Показано значительное разнообразие плазмидного состава изученных штаммов.
Ключевые слова: Yersinia pestis, американские штаммы, ферментация глицерина, плазмидный состав, ПЦР-типирование.
По мнению американских ученых чума была ввезена в США в 1900 г. в районе порта Сан-Франциско зараженными крысами и блохами на кораблях во время последней пандемии чумы, начавшейся в Юго-Восточной Азии и вызванной восточным биоваром Yersinia pestis. В течение последующих 25 лет вспышки чумы произошли и в других портах США, в том числе в городах вдоль побережья Мексиканского залива. Благоприятные экологические условия способствовали распространению чумы вглубь страны [3]. В восточных регионах США из-за разницы в природных условиях, в том числе и из-за отличий в видовом составе грызунов и паразитирующих на них блох укоренения чумы и формирования постоянно действующих очагов не произошло [3].
По мнению других, в том числе и отечественных исследователей, чума на территории Северной Америки носит эндемичный характер, а природные очаги могли сформироваться на этом континенте в древности [1, 2]. В пользу этой гипотезы свидетельствует общность биоценотической структуры природных очагов чумы, расположенных в ландшафтах сухих степей, полупустынь, пустынь США и России (СНГ). Для решения вопроса о происхождении чумы в Северной Америке необходимо изучение генетических особенностей изолятов Y. pestis, циркулирующих в этих очагах, и их сравнение со штаммами из Центральной и Юго-Восточной Азии, Африки и других регионов мира.
Данные о генетических особенностях северо-
американских штаммов в литературе очень ограничены [4]. Практически отсутствует также информация о генетических особенностях штаммов Y. pestis, выделяемых на территории Южной Америки и их филогенетических связях с изолятами из Северной Америки. Выявление молекулярных особенностей американских штаммов позволит определить их происхождение и в целом приблизить нас к пониманию общих закономерностей распространения и эволюции вида Y. pestis.
В связи с этим целью нашей работы было сравнительное изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов, выделенных на Американском континенте.
Материалы и методы
Изученные в этой работе штаммы Y. pestis получены из ГКПБ «Микроб» (таблица). Изучение таксономически значимых признаков (редукция нитратов, ферментация арабинозы и глицерина) проводили, как это было описано ранее [5, 7]. ПЦР типирование штаммов осуществляли в ERIC ПЦР с праймерами на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий [6].
Результаты и обсуждение
В работе изучены штаммы Y. pestis, выделенные на Американском континенте, а также штаммы из других регионов мира, в том числе России и сопредельных государств (таблица). У изученных штаммов исследовали признаки, важные в таксоно-
