CC BY
130
эти процессы репарации идут интенсивно в ответ на различные повреждающие факторы как экзогенной, так и эндогенной природы, то нарушение их нормального функционирования может привести к негативным последствиям и гибели клетки. В свою очередь уменьшение числа нейронов в Mn-накапливающих областях мозга и выражается в виде симптомов манганизма и некоторых других нейродегенеративных заболеваний.
Работа выполнена при финансовой поддержке РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») и РФФИ (гранты 13-04-00598, 13-04-00642).
Сведения об авторах: Институт молекулярной генетики РАН Лахин А.В. - мл. науч. сотр., 123182 Москва, пл. Курчатова, 2; e-mail: lahin9@mail. ru;
Тарантул В.З. - проф., зав. отделом вирусной и клеточной молекулярной генетики;
Генинг Л.В. - ст. науч. сотр., зав. сектором развития методов молекулярной генетики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Казаков А. А., Гришина Е. Е., Тарантул В. З., Генинг Л. В. Биохимия. 2010; 75: 1031-9.
2. Aschner M., Guilarte T. R., Schneider J. S., Zheng W. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007; 221: 131-47.
3. AshD. E, Schramm V. L. J. Biol. Chem. 1982; 257: 9261-4.
4. Assem F. L., Holmes P., Levy L. S. J. Toxicol. Environ. Health B Crit. Rev. 2011; 14: 537-70.
5. BaggaP., PatelA. B. Neurochem. Int. 2012; 60: 177-85.
6. Beckman R. A., Mildvan A. S., Loeb L. A. Biochemistry. 1985; 24: 5810-17.
7. Blanca G., Shevelev I., Ramadan K. et al. Biochemistry. 2003; 42: 7467-76.
8. Domínguez O., Ruiz J. F., Lain de Lera T. et al. EMBO J. 2000; 19: 1731-42.
9. El-Deiry W. S., Downey K. M., So A. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 7378-82.
10. FrankE. G., Woodgate R. J. Biol. Chem. 2007; 282: 24689-96.
11. Gee J. B., Corbett R. J., Perlman J. M., Laptook A. R. Pediatr. Neurol. 2001; 25: 304-8.
12. Goldschmidt V., Didierjean J., Ehresmann B. et al. Nucleic Acids Res. 2006; 34: 42-52.
13. Greger J. L. Neurotoxicology. 1999; 20: 205-12.
14. Iyengar V., Woittiez J. Clin. Chem. 1988; 34: 474-81.
15. Keen C. L., Ensunsa J. L., CleggM. S. Met. Ions Biol. Syst. 2000; 37: 89-121.
16. Keen C. L., Ensunsa J. L., Watson M. H. et al. Neurotoxicology. 1999; 20: 213-223.
17. Kondakis X. G., Makris N., Leotsinidis M. et al. Arch. Environ. Health. 1989; 44: 175-8.
18. Kunkel T. A., Pavlov Y. I., BebenekK. DNA Repair (Amst). 2003; 2: 135-149.
19. Lakhin A. V., Kazakov A.A., Makarova A. V. et al. Nucleic Acid Ther. 2012; 22: 49-57.
20. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., Kornberg A. J. Biol. Chem. 1958; 233: 163-70.
21. Loeb L. A., Kunkel T. A. Annu. Rev. Biochem. 1982; 51: 429-57.
22. Lucchini R. G., Martin C. J., Doney B. C. Neuromolecular. Med. 2009; 11: 311-21.
23. Makarova A. V., Grabow C., Gening L. V. et al. PLoS One. 2011; 6: e16612.
24. McDonald J. P., Frank E. G., Plosky B. S. et al. J. Exp. Med. 2003; 198: 635-43.
25. Pal P. K., Samii A., Calne D. B. Neurotoxicology. 1999; 20: 227-38.
26. Racette B. A., Antenor J. A., McGee-Minnich L. et al. Mov. Disord. 2005; 20: 492-6.
27. Rivera-Mancía S., Ríos C., Montes S. Biometals. 2011; 24: 811-25.
28. Sirover M. A., Loeb L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976; 70: 812-17.
29. Tissier A., McDonald J.P., Frank E.G., Woodgate R. Genes Dev. 2000; 14: 1642-50.
30. Versieck J. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1985; 22: 97-184.
31. Wang T. S., EichlerD. C., Korn D. Biochemistry. 1977; 16: 4927-34.
32. Zakour R. A., Kunkel T. A., Loeb L. A. Environ. Health Perspect. 1981; 40: 197-205.
33. Zhao F., Cai T., Liu M. et al. Toxicol. Sci. 2009; 107: 156-64.
Поступила 18.06.13
THE MANGANESE-INDUCED INFIDELITY OF THE DNA SYNTHESIS AS A POSSIBLE CAUSE OF MANGANISM
A. V. Lakhin, V. Z. Tarantul, L. V. Gening
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
The impact of the 8 most common bivalent metal cations (Mg2+, Mn2+, Co2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Cu2+) on the operation of the whole complex of DNA polymerases in mice brain cell extracts was tested. A decrease in the fidelity of the DNA synthesis was observed in the presence of several metals; among them, Mn2+ caused the most significant effect. It was also demonstrated that this effect was mainly due to the DNA polymerase iota (Pol i) activity. It is well known that occupational or environmental exposure to excessive Mn could lead to development of neurodegenerative diseases (e.g., manganism). However, the molecular mechanism underlying these pathologies is still unknown. Our results suggest that the neurotoxic effect of Mn2+ may be associated with local activation of highly error-prone Pol i that increases incorrect DNA synthesis at elevated concentrations of this metal.
Key words: incorrect DNA synthesis; manganese; DNA polymerase iota
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1:579.253].083.1:577.21.08
Н.И. Смирнова, Д.А. Агафонов, Е.Ю. Щелканова, С.П. Заднова, А.В. Черкасов, В.В. Кутырев
ГЕНОВАРИАНТЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ ЭЛЬ ТОР: ПОЛУЧЕНИЕ, МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИз
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлены данные по экспериментальному моделированию возникновения вирулентных геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Показано, что полученные геноварианты по фе-но- и генотипическим свойствам не отличались от природных генетически измененных штаммов, возникших в естественной популяции возбудителя. Методами ПЦР и секвенирования установлено, что образованные в процессе конъюгации геноварианты несли в хромосоме участок генома профага CTXClass9 с геном ctxBl холерных вибрионов классического биовара. Показано, что следствием изменения структуры профага стало повышение токсигенности и вирулентности геновариантов по сравнению с типичным штаммом-реципиентом. При протеомном анализе
у геновариантов обнаружено изменение экспрессии 26 белков, выполняющих в клетке различные функции (метаболизм, энергетический обмен, транспорт аминокислот и т.д.). Эти данные указывают на влияние нового участка ДНК в геноме геновариантов на уровень экспрессии различных генов жизнеобеспечения. Полученные результаты служат подтверждением того, что одним из механизмов формирования геновариантов в естественных популяциях возбудителя является горизонтальный перенос генов.
Ключевые слова: геноварианты возбудителя холеры; профаг СТХф; конъюгация; рекомбинанты; токсигенность; вирулентность, протеом.
Профаг CTXclass ф
Tn5-Mob
TLC
Г
1
Рвг-область
Коровая область
RTX
Г
1
Донор
tlcR ORF2 ORFX rstA сер асе ctxA rtxB rtxD
cri ORF3 rstfflass rstB orfU zot ctxB1 rtxA rtxC
TLC
Профаг CTX ф
X
г
i
RS2-o6nacTb
Коровая область
1
RSI<p
RTX
Г
1 г
1
Реципиент
tlcR ORF2 ORFX rstA сер ace ctxA rstR" rstB rtxA rtxC cri ORF3 rstRB rstB orfU zot ctxB3 rstA rstC rtxB rtxD
Профаг CTXHy% Tn5-Mob
TLC
1
Ивг-область
Коровая область
н г
RSI9
RTX
г
1 г
1
(экспериментально
tlcR ORF2 ORFX rstA сер асе ctxA rstA rstC rtxB rtxD полученный
cri ORF3 rstRB rstB
orfU zot
ctxB1 rstRB rstB
rtxA rstC
геновариант)
M 1
Рис. 1. Схема конъюгационного скрещивания (а) донорного и реципиентного штаммов V.cholerae биовара Эль Тор: донорный штамм КМ7Р имеет в хромосоме профаг CTXClass9 с геном ctxBl и транспозон Tn5-Mob, реципиент - профаг СТХиф с геном ctxB3.
Рекомбинанты содержат в хромосоме транспозон Tn5-Mob и участок генома донорного профага СТХс1"™ф, включающий оперон ctxABl с промоторной областью; б, в - результаты Mismatch Amplification Mutation Assay-ПЦР-анализа, указывающие на наличие у донора и рекомбинантов аллеля ctxBl (б), у реципиента - аллеля ctxB3 (в); цифрами обозначены дорожки: M - маркер молекулярной массы, 1 - донорный штамм KM7P; 2 - реципиентный
штамм M818; 3-9 - рекомбинантные штаммы R1-R7.
Значительная часть генома многих патогенных для человека бактерий представлена мобильными генетическими элементами, несущими гены вирулентности и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды, а также гены резистентности к лекарственным препаратам [3, 4, 6]. Это обстоятельство определяет вариабельность генома многих возбудителей опасных инфекций, которая проявляется в возникновении их генетических вариантов с новым сочетанием различных генов. Новые геноварианты возбудителей, как правило, формируются в результате приобретения исходными патогенными штаммами мобильных участков ДНК от других микроорганизмов через горизонтальный перенос генов, которому принадлежит ключевая роль в эволюции прокариот. Наиболее тяжелые эпидемиологические последствия этих событий возникают в случае формирования и широкого
распространения новых геновариантов возбудителей, вызывающих инфекционные болезни, представляющие исключительную эпидемическую опасность. К таким болезням относится холера, семь пандемий которой (с 1817 г. по настоящее время) унесли миллионы человеческих жизней [1]. В последний период внимание многих исследователей сосредоточено на изучении механизма возникновения природных геновариантов с повышенной вирулентностью и высоким уровнем адаптации к меняющимся условиям окружающей среды [7, 32, 38]. Этиологическим агентом семи известных пандемий холеры были холерные вибрионы О1 серогруппы, относящиеся к биоварам классическому либо Эль Тор [1]. Бактерии V. сЫ1ег-ае классического биовара были возбудителями первых шести пандемий азиатской холеры (1817-1926 гг.). Впоследствии эти штаммы почти через 40 лет
(1923-1961 гг.) были замещены бактериями V. choler-ae биовара Эль Тор, которые вызвали текущую, 7-ю, пандемию холеры (1961 г. по настоящее время). Вытеснение вибрионов одного биовара другими связано с изменением структуры и функции генома возбудителя холеры в процессе его эволюции. Одно из наиболее значимых генетических отличий между классическими вибрионами и Эль Тор состоит в разной структуре профага СТХф, несущего оперон ctxAB, кодирующий холерный токсин (СТ), который вызывает основной клинический симптом - профузную диарею [28]. В структуре фаговой ДНК выделяют коровую область размером 4,5 т.п.н. и участок ДНК размером 2,4 т.п.н., обозначенный как RS-2. В коровую область, помимо оперона ctxAB, входят гены zot, ace, orfU, cep, psh, необходимые для формирования фаговых частиц, а также для продукции дополнительных токсинов Zot и Ace. Последовательность RS-2 содержит гены rstA, rstB и rstR, а также две межгенные области (ig-1 ig-2), контролирующие регуляцию, репликацию и интеграцию указанного фага (рис. 1, а) [41].
Известно также, что профаги СТХф классического вибриона и Эль Тор имеют разное генетическое окружение. Если у холерных вибрионов Эль Тор вблизи их профага расположено три генетических элемента - профаг RS^, TLC-элемент и кластер генов RTX, то у классических вибрионов имеются только два последних [17, 28, 29]. Профаг RS^, который, как правило, фланкирует СТХф у V. cholerae биовара Эль Тор, содержит 3 гена (rstA, rstB и rstR), гомологичных таковым RS2-области СТХф, а также один дополнительный ген, обозначенный rstC. Белок RstC является антирепрессором, который, блокируя активность фагового репрессора rstR, обеспечивает транскрипцию генов СТХф, включая гены ctxAB [15,31]. Второй генетический элемент, тесно связанный с профагом СТХф, TLC (от toxin-linked cryptic), также представляет собой нитчатый фаг (^Сф), интегрированный в хромосому перед профагом СТХф [17]. Профаг ^Сф, геном которого составляет 4,5 т.п.н., содержит гены cri и tlcR, кодирующие соответственно репликазу Cri, гомологичную белку репликации нитчатых фагов, и белок ^cR, имеющий заметное сходство с белком RstR, обеспечивающим лизогенность профага СТХф. К третьему генетическому элементу, являющемуся спутником профага СТХф, принадлежит нуклеотидная последовательность RTX размером около 10 т.п.н., содержащая кластер генов (rtxA, rtxC, rtxB, rtxD), кодирующих RTX-токсин (от repeat in toxin) [21].
При анализе результатов секвенирования установлено, что различия в структуре геномов профагов СТХф холерных вибрионов классического и Эль Тор биоваров определяются разными нуклеотидными последовательностями двух генов - гена-репрессора rstR, локализованного в области RS-2-профага и отвечающего за лизогенное состояние холерных вибрионов, и гена ctxB, входящего в состав оперона ctxAB и кодирующего В-субъединицу СТ. Вследствие таких различий аллели указанных генов у классических вибрионов обозначены как rstRClass и ctxBClass или (ctxB1), у вибрионов Эль Тор - как rstREl и ctxBEl (или ctxB3). Профаги, соответственно, получили обозначение СТХс1а^ф и СТХ^ф [27]. Результатом таких различий является более низкий уровень продукции СТ вибри-
онами Эль Тор по сравнению с классическими, что приводит к развитию легких и бессимптомных форм холеры, а также к длительному вибрионосительству.
Вместе с тем довольно быстрая эволюция генома возбудителя холеры Эль Тор привела к возникновению новых его вариантов, о которых стало известно через 30 лет после начала 7-й пандемии. Несмотря на генетическое разнообразие, геноварианты V cholerae биовара Эль Тор имеют 3 общих свойства. Во-первых, содержат в составе профага СТХф ген ctxB1, присущий холерным классическим вибрионам. Во-вторых, отличаются от типичных штаммов повышенной вирулентностью, что выражается в развитии тяжелых клинических форм холеры и высокой смертности. В-третьих, имеют высокий уровень адаптации к меняющимся условиям окружающей среды, что обусловило вытеснение ими типичных штаммов во многих странах Азии и Африки.
Возможным донором гена ctxB1, помимо классических вибрионов, могли быть штаммы V. cholerae не-О1/не-О139 серогрупп, содержащие геном классического профага СтХС1ажф [7, 32]. Еще один возможный источник гена ctxB1 - вирулентные штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор, изолированные до начала 7-й пандемии холеры и получившие обозначение как предпандемические. Основные отличия этих изолятов от типичных штаммов возбудителя 7-й пандемии заключались в наличии в их хромосоме профага СТХС1ж8ф, но в отсутствии профага RS^ [30]. Считают, что основным механизмом, обеспечивающим горизонтальный перенос гена ctxB1, могла быть трансформация, происходящая в биопленке, образующейся на хитиновом субстрате, или конъюгация [10, 25]. Вместе с тем это предположение до сих пор не получило экспериментального подтверждения.
В этой связи для исследования механизма возникновения эпидемически опасных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор впервые были проведены модельные эксперименты их образования в процессе конъюгации; исследованы фенотипические и молекулярно-биологические свойства полученных рекомбинантов; дана оценка экспрессии их генов вирулентности и жизнеобеспечения с помощью проте-омного анализа.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, плазмида, транспозон. В работе использовали следующие штаммы Escherichia coli и V. cholerae: E. coli С600 (pRP4-4) (ApR, TcR, KmS); V. cholerae О1 МАК757 биовар Эль Тор, клинический штамм, выделенный в 1937 г. на о. Целебес (Индонезия); V. cholerae М818 биовар Эль Тор, выделенный в Саратове в 1970 г.; V. cholerae О1 569В биовар классический, клинический штамм, выделенный в 1948 г. в Индии; V. cholerae О1 МАК757 chr:: Tn5-Mob (KmR Tox++) биовар Эль Тор, производный штамма V.cholerae О1 МАК757. Для получения донорного штамма мы использовали описанную ранее методику [36]. Штаммы V.cholerae были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий. Штамм E. coli С600 (pRP4-4) предоставлен Т.С. Ильиной, НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, Москва.
Питательные среды и условия культивирования штаммов. Для культивирования бактерий использовали бульон или агар (LB) Luria-Bertoni. Минимальной средой служили глюкозо-солевой агар и соответствующая жидкая среда. Аминокислоты ("Serva", "Merk") вносили в концентрации 20-40 мкг/мл, антибиотики - канамицин (50 мкг/мл), ампициллин (50 мкг/мл), тетрациклин (2 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл). Культивирование проводили при различных температурных режимах (30 и 37оС).
Таблица 1
Последовательности праймеров, использованные в работе
Название праймера Последовательность праймера (5' - 3') Ген-мишень Температура отжига, °C Ссылка
cep-F cep-R CAGAACAATTGCCCCCACCAC AAGCACGCTTTCACTCGGGG cep 55 Рассчитаны авторами
orfUl orfU2 CAAAATGAGCATGGCGGC CCCATTGTGCAATCGGTGT orfU 57 Рассчитаны авторами
acel ace2 TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG ace 60 [40]
zotl zot2 TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT AACCCCGTTTCACTTCTACCCA zot 60 [37]
CTX3 CTX2 CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG ctxA 62 [16]
Fw-con** ACTATCTTCAGCATATGCACATGG ctxBClass ctxBEt
Rv-class** CCTGGTACTTCTACTTGAAACG 58 [24]
Rv-eltor** CCTGGTACTTCTACTTGAAACA
rstAl rstA2 ATCGTCGTGAATTTCCTTAG GCGATTAGTCTCTGAGCC rstA 55 Рассчитаны авторами
rstBl rstB2 CGTGATGGGTCTTCTGGGTC TGGTGCCTCTCATTCTGAAG rstB 58 п ,,
rstCl rstC2 AACAGCTACGGGCTTATTC TGAGTTGCGGATTTAGGC rstC 55 [39]
Tn5-Mob1 Tn5-Mob2 AGTAGCGTCCTGAACGGAACCTTT AAGAGAACGGAGTGAACCCACCAT Tn5 59 Рассчитаны авторами
TLCR1 TLCR2 CTCTTCCTCATCCTCTGTCAG GAGGATCACACTAGACGGGTA tlcR 60 п п
cri-TLCl cri-TLC2 AAAAAGGACGTAATCATCGAAATGG CGGACGTTGATTGTCGAAGTTAAAG cri 60 п п
rtxAl rtxA2 CACTCATTCCGATAACCAC GCGATTCTCAAAGAGATGC rtxA 55 [21]
rtxCF rtxCR CGACGAAGATCATTGACGAC CATCGTCGTTAATGTGGTTGC rtxC 59 [13]
rstA-3R* rstR-lF (Class)* TCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTG CTTCTCATCAGCAAAGCCTCCATC rstRClass rstREt 58 [9]
rstR-2F (Et)* GCACCATGATTTAAGATGCTC
ctxBl* ctxB2* ATGATTAAATTAAAATTTGG TTAATTTGCCATACTAATTG ctxB 42 [35]
prctxABl* prctxAB2* ATGGGCGACAGGTCATCACATTTAC GAACTCAGACGGGATTTGTTAGGCA promoter ctxAB 57 Рассчитаны авторами
Примечание. * - праймеры использовались для секвенирования, ** - праймеры для Mismatch Amplication Mutation Assay-ПЦР: Fw-con - прямой праймер, общий для обох аллелей, Rv-class - обратный праймер для аллеля ctxBl, Rv-eltor - обратный праймер для аллеля ctxB3.
Конъюгационные скрещивания. Межродовые (E. coli с V. cholerae) и внутривидовые (V.cholerae с V.cholerae) скрещивания проводили на LB-агаре по описанному методу [11]. При межродовых скрещиваниях контрселекцию донора осуществляли на основе его ростовых потребностей. В случае проведения внутривидовых скрещиваний селективной средой служил LB-агар, содержащий канамицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Частоту передачи плазмиды или хромосомного маркера определяли в расчете на 1 клетку донора.
Определение продукции CT. Определение продукции СТ штаммами V.cholerae проводили с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментного метода GM1ELISA. РПИГ ставили по модифицированному методу [12]. Изолированные колонии изучаемых штаммов методом реплик переносили на чашки
с 1% синказным агаром, содержащим 1% отмытых в синказ-ном бульоне эритроцитов барана. Посевы инкубировали 18 ч при 30оС, затем заливали слоем 0,5% синказного агара, содержащего азид натрия (NaN3), комплемент морской свинки и кроличью антитоксическую сыворотку и помещали в термостат на 1-2 ч при 37оС. После инкубации вокруг макроколоний, продуцирующих и секретирующих в культуральную среду СТ, формировалась зона специфического гемолиза. Количественно продукцию СТ определяли иммуноферментным GM1-ELISA [39]. Разведения очищенного холерного токсина («Sigma chemicals») известной концентрации использовали для построения стандартной кривой и оценки СТ в образцах. ELISA осуществляли, используя кроличьи антитоксические антитела и антикроличий IgG, конъюгированный с перокси-дазой хрена («Gibco-BRL»).
Внутрикишечное заражение крольчат-сосунков клетками изогенных штаммов с разным уровнем продукции холерного токсина. Вирулентность изучаемых штаммов определяли путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков по методу, описанному в работе [14]. Кроликам в возрасте 8-10 дней массой 130-160 г под наркозом внутрикишечно вводили 107 вибрионов в 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Через 48 ч всех погибших или умерщвленных хлороформом животных вскрывали, регистрировали макроскопические изменения в толстом и тонком кишечнике. Определение вирулентности проводили с соблюдением всех требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными.
ПЦР-анализ. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при условиях, описанных в работе [13]. Ампликоны разделяли с помощью агарозного гель-электрофореза (1,5%) в 0,5 х Трис/борат/EDTA буфере. Продукты окрашивали этидием бромида, визуализировали под УФ-светом и фотографировали на гель-документирующей системе. Mismatch Amplification Mutation Assay-ПЦР проводили в соответствии с методикой, описанной в работе [24]. Праймеры, использованные в этой работе, приведены в табл. 1.
Саузерн-блот-гибридизация и ДНК-зонды. Выделение хромосомной ДНК, рестрикционный анализ и блот-гибридизацию по Саузерну с молекулярным зондом проводили по методам, описанным в работе [5]. Мечение ДНК дигоксигенином и ее детекцию проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя «Roche Molecular Biochemicals». Выделенную хромосомную ДНК обрабатывали рестрикционной эндону-клеазой PstI («Fermentas»). Полученные фрагменты разделяли в 1% агарозном геле методом электрофореза и переносили на нейлоновые фильтры для гибридизации. Молекулярный зонд, используемый для выявления генов CT, представлял собой ПЦР-ампликон фрагмента гена ctxA, кодирующего биосинтез А-субъединицы CT. Размер CT-зонда составил 564 п.н.
ДНК-секвенирование. Определение нуклеотидной последовательности профага СТХф проводили на приборе «3500xL Genetic Analyzers» («Applied Biosystems», США) по методу, описанному в работе [33]. Нуклеотидные последовательности изучаемых штаммов сравнивали с соответствующими последовательностями референс-штаммов N16961 Эль Тор биовара и О395 классического биовара, взятыми из GeneBank, используя программу MEGA 4.
Протеомный анализ. Двухмерный электрофорез проводили по методу, описанному в работе [29], со следующими модификациями: бактериальные клетки изучаемых штаммов лизиро-вали в буфере L, содержащем 7 М мочевину, 2 М тиомочеви-ну, 65 мМ DTT, 5% Ampholine 3-10 («Amersham»), 4% CHAPS («Amersham»), 1,5% NP-40. Каждый образец (150 мкг белка) подвергали изо-электрофокусированию с последующим разделением по молекулярным массам электрофорезом в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) по методу, описанному в работе [19]. Разделение во втором измерении (SDS-PAGE) проводили в градиентном 9-16% полиакриламидном геле (толщина 1,5 мм), используя установку PROTEAN II XI 2-D Cell («Bio-Rad») при токе 35 мА на гель в течение 6 ч при комнатной температуре. После электрофореза гели фиксировали в растворе 20% этанола в 10% уксусной кислоте и окрашивали серебром в присутствии тиосульфата. Масс-спектры получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex III («Bruker») с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс от 500 до 8000 Д. Полученные масс-спектры калибровали, используя известные массы внутренних стандартов. Идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot (Matrix Science) с точностью определения массы МН+, равной 0,01%, допуская возможность модификации цистеинов акрила-мидом и окисления метионинов. При поиске белков привлекали базы данных NCBI.
Результаты и обсуждение
Получение геновариантов возбудителя холеры Эль Тор, несущих ген ctxB1 холерных классических вибрионов. На первом этапе работы был сконструирован донорный штамм, способный к переносу гена ctxB1 в процессе конъюгации, а также подобран реципиент,
относящийся к типичным вирулентным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор, несущим аллель ctxB3 в составе профага СТХ^ф.
Для создания донорного штамма была использована описанная в работе [34] бинарная система, состоящая из транспозона Tn5-Mob (KmR) и плазмиды-помощника pRP4-4 (ApRTcRKmS). Указанный транспозон, определяющий резистентность к канамицину, был удобен тем, что имел в своем составе начало переноса (oriT) плазмиды pRP4-4 (ApRTcRKmS), получившую обозначение как область Mob. Полученные ранее данные показали, что внедрение Tn5-Mob в бактериальную хромосому при наличии в клетке дополнительного tra-оперона плазмиды pRP4-4 в трансположении может обеспечить направленный перенос хромосомных генов [2, 36]. В связи c этим для дальнейшей работы был взят сконструированный нами ранее высокотоксигенный штамм биовара Эль Тор V. cholerae MAK757 chr::Tn5-Mob, KmR, Tox++, являющийся производным предпандемического штамма MAK757, несущего профаг СТХс1ж8ф классического типа [8]. Выбор этого штамма был обусловлен внедрением транспозона Tn5-Mob в хромосому вблизи одной копии профага CTXC1as^ (см. рис.1, а). Такая локализация транспозона позволяла использовать KmR в качестве селектируемого маркера при отборе рекомбинантов, получивших донорный аллель ctxB1. С целью получения донорного штамма в клетки V.cholerae МАК757 chr::Tn5-Mob KmRTox++ была введена плазмида-помощник pRP4-4 (ApRTcRKmS). Донором этой плазмиды служил штамм E. coli С600 (pRP4-4). В результате конъюгационных скрещиваний были получены трансконъюганты V. cholerae MAK757chr::Tn5-Mob (pRP4-4), фенотип которых был ApRTcRKmR. Частота переноса плазмиды pRP4-4 составляла 7-104. Полученные трансконъюганты проверяли на донорные свойства в скрещиваниях с реци-пиентным штаммом биовара Эль Тор V.cholerae М838 StrRTox+, несущим в хромосоме одну копию профага CTXE^ (рис. 2, дорожка 3) и продуцирующим незна-
Рис. 2. Результаты ДНК-ДНК-гибридизации донорного, реци-пиентного и рекомбинантных штаммов V.cholerae биовара Эль
Тор.
Цифрами обозначены дорожки: 1 - исходный штамм MAK757, 2 -донорный штамм KM7P, 3 - реципиент M818, 4-6 - рекомбинантные штаммы R1-R3.
Рис. 3. Продукция холерного токсина по данным РПИГ KmRTox++ рекомбинантами V. cholerae биовара Эль Тор, полученными при скрещивании донора V. cholerae KM7P c реципиентным штаммом V. cholerae М818. 1-2 - реципиент M818; 3-6, 7-10, 11-14 -рекомбинанты R1-R3 соответственно; 15-16 - донорный штамм KM7P; 17-18 - высокотоксигенный штамм V. cholerae 569В классического биовара, взятый в качестве положительного контроля.
чительное количество СТ. Рекомбинанты отбирали на питательной среде, содержащей канамицин. Рост донорных клеток предотвращали добавлением в селективную среду стрептомицина. Из 15 проверенных клонов ApRTcRKmR все оказались способны к переносу хромосомного маркера KmR. Клон, показавший наиболее эффективный перенос этого маркера (5-10-6), был выбран в качестве донора и обозначен V. cholerae КМ7Р chr::Tn5-Mob (pRP4-4). Таким образом, сконструированный донорный штамм биовара Эль Тор V cholerae КМ7Р chr::Tn5-Mob (pRP4-4) содержал в геноме профага CTXClass9 ген ctxBl и имел фенотип ApRTcRKmRTox++. Реципиентный штамм V. cholerae M818 StrR биовара Эль Тор, несущий в отличие от донора CTXEt9 с геном ctxB3, имел фенотип Tox+.
Второй этап работы заключался в проверке KmR-рекомбинантов, полученных при скрещивании донора КМ7Р с реципиентом М818, на наследование ими неселектируемого донорного аллеля ctxBl. Посколь-
ку известно, что донорный штамм, как и другие природные геноварианты, несущие классический аллель гена ctxB (ctxBl), как правило, продуцируют заметно больше СТ по сравнению с типичными штаммами [26, 38], мы полагали, что KmR-рекомбинанты, получившие донорный аллель ctxBl, должны отличаться от реципиента повышенной продукцией этого белка. В связи с этим присутствие неселектируемого аллеля ctxBl у KmR-рекомбинантов определяли путем оценки у них продукции СТ с помощью простого чашечного метода - РПИГ на плотной среде. В результате среди проверенных 505 KmR-клонов было выявлено 7 рекомбинантов, отличающихся от реципиента более высоким уровнем продукции СТ (рис. 3, кружки 3-14). Согласно данным иммуноферментного метода GM1ELISA, продукция СТ рекомбинантами составляет 2,5-3,6 мкг/мл, превышая таковую у реципиентно-го штамма (0,2 мкг/мл) в 12-18 раз. Согласно нашему предположению, обнаруженное изменение продукции СТ у изученных KmR-рекомбинантов могло быть следствием изменения структуры их профага СТХф за счет приобретения гена ctxB классического типа (аллель ctxBl) от донорного штамма. В связи с этим у полученных рекомбинантов был определен аллель гена ctxB методом Mismatch Amplification Mutation Assay-ПЦР, позволяющей дифференцировать одно-нуклеотидные замены в этом гене. Оказалось, что все рекомбинанты действительно имели донорный аллель ctxBl, тогда как в геноме профага реципиента присутствовал аллель ctxB3 (табл. 2, см. рис.1, б, в). Последующее секвенирование гена ctxB указанных штаммов подтвердило эти данные. У всех рекомби-нантов в нуклеотидной последовательности гена ctxB в позициях 115 и 203 присутствует цитозин (С), тогда как у реципиентного штамма - тимин (Т). Таким образом, изменение уровня продукции СТ у рекомби-нантов было непосредственно связано с появлением в их геноме нового аллеля гена ctxB, а именно ctxBl. Это означает, что полученные рекомбинанты являются геновариантами V. cholerae биовара Эль Тор, несущими ген ctxB классического типа (ctxBl). Сце-пленность селектируемого маркера KmR с неселек-тируемым ctxBl была невысокой и составляла лишь
Таблица 2
Результаты ПЦР-анализа генома штаммов донора, реципиента и рекомбинантов V cholerae биовара Эль Тор
Название штамма СТХф Tn5-Mob RS^ 1ЪСф RTX
коровая область RS2-область rstC tlcR cri rtxA rtxC
cep orfU ace zot ctxA ctxBl ctxB3 rstRC"~ rstREt rstA rstB
KM7P + + + + + + - + - + + + - + + + +
M818 + + + + + - + - + + + - + + + + +
R1 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R2 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R3 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R4 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R5 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R6 + + + + + + - - + + + + + + + + +
R7 + + + + + + - - + + + + + + + + +
Примечание. ctxBl - аллель гена ctxBClass, ctxB3 - аллель гена ctxBEt.
210
-- I -
220
.- I -
230
-- I -
240
-- I -R
250
-- I -
260
-- I -R
270
-- I -
280
-- I -R
290
-- I -
300
--
0395
КМ7Р
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
M818 N16961
AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA AAACAGGAAA
TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA TGATAAAAAA
GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA GGACTAAATA
GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG GTATATTTTG
TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT TGATT
TTTGAI I I I I TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGATTT— TTTGAI I I I I TTTGAI I I I I
GAI I I I IGAT TTTTGATTTT TGATTTCAAA TAATACAAAT
---------- ----------------CAAA TAATACAAAT
---------- ----------------CAAA TAATACAAAT
GATTT-GATTT-
-CAAA TAATACAAAT -CAAA TAATACAAAT
-CAAA TAATACAAAT -CAAA TAATACAAAT
-CAAA TAATACAAAT -CAAA TAATACAAAT
-CAAA TAATACAAAT -CAAA TAATACAAAT
Рис. 4. Нуклеотидные последовательности промоторной области полученных рекомбинантов V. Ло1егае R1-R7 биовара Эль Тор. Буквой R обозначены гептаповторы ТТТТGAT; О395 - референс-штамм V. Ло1егае классического биовара; донор - донорный штамм V. Ло1егае КМ7Р биовара Эль Тор; R1-R7 - КтТох++ рекомбинантные штаммы; М818 - реципиентный штамм М818 V. Ло1егае биовара Эль Тор; N16961 - референс-штамм КЛо1ете биовара Эль Тор.
1,4%. Тем не менее нами впервые в модельных экспериментах показана возможность образования новых вариантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной продукцией СТ.
Сравнительный анализ вирулентных свойств ре-ципиентного штамма V. cholerae M818 биовара Эль Тор и геновариантов с повышенной продукцией СТ. Поскольку природные геноварианты V cholerae биовара Эль Тор отличаются от типичных штаммов повышенной вирулентностью, встал вопрос о степени вирулентности рекомбинантов, содержащих в геноме аллель ctxBl. Для его решения было проведено вну-трикишечное заражение крольчат-сосунков клетками реципиентного штамма M818 и двух произвольно выбранных геновариантов в трех разных дозах (107, 105 и 102 КОЕ) и проведено сравнение патологоанатоми-ческой картины по характеру поражения кишечника животных.
В результате было установлено, что в отличие от реципиента рекомбинанты вызывали развитие специфического холерогенного эффекта (сильное растяжение тонкого и толстого кишечника животных за счет наполнения их прозрачной опалесцирующей жидкостью) при заражении крольчат не только высокими (105, 107 КОЕ), но и низкими (102 КОЕ) дозами. Этот факт свидетельствует о более высокой вирулентности полученных рекомбинантов по сравнению с реципиентом, являющимся типичным штаммом V. cholerae биовара Эль Тор, и подтверждает их гено- и фено-типическое сходство с природными геновариантами возбудителя холеры.
Молекулярно-генетический анализ экспериментально полученных геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной продукцией СТ. Наличие значительной области гомологии как в коровой, так и в RS-2-области профагов донора и реципиента, могло обеспечить получение рекомбинантов, содержащих весь геном профага CTXc,as^. Однако ПЦР-анализ отобранных рекомбинантов KmRTox++ показал, что во всех случаях происходило, видимо, наследование генов лишь коровой области профага. Об этом свидетельствует тот факт, что рекомбинанты имели все тестируемые гены коровой области (ctxA, ctxBl, zot, ace, orfU и cep), но не наследовали донорный аллель гена rstR (rstRc,ass), входящего в состав последовательности RS-2 (см. табл. 2). Сохранение у рекомбинантов реципиентного аллеля rstREl было подтверждено секвенированием этого гена. Далее мы сравнили ну-
клеотидную последовательность промотора оперо-на ctxABl рекомбинантов с таковой реципиентного и донорного штаммов. Известно, что транскрипция оперона ctxAB начинается с собственного промотора. Первым считывается ген ctxA, затем ctxB. Гены считываются в разных рамках и имеют собственные сайты связывания с рибосомами, каждый из которых состоит из последовательности Shine-Dalgamo (SD) и стартового триплета ATG [22]. Особенность про-моторного района оперона ctxAB состоит в том, что на расстоянии 77 п.н. от стартового кодона локализована тандемно повторяющаяся последовательность 5'-TTTTGAT-3', которая, взаимодействуя с регуля-торными белками ToxR и ToxT, усиливает транскрипцию оперона. При этом уровень экспрессии оперона ctxAB зависит от числа повторов 5'-TTTTGAT-3' [42]. Результаты секвенирования показали, что в промо-торной области донорного штамма имеется 3 повтора 5'-TTTTGAT-3', тогда как у реципиента обнаружены 4 копии этой последовательности. Что касается ре-комбинантов, то в промоторной области их оперона ctxABl содержится, как у донорного штамма, 3 повтора 5'-TTTTGAT-3' (рис.4). Такие данные указывают на то, что рекомбинанты получили от донорного штамма по крайней мере весь оперон ctxABl с промоторной областью. Более точное заключение было трудно сделать в связи с тем, что входящие в коровую область генома профагов СТХс1ажф и СТХЕ'ф другие гены (zot, ace, orfU, cep) являются идентичными, что затрудняет идентификацию их переноса при ПЦР-анализе. Было также установлено, что, согласно данным блот-гибридизации по Саузерну PstI-фрагментов хромосомной ДНК с СТ-зондом, все проверенные ре-комбинанты содержали одну копию профага (см. рис. 2, дорожки 4-6).
Таким образом, показано, что полученные экспериментальным путем геноварианты сформировались в результате включения в хромосому реципиентного штамма участка донорной ДНК, содержащей транс-позон Tn5-Mob и прилежащий к нему фрагмент генома профага СТХс1ажф с опероном ctxAB и его про-моторной областью. При этом следует отметить присутствие в геноме профага этих геновариантов генов холерного вибриона обоих биоваров - Эль Тор (rstREt) и классического (ctxBl). Этот факт свидетельствует о наличии у них гибридного профага СТХНуЬгф.
Важным, на наш взгляд, был вопрос о генетическом окружении профага СТХНуЬгф у рекомбинант-
ных штаммов, поскольку донорный и реципиентный штаммы различались между собой по этому свойству. Из трех известных генетических элементов (RS1ф, ^Сф и RTX), локализованных на хромосоме холерных Эль Тор вибрионов вблизи профага СТХф, донорный штамм содержал лишь два (^Сф и RTX), тогда как у реципиентного штамма присутствовали все указанные нуклеотидные последовательности (см. рис. 1,а). Для его решения был проведен ПЦР-анализ двух участков хромосомной ДНК рекомбинантов, прилежащих с обеих сторон к их профагу СТХНуЬгф. Оказалось, что все рекомбинанты содержали профа-ги RS1ф и ^Сф а также RTX. Этот факт свидетельствует о том, что генетическое окружение профага рекомбинантов (СТХНуЬгф) не отличалось от такового профага СТХЕ'ф реципиента (см. табл. 2, рис. 1,а). Все вышеприведенное свидетельствует о том, что в ходе конъюгации реципиентный штамм получил от донора лишь фрагмент хромосомы, содержащий транспозон Тп5-МоЬ, а также участок генома профага СТХС1ажф, включающий в себя оперон ctxAB1 с промоторной областью. Интеграция указанного фрагмента ДНК в хромосому реципиентного штамма привела к возникновению рекомбинантов V. cholerae биовара Эль Тор, имеющих те же генетические особенности, что и природные геноварианты возбудителя холеры, а именно наличие в хромосоме гена ctxB1 холерных классических вибрионов.
Сравнительный протеомный анализ реципиент-ного штамма V. cholerae M818 и геноварианта с гиперпродукцией СТ. Заметное повышение токсиген-ности и вирулентности полученных рекомбинантов (геновариантов) может быть связано с изменением активности их различных генов патогенности и жизнеобеспечения. Если это так, то рекомбинанты должны отличаться от реципиентного штамма не только по уровню экспрессии СТ, но и других белков, выполняющих в клетке различные функции. Для проверки этого предположения совместно с протеомным центром ИБХМ им. Б.Н. Ореховича методом двумерного гель-электрофореза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии были получены протеомные карты реципиентного штамма М818 и рекомбинанта R1.
При компьютерном анализе протеомных карт исследуемых штаммов было выявлено 2338 белков. Их сравнительный анализ показал, что в клетках реком-бинанта R1 действительно изменился уровень экспрессии 26 белков, среди которых биосинтез 17 повысился, 9 белков понизился (рис. 5). Для последующей идентификации методом масс-спектрометрии было отобрано 13 белков, экспрессия которых достоверно различалась у сравниваемых штаммов более чем в 2 раза (табл. 3). Среди них обнаружено 8 белков, уровень экспрессии которых у рекомбинанта повышен в 2,34,3 раза по сравнению с реципиентным штаммом. Эти белки принимают участие в таких важных процессах в клетке, как энергетический и метаболический обмен (дегидролипоамиддегидрогеназа, КФ 1.8.1.4; 4-гидро ксифенилпируватдиоксигеназа, КФ1.13.11.27; аланин дегидрогеназа, КФ 1.4.11), транспорт аминокислот, пептидов и аминов (переносчик АВС-олигопептидов, периплазматический олигопептидсвязывающий белок), а также фолдинг белков и защита клетки от повреждающего действия высоких температур (шапе-
Рис. 5. Протеинограмма реципиентного штамма V. cholerae М818 биовара Эль Тор (а) и рекомбинанта R1 (б) с повышенной продукцией СТ. Диапазон рН при изофокусировании 4-7. Цифрами отмечены белки, экспрессия которых изменена у сравниваемых штаммов в 2 раза и более.
рон GгoL). Кроме того, у рекомбинантов более чем в 3 раза повышена экспрессия белка-порина ОтрТ, который входит в состав клеточной стенки и регулируя поступление в клетку воды, питательных веществ и различных соединений, обеспечивает устойчивость бактерий к действию органических кислот и анионных детергентов [23]. Вместе с тем выявлено 5 белков, содержание которых у рекомбинанта R1 снижено в 2-,2 раза. К ним относятся уридинфосфорилаза (КФ 2.4.2.3), железосодержащая алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1), а также модифицированные формы ала-ниндегидрогеназы и 4-гидроксифенилпируватдиокси геназы. Все эти ферменты участвуют в метаболизме и энергетическом обмене. Особого внимания заслуживает существенное снижение в клетке рекомбинанта универсального стрессового белка №рЕ, ответственного за устойчивость бактерий к оксидазному стрессу (см. табл. 3).
Таким образом, из анализа полученных результатов следует, что включение в хромосому рекомбинан-тов нового участка ДНК с транспозоном Тп5-МоЬ и
Таблица 3
Идентификация белков реципиентного штамма V сЬо1егае М818 биовара Эль Тор и KmRTox++-рекомбинанта И методом масс-
спектрометрии
Но- Название белка Локус Ген Обозначение в базе данных МСВ1 Молеку- р1* Интенсивность пятен Функция
мер пятна хромосомы лярная масса, Д Я1 М818
Метаболизм и энергетический обмен
765 Уридинфосфорилаза VC1034 udp-1 gi|229505371 27 063 5,7 1,4±0,06 5,9±0,05 Метаболизм пуринов, перимидинов, нуклео-зидов и нуклеотидов
826 Железосодержащая алко-гольдегидрогеназа VCA0702 аА gi|15601458 41 961 5,79 4,1±0,05 8,4±0,05 Метаболизм алкоголя
676 Дегидролипоамиддеги-дрогеназа VC2412 1рШЛ gi|15642409 50 963 5,79 5,5±0,05 2,3±0,05 Энергетический обмен: дегидролипоамид
1099 4-гидроксифенилпируват-диоксигеназа VC1344 hppD gi|153802276 40 321 5,46 1,4±0,06 3,3±0,05 Энергетический обмен: аминокислоты и амины
2332 4-гидроксифенилпируват-диоксигеназа VC1344 hppD gi|153802276 40 321 5,46 7,1±0,05 1,6±0,06 Энергетический обмен: аминокислоты и амины
1037 Аланиндегидрогеназа VC1905 аШ gi|15641907 39 814 5,88 9,6±0,05 4,0±0,05 Энергетический обмен: аминокислоты и амины
2425 Аланиндегидрогеназа VC1905 аШ gi|15641907 39 814 5,88 1,4±0,06 5,0±0,05 Энергетический обмен: аминокислоты и амины
Транспорт и связывание
619 Переносчик АВС-олиго-пептидов, периплазма-тический олигопептид-связывающий белок VC1091 оррА gi|15641104 61 102 6,02 8,7±0,05 2,5±0,05 Транспорт и связывание протеинов: аминокислот, пептидов и аминов
635 Переносчик АВС-олиго-пептидов, периплазма-тический олигопептид-связывающий белок VC1091 оррА gi|15641104 61 102 6,02 7,2±0,05 2,2±0,05 Транспорт и связывание протеинов: аминокислот, пептидов и аминов
978 Белок-переносчик длин-ноцепочечных жирных кислот VC1043 gi|15641056 46 768 4,85 6,0±0,05 2,3±0,06 Транспорт жирных кислот
Белки внешней мембраны
2337 Белок ОтрТ VC1854 отрТ gi|121591724 36 208 4,48 9,9±0,05 3,0±0,06 Белок-порин внешней мембраны
Защитная функция
1331 Универсальный стрессовый белок ШрЕ VC1433 уШаЛ gi|15641444 35 281 5,6 1,9±0,06 8,0±0,05 Защита от оксидатив-ного стресса
Фолдинг и стабилизация белков
665 Шаперон Огс^ VC2664 groL-1 gi|356443417 55 459 4,71 6,9±0,05 2,3±0,05 Фолдинг и стабилизация белков
Примечание. * - изоэлектрическая точка; жирным шрифтом выделены значения интенсивности белковых пятен, отличающиеся по уровню экспрессии соответствующих белков в 2 раза и более; приведены средние показатели интенсивности белковых пятен трех экспериментов, различия между которыми статистически незначимы.
опероном с1хЛВ1 действительно сопровождалось изменением активности ряда его генов. Выявлено 26 генов, экспрессия которых у рекомбинанта отличается от таковой у реципиентного штамма. При этом значительная часть генов, кодирующих идентифицированные белки, локализована на первой хромосоме, которая, как известно, содержит гены, необходимые для проявления вирулентности и жизнедеятельности клетки. Лишь один ген, кодирующий железосодержащую алкогольдегидрогеназу, расположен на 2-й хромосоме. Найденные белки, уровень экспрессии которых различается у реципиентного штамма и рекомбинанта, участвуют в различных процессах в клетке, а именно в метаболизме и энергетическом обмене, транспорте различных веществ, а также в
защите клетки от стрессовых воздействий окружающий среды. Нам, однако, не удалось обнаружить различий в экспрессии белков, непосредственно связанных с патогенностью. Это может означать, что такие белки, определившие повышенную вирулентность рекомбинантов, могли относиться к секретируемым. Механизм изменения экспрессии генов, кодирующих выявленные белки, а также СТ, остается пока неизвестным. Можно лишь предположить, что индукция или репрессия указанных белков у рекомбинанта может быть следствием изменения активности каких-то глобальных регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов, связанных не только с вирулентностью, но и с жизнеобеспечением клетки [17, 20, 34]. В целом же измененная экспрессия указанных генов
у рекомбинантов может, видимо, повысить устойчивость таких штаммов к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.
Итак, впервые проведено экспериментальное моделирование возникновения вирулентных геновари-антов возбудителя холеры Эль Тор и представлены результаты исследования их молекулярно-генетических и фенотипических свойств. В процессе конъюгаци-онных скрещиваний сконструированного донорного штамма с реципиентом, содержащих разные типы профага СТХф (СТХС1ажф и СТХЕ'ф), получены ре-комбинанты V. сЫ1егае биовара Эль Тор, несущие оперон с!хАВ1 холерных классических вибрионов, которые по изученным генетическим и фенотипиче-ским свойствам не отличаются от природных генова-риантов возбудителя 7-й пандемии холеры. Встраивание участка генома профага СТХС1ажф в хромосому типичного штамма V. ^о1егае биовара Эль Тор привело к существенному повышению токсигенности и вирулентности полученных рекомбинантов (генова-риантов). Более того, у геновариантов обнаружены выраженные изменения уровня экспрессии более 1% генов жизнеобеспечения. Возможно, именно этим обстоятельством можно объяснить высокий уровень адаптации природных геновариантов к стрессовым воздействиям окружающей среды. Полученные данные о механизме образования геновариантов, содержащих гены холерных классических вибрионов, а также о структуре и функции их генома важны не только для понимания ключевых событий, происходящих в естественных популяциях возбудителя на современном этапе его эволюции. Имеющиеся сведения могут также представлять большой интерес для исследований, направленных на конструирование штаммов-продуцентов иммуногенных белков, используемых при изготовлении холерных диагностических и профилактических препаратов.
Авторы признательны зав. отделом протеомных исследователей ФГБУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Орехови-ча д-ру биол. наук С.А. Мошковскому за содействие при проведении протеомного анализа двух штаммов холерного вибриона.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант 12-04-00285а.
Сведения об авторах:
Смирнова Нина Ивановна - зав. лаб. патогенных вибрионов.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46. ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов
Е-шаП: rusrapi@microbe.ru;
Агафонов Дмитрий Алексеевич - аспирант лаб. патогенных вибрионов;
Щелканова Елена Юрьевна - ст. науч. сотр. лаб. патогенных вибрионов;
Заднова Светлана Петровна - вед. науч. сотр. лаб. патогенных вибрионов;
Черкасов Александр Вадимович - мл. науч. сотр. лаб. геномного и протеомного анализа;
Кутырев Владимир Викторович - дир. института.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.; 1971.
2. ЖуравлеваЕ.А., СмирноваН.И. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1991; 5: 15-9.
3. Ильина Т.С. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003; 4: 3-10.
4. Ильина Т.С., РомановаЮ.М. Молекулярная биология. 2002; 36: 225-39.
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.; 1984.
6. Смирнов Г.Б. Успехи современной микробиологии. 2008; 128(1): 52-76.
7. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; 11-9.
8. Щелканова Е.Ю., Горяев А.А., Смирнова Н.И. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2008; 3: 11-7.
9. Bhattacharya T., Chatterjee S., Maiti D. et al. Environ. Microbiol. 2006; 8(3): 526-634.
10. BlokeschM, Schoolnik G.K. J. Bacteriol. 2008; 190(21): 7232-40.
11. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Bacteriol. 1980; 143(3): 1466-70.
12. BramuceiM. G, HolmesR.K. J. Clin. Microbiol. 1978; 2(2): 252-5.
13. Chow K.H. et al. J.Clin.Microbiol. 2001; 30: 2594-7.
14. Dutta N.K., Habbu M.K. Brit. J. Pharmacol. 1955; 256(23): 12252-6.
15. Faruque S.M.A., Kamruzzaman M., Nandi R.K. et al. J. Clin. Microbiol. 2002; 31: 22-5.
16. Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik O. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(8): 2118-21.
17. Goss T.J., Morgan S.J., French E.L., Krukonis E.S. Infect. Immun. 2013; 81(3): 884-95.
18. Hassan F., KamruzzamanM., Mekalanos J.J., Faruque S.M. Nature. 2010; 467(7318): 982-5.
19. Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-5.
20. Lery L., Goulart C., Figueiredo F. et al. J. Proteomics. 2013. http://dx.doi.org//10.1016/j.jprot.2013.04.038
21. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 1071-6.
22. Mekalanos J.J. Cell. 1983; 35: 253-63.
23. MerrellD.S., Tischler A.D., LeeS.H., CamilliA. Infect Immun. 2000; 68: 6691-6.
24. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. J. Microbiol. Immunol. 2008; 52: 6: 314-417.
25. Morita M., Yamamoto Sh., Hiyoshi H. et al. Microbiol. Immunol. 2013; 57: 334-9.
26. NahaA., Chowdhury G., Ghosh-Banerjee J. et al. J. Clin. Microbiol. 2013; 51(3): 1040-5.
27. Nusrin S., Khan G.Y., Bhuiyan N.A. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(12): 5854-6.
28. Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B. et al. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1): 22-5.
29. O'FarrellP.H. J. Biol. Chem. 1975; 250: 4007-21.
30. O'Shea Y., Reen F., Quirke A., Boyd E. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(10): 4657-71.
31. Rubin E.J., Lin W., Mekalanos J.J., Waldor M.K. Mol. Microbiol. 1998; 28(6): 1247-54.
32. SafaA., NairB., KongR. Trends Microbiol. 2010; 18: 46-54.
33. SangerF., Nicklen L., CoulsonA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74: 5463-7.
34. Shikuma N., Davis K., Fong J., Yildiz F. Environ. Microbiol. 2013; 15(5): 1387-9.
35. Siddique A.K., Zaman K., Akram K. et al. Trop. Geogr. Med. 1994; 46(3): 147-50.
36. Simon R. Mol. Gen. Genet. 1984; 196(3): 413-20.
37. Singh D.V., MatteM.H., Matte G.R. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(2): 910-21.
38. Son M., Megli J., Kovacikova G. et al. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(11): 3739-49.
39. Svennerholm A.-M., Wiklund G. J. Clin. Microbiol. 1983; 17: 26270.
40. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J., Fasano A., Kaper J.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90(11): 5267-71.
41. Waldor M.K., Rubin E.J., Pearson G.D.N. et al. Mol. Microbiol. 1997; 24(5): 917-26.
42. Yu R.R., DiRita V.J. Mol. Microbiol. 2002; 43(1): 119-34.
Поступила 18.06.13
GENOVARIANTS OF THE CHOLERA AGENT BIOVAR EL TOR: CONSTRUCTION, MOLECULAR-GENETIC, AND PROTEOMIC ANALYSIS
N. I. Smirnova, D. A. Agafonov, E. Yu. Shchelkanova, S. P. Zadnova, A. V. Cherkasov, V. V. Kutyrev
Russian Research Anti-Plague Institute Microbe, Saratov
Experimental modeling of origination of the virulent Vibrio cholerae El Tor genovariants is presented. It was demonstrated that the genovariants obtained did not differ from the natural genetically modified strains emerged in a natural population of the agent, either in phenotypical or genotypic properties. Using the PCR assay and sequencing techniques it was proved that the constructed
genovariants carried a CTXClass9 prophage genome region with ctxBl gene of the V. cholerae classical biovar in the chromosome. It is shown that the prophage structure alterations lead to the increase in the toxigenicity and virulence in the genovariants compared to the typical strain-recipient. Moreover, as regards proteomics, changes in the expression of 26 proteins that perform various functions in the cell, such as metabolism, energy exchange, transportation, etc., were demonstrated. The data are indicative of the impact that a new DNA region in the genome of the genovariants has on the expression level of different house-keeping genes. The results obtained testify to the fact that one of the mechanisms of the genovariant emergence in the natural populations of the agent can be horizontal gene transfer. Key words: Vibrio cholerae genovariants; CTXp prophage; conjugation; recombinants; toxigenicity and virulence; proteome
© Е.Л. СУББОТИНА, В.Б. ЛОКТЕВ, 2014 УДК 578.839.28:578.522]:577.2.08
Е. Л. Субботина2, В. Б. Локтев12 3 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСА зАПАДНОГО НИЛА
1Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, 630090; ^Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирская область, 630559; 'Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, 630090
Проведены филогенетический анализ и оценка скорости эволюции вируса Западного Нила (ВЗН). Для анализа было использовано 68 нуклеотидных последовательностей белка Е ВЗН. Скорость накопления нуклеотидных замен составила 2,5-10"4 замен на сайт в год. Филогенетический анализ и оценка времени эволюции ВЗН с применением методологии молекулярных часов показали, что на территории европейской части России циркулируют 1, 2 и 4-й генотипы ВЗН с расчетным временем дивергенции от общего предшественника около 2360, 2800 и 5950 лет соответственно. Соотношение частот несинонимичных замен (¿Ы) к синонимичным (¿Б) может колебаться в пределах 0,022-0,275 для отдельных штаммов ВЗН, сгруппированных по географическому и/или филогенетическому признакам. Наиболее высокие значения соотношения ¿ЫМБ были обнаружены для современных изолятов ВЗН в России и Северной Америке, которые появились в новых природных биоценозах этих регионов в течение последних 14 лет. Оценка ¿ЫМБ для вида ВЗН показывает, что показатели внутривидовой изменчивости ¿ЫМБ могут быть использованы для оценки наличия ускоренной эволюции новых изолятов ВЗН. Все это подтверждает гипотезу о сложившихся благоприятных условиях для широкого распространения и быстрой эволюции различных генотипов ВЗН, возникших от 2 до 6 тыс. лет назад, в современных природно-климатических условиях.
Ключевые слова: флавивирусы; филогенетический анализ; синонимичные и несинонимичные замены; молекулярная эволюция; вирус Западного Нила
Вирус Западного Нила (ВЗН) - представитель семейства флавивирусов (Flaviviridae) был впервые выделен в 1937 г. в Уганде. Вирионы имеют типичные для флавивирусов формы и размеры, а геном ВЗН представлен одноцепочечной инфекционной РНК размером около 11 тыс. нуклеотидных остатков (н.о.) [17]. Геном ВЗН кодирует один полипротеин, который подвергается процессингу вирусными и клеточными протеазами с образованием 10 индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков, а 5'-и 3'-нетранслируемые районы РНК ВЗН принципиально важны для репликации вируса в клетке.
ВЗН достаточно часто обнаруживался на территории Европы, Африки и Азии, где он вызывает у людей заболевание, протекающее в легкой форме. В конце 90-х годов прошлого века высоковирулентные штаммы ВЗН были фактически одновременно выявлены
на территориях Северной Америки и юга европейской части России. Клинические проявления лихорадки Западного Нила (ЛЗН) во время этих вспышек заболевания варьировали в очень широких пределах [27, 31]. В большинстве случаев это была бессимптомная инфекция (около 80% случаев заражения), в остальных случаях развивались лихорадка различной степени тяжести с развитием симптомов поражения ЦНС, вирусные энцефалиты и тяжелые менинго-энцефалиты [11, 15]. Среди госпитализированных больных летальность достигала 10%, а среди лиц старшего возраста была существенно выше. Для последней вспышки ЛЗН на территории Северной Америки (США и Канада) в 2012 г., по предварительным данным, уровень летальности достигает 4,6% (http:// www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/ и http://www.phac-aspc.gc.ca/wnv-vwn/).
ВЗН относится к группе комариных флавивиру-сов, переносчиками (вектором) для которых являются комары. Происхождение и эволюция комариных флавивирусов тесно связаны с комарами родов Aedes и Culex [13, 20, 32]. Имеющиеся данные филогенетического анализа указывают на то, что предшественники многих современных комариных флавивиру-сов могли возникнуть на африканском континенте. Африканское происхождение вируса желтой лихорадки в странах Центральной и Южной Америки достаточно хорошо документировано, и есть все основания полагать, что занос вируса желтой лихорадки на Американский континент произошел около 300-400 лет назад во времена торговли рабами [10]. Хорошо известны примеры распространения комариных флавивирусов в течение последних десятилетий по обширным территориям Старого и Нового Света - это вирусы денге, Усуту, Кьясанурской лесной болезни и многие другие флавивирусы [8, 24, 25, 34]. Особое место в скорости распространения по новым территориям занимает ВЗН. Проникнув в 1999 г. на территорию атлантического побережья Северной Америки, ВЗН в течение всего нескольких
