CC BY
25
УДК: 616.932:619.9-098
А.А.Горяев, Е.Ю.Щелканова, Ю.В.Лозовский, И.В.Тучков, Н.И.Смирнова
конструирование штамма vibrio cholerae биовара Эльтор гиперпродуцента холерного токсина ii типа и определение оптимальных условий для продукции этого белка
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Показано, что внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосому токсигенного штамма V. cholerae МАК757 биовара эльтор обусловило появление инсерционных мутантов с измененным геномом профага СТХф. Реорганизация генома профага выразилась в делеции четырех генов zot, ace, cep, orfU при сохранении лишь опе-рона ctxAB, кодирующего синтез холерного токсина II типа. Указанное изменение генома профага СТХф обусловило повышение продукции этого белка у клонов МАК757 chr::Tn5-Mob (KmR) Tox++ более чем в 2000 раз. Среди инсерционных мутантов KmR Tox++ в качестве штамма-продуцента выбран один клон с наиболее высоким уровнем биосинтеза холерного токсина (42,0-45,0 мкг/мл), получивший обозначение КМ234. Подобраны условия для культивирования штамма КМ234, обеспечивающие наибольшую продукцию холерного токсина. Показано, что сконструированный штамм V. cholerae КМ234 биовара эльтор является стабильным и эффективным продуцентом холерного токсина 2-го типа и может быть использован в производстве для получения этого белка, необходимого для приготовления холерных профилактических и диагностических препаратов.
Ключевые слова: холерный вибрион, штамм-продуцент холерного токсина, реорганизация генома профага СТХф, транспозон Tn5-Mob.
Реальная возможность завоза холеры эльтор на территорию Российской Федерации из стран Азии и Африки, где сохраняется неблагополучная эпидемиологическая ситуация, указывает на необходимость создания эффективных диагностических и профилактических препаратов. Один из подходов к решению этой задачи состоит в разработке нового поколения иммунодиагностических тест-систем и химических холерных вакцин, важным компонентом которых является иммуногенная В-субъединица холерного токсина (XT) II типа, который продуцируют эпидемически опасные штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор. В этой связи очевидна необходимость создания эффективных штаммов-продуцентов хт, который является не только ключевым фактором патогенности возбудителя холеры, но и основным протективным антигеном. При решении этой задачи наиболее часто используют рекомбинантные плазмиды с клонированным опероном ctxAB, кодирующим XT, которые вводят в клетки вирулентных штаммов, несущих резидентные хромосомные гены ctxAB. За счет повышения копийности структурных генов ctxAB в клетках таких штаммов происходит увеличение продукции ими XT. Однако при отсутствии селективного давления стабильность наследования рекомбинантных плазмид клетками таких штаммов, как правило, не превышает 60-80 %, что, в свою очередь, ведет к снижению синтеза XT. Поэтому для конструирования стабильных бесплаз-мидных штаммов-продуцентов мы использовали другой подход, основанный на способности различных транспозонов при внедрении в бактериальный геном вызывать вторичные перестройки в участках ДНК, прилежащих к сайту их интеграции, которые в ряде случаев повышают экспрессию соседних генов.
Целью нашей работы явилось создание безплазмид-ного штамма V. cholerae биовара эльтор гиперпродуцента холерного токсина II типа с помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) и определение оптимальных условий для эффективной экспрессии генов ctxAB, кодирующих синтез это белка.
Материалы и методы
В работе использовали токсигенные штаммы V. cholerae МАК757 биовара эльтор и V. cholerae 569В классического биовара, полученные из ГКПБ «Микроб», а также штамм Escherichia coli S17-1 (pSUP5011) KmR ApR CmR, предоставленный ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Культивирование бактерий проводили в бульоне и агаре LB, а также в казаминовом, AKI и казеиновом бульонах. Минимальной средой служил глюкозо-солевой агар и глюкозо-солевой раствор [1]. Аминокислоты вносили в концентрациях 20-40 мкг/мл, канамицин - 25 мкг/мл, ампициллин -100 мкг/мл, хлорамфеникол - 50 мкг/мл.
Определение продукции холерного токсина проводили с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде [3] и имму-ноферментного метода GMjELISA [7].
Конъюгационные скрещивания осуществляли на плотной среде [1]. Для внедрения Tn-элемента в бактериальный геном трансконъюганты МАК757 (pSUP5011) KmR AmR CmR выращивали в жидкой минимальной среде с канамицином при 4 °С, поскольку при таких условиях культивирования селективное преимущество получают бесплазмидные клоны, сохранившие Tn5-Mob (KmR) в хромосоме. изолированные колонии, полученные после рассева такой культуры на LB агаре с канамицином, прове-
ряли на устойчивость к канамицину, ампицилину и хлорамфениколу, отбирая для дальнейших исследовании KmR ApS CmS-клоны.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, как описано ранее [2], используя для тестирования 6 генов коровой области профага СТХф, а также Tn5-Mob следующие специфические олигону-клеотидные праймеры:
ctxA1 (размер ампликона 564)
прямой - 5’ CgggCAgATTCTAgACCTCCTg’;
обратный - 5’ CgATgATCTTggAgCATTCCCAC 3’;
ctxB1 (размер ампликона 354)
прямой - 5’ ATgATTAAATTAAAATTTgg 3’;
обратный - 5’ TTAATTTgCCATACTAATTg 3’;
zot1 (размер ампликона 947)
прямой - 5’ TCgCTTAACgATggCgCgTTTT 3’;
обратный - 5’ AACCCCgTTTCACTTCTACCCA 3’;
ace1 (размер ампликона 289)
прямой - 5’ TAAggATgTgCTTATgATggACACC 3’;
обратный - 5’ CCgTgATgAATAAAgATACTCATAgg 3’;
orfU1 (размер ампликона 721)
прямой - 5’ CAAAATgAgCATggCggC 3’;
обратный - 5’ CCCATTgTgCAATCggTgT 3’;
cep-1 (размер ампликона 162)
прямой - 5’ CAgAACAATTgCCCCCACCAC 3’;
обратный - 5’ AAgCACgCTTTCACTCgggg 3’;
Tn5 Mob-1 (размер ампликона 405)
прямой - 5’ AgTAgCgTCCTgAACggAACCTTT 3’;
обратный - 5’ AAgAgAACggAgTgAACCCACCAT 3’.
Результаты и обсуждение
Для проведения транспозонного мутагенеза выбран Tn5-Mob (KmR) на основании его способности, установленной нами ранее [1], с большой частотой внедряться в хромосомную область холерного вибриона вблизи профага СТХф, несущего структурные гены ctxAB, кодирующие XT. В качестве вектора транспозона Tn5-Mob (KmR) использовали конъюгативную плазмиду pSUP5011 (KmR ApR CmR) [6]. Донором плазмиды служил штамм E.coli S17-1 (pSUP5011), реципиентом был вирулентный штамм V. cholerae МАК757 биовара эльтор, в геноме которого присутствуют две копии генов ctxAB в составе двух профагов СТХф. Выбор данного реципиента обусловлен отсутствием у него гемолитической активности, что позволяло использовать для определения продукции XT у большого количества транс-конъюгантов простой и эффективный метод РПИГ на плотной среде. В условиях in vitro этот штамм продуцирует в культуральную среду небольшое количество токсина (0,02 мкг/мл по данным ELISA), которое практически недоступно для определения его в РПиГ (рис. 1, колонии 1-10, 23-26).
Частота конъюгационного переноса плазмиды pSUP5011 из E.coli S17-1 в клетки V. cholerae МАК757 достигала 5,5-10-5. Все проверенные транс-конъюганты были KmR ApR CmR. Последующее культивирование 15 произвольно отобранных клонов
МАК757 (р3Ш5011) № Ар11 Ст®- при 4 °С в минимальной среде с добавлением канамицина позволило выделить 263 клона из 2100 проверенных, которые утратили плазмидные маркеры ApR Ст^ но сохранили устойчивость к канамицину, определяемую транспозоном. Возникновение клонов KmR Ар3 Ст3 обусловлено транспозицией Тп-элемента из плаз-мидного генома в хромосому, частота которой составила 12,5 %.
Полученные клоны проверяли на продукцию ХТ методом РПИГ, полагая, что внедрение Тп5-МоЬ в хромосому V. с^1егае в ряде случаев может привести к изменению биосинтеза этого белка. В результате среди изученных KmR Ар3 Ст^клонов действительно обнаружено 6 клонов МАК757 Лг::Тп5-МоЬ с повышенной продукцией ХТ. Зона иммунного гемолиза вокруг макроколоний таких клонов была около 5,0 мм (рисунок, колонии 17-22), тогда как размер такой зоны вокруг макроколоний высокотоксиген-ного штамма V. с^1егае 569В не превышали 2-3 мм (рисунок, колонии 1-4). Явная гиперпродукция ХТ клонами МАК757 Лг::Тп5-МоЬ позволила обозначить их фенотип KmR Тох++. По данным иммунофер-ментного метода GM1 ELISA, выявленные клоны Кт~ Тох++ при культивировании их в стандартных лабораторных условиях (казаминовый бульон, рН 7,6, 30 °С) продуцировали 42-45 мкг/мл этого белка (табл. 1). клон с наибольшей продукции ХТ был выбран в качестве штамма-продуцента и получил обозначение V. сЫ1егае КМ234 биовара эльтор.
Повышение более чем в 2000 раз продукции ХТ в клетках ряда клонов, содержащих в геноме транс-позон Тп5-МоЬ, по сравнению с исходным штаммом, указывает на значительное увеличение экспрессии их структурных генов СхАВ. Одним из возможных объяснений изменения продукции ХТ могла быть реорганизация профага СТХф, индуцированная транспозоном Тп5-МоЬ. Для подтверждения этого предпо-
Продукция холерного токсина штаммами V єкоіегае МАК757 сЬг::Тп5-МоЬ Ктк, Тох++ биовара эльтор, определенная с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза:
1-4 и 11 -16 - высокотоксигенные штаммы V єкоівгав 569В и Дакка 35 классического биовара, взятые в качестве положительного контроля; 5-10, 23-26 - V єкоівгав МАК757 (исходный);
17-19 и 20-22 - независимо полученные инсерционные мутанты V єкоівгав МАК757 с^::Тп5-МоЬ Ктк с повышенной продукцией ХТ
Таблица l
Результаты изучения структуры генома профага СТХф исходного штамма У.сИоІетав МАК757 биовара эльтор
и его инсерционных мутантов с помощью ПЦР
Штамм Продукция токсина по методу Tn5-Mob Tестируемые гены профага CTXф
PH^*, мм ELISA**, мкг/мл cep orfU ace zot ctxA ctxB
MARl5l 0 0,02 - + + + + + +
MARl5l (pSUP5011) KmR ApR CmR 0 0,02 + + + + + + +
MARl5l chr::Tn5-Mob Tox++ KmR -
транспозант 1-й з 42,2 + - - - - + +
MARl5l chr::Tn5-Mob Tox++ KmR -
транспозант 2-й з 43,7 + - - - - + +
MARl5l chr::Tn5-Mob Tox++ KmR -
транспозант 3-й (KM234) з 45,0 + - - - - + +
569B 2 9,0 - + + + + + +
*Размер зоны иммунного гемолиза вокруг макроколоний. **Штаммы выращивали в казаминовом бульоне при 30 °С
ложения мы провели ПЦР-анализ трансконъюгантов МАК757 chr::Tn5-Mob (KmR) Tox++ с целью выявления в их геноме фаговых генов ctxA, ctxB, zot, ace, orfU, cep. Оказалось, что геном их профага СTXф действительно претерпел значительные изменения, выразившиеся в сохранении генов ctxA и ctxB, кодирующих XT, и потере четырех тестируемых генов, zot, ace, orfU, cep. Повышение продукции холерного токсина у таких инсерционных мутантов, содержащих в хромосоме дефектный или неполный профаг, указывает на еще не описанный механизм регуляции экспрессии генов ctxAB, который требует дальнейшего изучения. Tакая реорганизация генома профага CTXф, связанная с делецией указанных генов, вызвана Tn5-Mob, который, видимо, локализован в хромосомной области вблизи CTXф, поскольку спонтанные мутанты такого типа неизвестны. Tем не менее, независимо от результатов дальнейших исследований в этом направлении, мы получили бесплазмидный
Таблица 2
Продукция холерного токсина сконструированным штаммом-продуцентом V cholerae КМ234 биовара эльтор при культивировании его на различных средах
Штамм Используемый бульон Tемперaтурa культивирования, °C Продукция XT по данным GMiELISA, мкг/мл
569В* Казеиновый ^H 7,6) 30 6,0±0,55
классического
биовара Казеиновый ^H 7,6) 37 0
m234 LB foH 6,8) 30 6,5±1,2
биовара
эльтор LB ^H 6,8) 37 13,5±1,0
AKI ^H 8,0) 37 19,0±3,5
Казеиновый с 1 % пептона ^H 7,6) 30 9,0±2,7
Казеиновый с 1 % пептона ^H 7,6) 37 0,7± 0,3
Казеиновый ^H 7,6) 30 43,2±3,0
Казеиновый ^H 7,6) 37 1,0±0,25
* Штамм взят в качестве контроля.
штамм V. cholerae биовара эльтор с высоким уровнем продукции XT II типа (42,0-45,0 мкг/мл), превышающий таковой у исходного штамма (0,02 мкг/мл) более чем в 2000 раз.
Для определения оптимальных условий, при которых происходит наибольшая продукция XT, сконструированный штамм КМ234 выращивали на разных питательных средах (AKI-бульон, LB-бульон, казеиновый) при различных температурах (30 и 37 °С). Выбор названных сред и температурных режимов определялся рядом причин. Во-первых, среда AKI (1,5 % бакто-пептона, 0,4 % дрожжевого экстракта фирмы «Дифко», 0,5 % NaCl, 0,3 % NaHCO2) является специально подобранной средой для получения холерного токсина 2-го типа, продуцируемого природными штаммами V. cholerae биовара эльтор [5]. Выращивание холерных эльтор вибрионов на этой среде (рН 7,8-8,0) при 37 °С в течение 20 ч обеспечивает эффективный синтез регуляторного белка ToxT, необходимого для выраженной экспрессии структурных генов ctxAB [4]. Во-вторых, LB и казеиновый бульон относятся к питательным средам, широко используемым как в лабораторных, так и в производственных условиях при получении XT. Полученные данные представлены в табл. 2. В результате проведенных исследований установлено, что эффективный биосинтез XT (43,2 мкг/мл по данным GM1 ELISA) наблюдался при выращивании клеток штамма КМ234 на казеиновом бульоне при 30 °С. На среде AKI продукция токсина была также высока, однако она составляла лишь 19,0 мкг/мл. Причина выявленных различий в продукции XT штаммом КМ234 на среде AKI (19,0 мкг/мл) и казеиновом бульоне (43,2 мкг/ мл) пока неясна. По-видимому, полученный штамм КМ234 приобрел способность к ToxT-независимой экспрессии генов ctxAB за счет действия нового механизма контроля биосинтеза XT, который предстоит изучить.
При выяснении оптимальных условий для биосинтеза XT сконструированным штаммом одним из важных является вопрос о стабильности наследования хромосомной мутации, определившей его фенотип Tox++. В этой связи у 600 произвольно ото-
бранных клонов, полученных при рассеве бульонной культуры (казеиновый бульон, рН 7,6, 30 °С) КМ234 на плотной среде без канамицина, проверяли продукцию XT с помощью РПИГ. Оказалось, что лишь 5 клонов (или 0,8 %) утратили фенотип Tox++ . Из этого следует, что выявленные условия культивирования штамма 234 (казеиновый бульон, рН 7,6, 30 °С) действительно являются оптимальными для стабильной и эффективной продукции его клетками XT.
Tаким образом, с помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) сконструирован бесплазмидный штамм Vibrio cholerae KM234 биовара эльтор, имеющий высокий и стабильный уровень биосинтеза холерного токсина II типа. Выявление оптимальных условий для продукции XT в лабораторных условиях позволяет рекомендовать использование штамма км234 в производстве для получения и выделения очищенного холерного токсина II типа, который применяется для приготовления холерных иммунодиагностиче-ских препаратов. Кроме того, сконструированный штамм может быть использован при проведении генетических исследований с целью изучения нового механизма регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерных вибрионов.
Работа поддержана грантами РФФИ № 06-0448310 и РФФИ ОФИ № 06-04-08122.
СПИСОК ЛИХЕРАХУРЫ
1. Журавлева Е.А., Смирнова Н.И. // Мол. генет. -1991. - № 5. - С. 15-19. - 2. Осин А.В., Нефедов К.С.,
Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Генетика. - 2005. - T. 41, № 1. - С. 1-10. - 3. Шагинян Б.М., Маракуша Б.И. // Журн. микробиол. - 1983. - № 7. - С. 92-96. - 4. DiRita V.J., Neely M., Taylor R.K., Bruss P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. - Vol. 93. - P. 7991-7995. - 5. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y. etal. // Microbiol. Immunol. - 1986. -Vol. 30 (11) . - P. 1075-1083. - 6. Simon R. // Mol. Gen. Genet. -1984. - Vol. 196. - P. 413-420. - 7. Svennerholm A.-M., Wiklund G. // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 17. - P. 262-270.
A.A.Goryaev, E.Yu.Shchelkanova, Yu.V.Lozovsky, I.V.Touchkov, N.I.Smirnova
Construction of an El Tor Biovariant Vibrio cholerae Strain Capable of Type II Cholera Toxin Hyperproduction and Determining the Optimal Conditions for the Production of This Protein
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”, Saratov
Introduction of Tn5-Mob (KmR) transposon into the chromosome of the toxinogenic V. cholerae strain MAK757 El Tor biovar was shown to result in the emergence of insertion mutants containing an altered genome of CTX9 prophage. The reorganization of the latter was expressed in the deletion of four genes, zot, ace, cep, orfU, however,its ctxAB operon coding for the synthesis of type II cholera toxin being still retained. This change in the CTX9 prophage has lead to as high as 200 fold greater levels of production of this protein by MAK757clones chr::Tn5-Mob (KmR) Tox++. A single clone with the highest cholera toxin biosynthesis levels (42.0-45.0 ^g/ml) was selected among the insertion mutants KmR Tox++ and designated as KM234. The optimal conditions for culturing the KM234 construct were fitted to provide for the highest cholera toxin elaboration by the cells. The El Tor biovar V. cholerae strain KM234 thus constructed was shown to be a stable and efficient type II cholera toxin overproducing strain promising to be applied in the industrial production of this protein routinely used to manufacture the preparations for cholera diagnosis and prophylaxis.
Key words: the cholera agent,a cholera toxin hyperproducing strain, prophage CTX9 genome reorganization, Tn5-Mob transposon.
Поступила 10.12.07.
краткие сообщения
УДК 616.981.48(471.44)
Л.И.Наркайтис1, А.Н.Данилов2, Ю.И.Яшечкин3, Е.В.Куклев3, О.И.Кожанова2, М.Е.Минаева4,
Ю.Ю.Елисеев1
прогнозирование заболеваемости населения Саратова кишечными инфекциями с водным путем передачи
Саратовский государственный медицинский университет, 2Управление Роспотребнадзора по Саратовской области, 3ФГУЗ «Российский НИПЧИ «Микроб», 4ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Саратовской области, Саратов
Разработана методика прогнозирования заболеваемости кишечными инфекциями, связанными с водным фактором, в Саратове, основанная на аналитических методах оценки санитарно-гигиенических показателей качества воды централизованного водоснабжения.
Ключевые слова: база данных, прогнозирование заболеваемости, статистическая модель, системный подход.
контролю за качеством питьевой воды в Саратовской области уделяется пристальное внимание, тем не менее, заболеваемость острыми кишечными инфекциями (оки) держится на достаточно высоком уровне. Так, в 2006 г. заболеваемость ОКИ установленной и неустановленной этиологии возросла по сравнению с 2005 г. на 20,0 % (с 9366 до
11240 случаев) и превысила аналогичный показатель по области за последние 6 лет [4].
Учитывая вышеизложенное, проведен сбор данных о состоянии хозяйственно-питьевого водоснабжения по санитарно-бактериологическим (8), санитарно-химическим (9) и органолептическим (4) показателям качества воды в 665 точках пяти райо-
