CC BY
159
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.843.1:579.253].083.1
Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. мьуа-типирование клинических штаммов VIBRIO CHOLERAE,
изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры
Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт
«Микроб», 410005, Саратов
Проведено MLVA-типирование по 5 вариабельным локусам 52 штаммов V.cholerae биовара Эль-Тор, изолированных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры, а также 8 штаммов V.cholerae классического биовара - возбудителя предыдущих пандемий азиатской холеры. Показано, что исследуемые штаммы, различающиеся по молекулярно-генетическим свойствам и относящиеся к 38 MLVA-типам, входят в состав семи клональ-ных кластеров. Из них кластеры I и II образованы штаммами V.cholerae классического биовара и предпандемическими штаммами соответственно, а кластеры III-VII - штаммами V.cholerae биовара Эль-Тор, выделенными в разные временные периоды текущей пандемии. Установлено, что MLVA-типирование позволяет четко дифференцировать штаммы V.cholerae биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные. Последние отличаются от типичных штаммов более высоким уровнем вирулентности и присутствием в геноме гена ctxB классических холерных вибрионов. Обнаружена также возможность дифференциации геновариантов, выделенных в разные временные периоды и различающихся между собой по структуре острова пандемич-ности VSP-II. Поскольку существует прямая связь между структурой VSP-II и эпидемическим потенциалом штаммов, то выявленная возможность дифференциации изолятов с интактным и делегированным VSP-II методом MLVA заслуживает большого внимания. На основании полученных сведений высказано предположение о поликлональном происхождении разных штаммов геновариантов.
Ключевые слова: Vibrio cholerae; геноварианты; аллель гена ctxB; остров пандемичности VSP-II; MLVA-типирование.
Геном возбудителя холеры, значительная часть которого представлена мобильными генетическими элементами, за относительно короткий период эволюции претерпел большие изменения. В результате появились токсигенные штаммы Vibrio cholerae, различающиеся между собой по генетическим свойствам и эпидемическому потенциалу. Среди них особое внимание заслуживают штаммы V. cholerae О1-серогруппы, относящиеся к двум разным биоварам - классическому и Эль-Тор, с которыми связаны 7 известных пандемий холеры. V. cholerae классического биовара вызвал 6-ю и, видимо, первые 5 пандемий (1817-1923 гг.), холерные вибрионы Эль-Тор - текущую 7-ю пандемию (с 1961 г. по настоящее время). Смена биовара произошла между 1910 и 1961 гг., однако точные причины вытеснения классических штаммов вибрионами Эль-Тор до сих пор неясны [1, 2]. При поиске различий между геномами штаммов V. cholerae, изолированных в разные временные периоды, были выявлены участки хромосом, которые подвергались эволюционно значимым изменениям. Наиболее вариабельным оказался геном профага СТХф, несущий оперон ctxAB, кодирующий холерный токсин (СТ от cholerae toxin) - ключевой фактор вирулентности. Было обнаружено, что классические и Эль Тор штаммы содержали различные типы профага СТХф (СТХфС1аж и СТХфИ4ог), отличающиеся друг от друга аллельными вариантами гена ctxB, кодирующего В-субъединицу СТ. Все классические штаммы содержали аллель ctxB1, тогда как холерные вибрионы Эль-Тор имели аллель ctxB3
[3, 4]. Одно из биологических последствий таких различий - более низкий уровень вирулентности типичных штаммов Эль-Тор вибрионов по сравнению с классическими штаммами. Другое значимое отличие между штаммами двух биоваров - присутствие в геноме двух дополнительных участков ДНК - островов пандемичности VSP-I и VSP-II (от Vibrio seventh pandemic island), которые, видимо, определяют высокую устойчивость этого патогена к различным стрессовым воздействиям окружающей среды и являются генетической меткой возбудителя текущей пандемии [2]. Сравнительно недавно (1990-1991 гг.) стало очевидным возникновение новых генетически измененных штаммов возбудителя холеры Эль-Тор или геновари-антов, отличающихся от типичных изолятов высокой вирулентностью [5-9]. Считают, что такие геновари-анты появились в результате приобретения типичными штаммами V. cholerae Эль-Тор генома профага СТХфС1аж классических вибрионов или его гена ctxB1 через горизонтальный перенос генов.
С обнаружением первых геновариантов возбудителя холеры Эль-Тор встал вопрос о том, какие штаммы могли служить в качестве донора гена ctxB классического типа. Окончательный ответ на него пока не получен. Можно лишь предполагать, что донором этого гена, помимо V cholerae классического биовара, могли быть также штаммы V cholerae биовара Эль-Тор, изолированные до начала 7-й пандемии холеры на о. Целебес в Индонезии (1937 г.) и несущие геном профага СТХфС1аж [1]. Тем не менее сведения о генетических связях возможных доноров гена ctxB1 и генова-риантов, получивших этот ген, весьма ограничены.
Циркуляция в эндемичных по холере регионах мира типичных и генетически измененных штаммов V cholerae биовара Эль-Тор с разным уровнем вирулентности и различным эпидемическим потенциалом создает реальные предпосылки для их появления и в нашей стране. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на дифференциацию типичных штаммов и геновариантов, занесенных туристами в Россию и вызвавших эпидемические вспышки или локальные случаи холеры. До сих пор также не решен вопрос о том, какое происхождение имеют геноварианты - моно- или поликлональное. Одно из предположений состоит в том, что широкое распространение геновари-антов является результатом экспансии единственного клона, который является производным какого-то одного прототипного штамма возбудителя холеры Эль-Тор, возникшего на определенной территории. Согласно второй гипотезе, такое событие обусловлено муль-тиклональным возникновением геновариантов в нескольких эндемичных по холере регионах [10]. В этом случае следует ожидать, что генетическое разнообразие геновариантов будет весьма значительным.
Для решения этих задач среди различных методов молекулярного типирования мы выбрали метод MLVA (multilocus-variable tandem repeat analysis), который основан на сравнительном анализе количества вариабельных тандемных повторов в локусах, расположенных на I и II хромосомах холерного вибриона [11, 12]. Высокая разрешающая способность MLVA-типирования по сравнению с другими методами (SNP - single nucleotide polymorphism, и MLST - multiple loci sequence typing) была показана ранее при изучении различных штаммов многих патогенных бактерий, включая возбудителя холеры [13-16].
Цель работы - изучить возможность дифференциации типичных и генетически измененных штаммов возбудителя холеры Эль-Тор методом MLVA, оценить генетическое разнообразие геновариантов и выяснить их филогенетические связи с V. cholerae классического биовара и предпандемическими штаммами V. chol-erae биовара Эль-Тор.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использованы 59 клинических штаммов V. cholerae и 1 штамм, изолированный из воды. Среди изученных изолятов S относились к V.cholerae классического биовара, 52 - к V.cholerae биовара Эль Тор, выделенных до начала (1937 г.) и в разные периоды (1967-2012 гг.) 7-й пандемии в различных регионах России, а также в странах ближнего и дальнего зарубежья. Пандемические штаммы были представлены 20 типичными штаммами возбудителя и 30 его геноварианта-ми. Все штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофилизованном состоянии. Для культивирования бактерий использовали бульон и агар Luria-Bertani (LB).
Выделение бактериальной ДНК осуществляли в присутствии гуанидинтиоцианата с применением лицензированных коммерческих наборов для ее выделения (ДНК-сорб, «AmpliSens», Россия) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Полученные образцы, содержащие тотальную ДНК холерных вибрионов, использовали для амплификации фрагментов генома.
МАМА-ПЦР. Для дифференциации классического и Эль-Тор аллелей гена ctxB был использован МАМА-ПЦР (Mismatch Amplification Mutation Assay PCR) [17]. Определение аллеля гена основывалось на выявлении различий в его ну-клеотидной последовательности в положении 203 при использовании трех праймеров: одного общего прямого (5'-ACTATCTTCAGCATATGCACAGG-3') и двух обратных, специфичных соответственно для классического типа ctxB (5'-CCTGGTACTTCTACTTGAAACG-3') или Эль-Тор типа (5'-CCTGGTACTTCTACTTGAAACA-3') [18].
Секвенирование гена ctxB. Секвенирование геномной ДНК проводили на генетическом анализаторе модели ABI 3500xl. Полученную нуклеотидную последовательность гена ctxB анализировали с помощью программы «Mega 5,0» и сравнивали с таковой референтных штаммов, представленной в базе данных
GenBank. В нуклеотидной последовательности аллеля ctxBl в положениях 115 и 203 присутствовал цитозин (С), тогда как у аллелей ctxB3 в этих же позициях был тимин (Т) [4].
Изучение структуры острова пандемичности VSP-II. Структуру VSP-II определяли методом ПЦР с использованием 12 пар специфических праймеров, описанных ранее [19].
MLVA-типирование. В качестве вариабельных участков генома V. cholerae использованы 5 ранее описанных локусов VC0144, VC0436-7, VC01650, VCA0171, VCA0283, первые 3 из которых локализованы на первой, а два последних - на второй хромосоме [11, 14]. С помощью специфических праймеров (табл. 1) в ПЦР, условия проведения которой описаны ранее [14], получали по 5 ампликонов для каждого из 60 штаммов. Амплификацию ДНК проводили с использованием программируемого термоциклера с горячей крышкой iCycler «IQ5» (BioRad, США). Полученные ампликоны были секвенированы на генетическом анализаторе модели ABI 3500xl.
Анализ результатов. Первичный анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Data Collection v 1.0» и «Sequencing Analysis Software v 5.4». Для дальнейшего анализа применяли программное обеспечение «BioEdit 7.1.3» и «Mega 5». С целью определения числа тандемных повторов использовали программу «Tandem Repeats Finder v. 4.0» (G. Benson, 2004, http://tandem.bu.edu/trf/trf.download.html). Полученные результаты вносили в базу данных «BioNumerics 7.1» (Applied Maths, Бельгия). Для построения филогенетического дерева применяли метод «Maximum parsimony tree» с категорическим коэффициентом. Вариабельность VNTR-локусов оценивали с помощью индекса разнообразия Нея (DI от diversity index) [20].
Результаты и обсуждение
Молекулярно-генетические особенности исследуемых штаммов V. cholerae. Для выявления генетических связей недавно возникших геновариантов возбудителя холеры Эль-Тор с другими вирулентными штаммами V.cholerae, изолированными в разные временные периоды, и оценки возможности их дифференциации с помощью MLVA были взяты 3 группы изолятов, отличающихся друг от друга по структуре участков генома, связанных с вирулентностью и адаптацией к стрессовым воздействиям окружающей среды. Первая группа была представлена 8 штаммами V.cholerae классического биовара, выделенными на эндемичной по холере территории (Индия, Пакистан) в 1937-1969 гг. Результаты МАМА-ПЦр (см. «Материалы и методы») и секвенирования показали присутствие в их хромосомах генома профага CTXClass9, содержащего аллель ctxB 1. Вместе с тем эти штаммы были лишены острова пандемичности VSP-II (табл. 2). Эти результаты полностью согласуются с данными других исследователей [2].
Во вторую группу входили 2 клинических штамма V. cholerae биовара Эль-Тор (МАК757 и МАК676),
Т а б л и ц а 1
VNTR-локусы и последовательности праймеров, использованные в исследовании
Хромосома
Локус
Нуклеотидная последовательность повтора
Праймеры (5' - 3')
VC0147 (белок FtsY) AACAGA
VC0436-7 (межгенная область) GACCCTA
VC1650 (коллагеназа) GATAATCCA
VCA0171 (гипотетический белок) TGCTGT
VCA02S3 (гипотетический белок) ACCAGA
CCAAACCACTGCAACGATAGCTGCTCGACCTGAGAGAGA CGTGGTACTAAGTTCCACGCCGTTTTTACCACGCTCCGCTTC CTACCAAGCGGCGGTTAAGCTGTGGGCAACCTGCTGGTAGC GCATCATCCACAGCGTTTGGGCTGAAGCCTTTCGCGATCC CTTCATCGGCAAACAAGACATTGCGCACAATTCTCTTTGA
Примечание. VNTR-локусы и последовательности праймеров были взяты из работы [10].
16
I
II
Таблица 2
Молекулярно-генетические особенности изучаемых штаммов Vibrio cholerae классического и Эль-Тор биоваров
и их MLVA-профили
№ Штамм Место и год выделения Аллель гена ctxB Остров пандемичности VSP-II Аллельные профили VC0147, VC0436-7, VC1650, VCA0171, VCA02S3 MLVA тип
V. cholerae классического биовара
1 1488«а» Индия, Калькутта, 1937 ctxB1 - S,3,3,7,S 1
2 B1307 Пакистан, Дакка, 1964 ctxB1 - S,4,3,20,26 2
З 325 Индия, 1946 ctxB1 - S,3,3,7,20 З
4 JS9 Пакистан, 1946 ctxB1 - S,3,3,23,30 4
5 266 Индия, 1949 ctxB1 - 8,3,3,16,17 5
6 D3 Пакистан, 1958 ctxB1 - 8,4,3,21,26 6
7 569B Индия, 1948 ctxB1 - 10,4,3,16,34 7
S Dakka 35 Пакистан, Дакка, 1958 ctxB1 - 8,4,3,15,27 8
Предпандемические штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор
9 MAK676 Индонезия, о.Целебес,1937 ctxB1 - 10,6,7,14,13 9
10 MAK757 Индонезия, о. Целебес, 1937 ctxB1 - 10,6,7,14,16 10
Типичные пандемические штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор
11 9/67 Индия, 1967 ctxB3 VSP-II 8,6,7,15,24 11
12 1/67 Индия, 1967 ctxB3 VSP-II 8,6,7,15,24
13 М736 РФ, Пермь, 1970 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,26 12
14 М738 РФ, Пермь, 1970 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,26
15 М818 РФ, Саратов, 1970 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,25 13
16 MSS7 РФ, Астрахань, 1970 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,25
17 M963 РФ, Астрахань, 1972 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,25
1S MSSS РФ, Астрахань, 1970 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,24 14
19 М1011 РФ, Башкирия, Уфа, 1972 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,24
20 М1013 РФ, Башкирия, Уфа, 1972 ctxB3 VSP-II 8,6,7,18,24
21 P293S Украина, Керчь, 1970 ctxB3 VSP-II 9,6,7,14,21 15
22 P3109 Украина, Одесса, 1970 ctxB3 VSP-II 9,6,7,14,27 16
2З M5S2 РФ, Калмыкия, Элиста, 1974 ctxB3 VSP-II 8,6,7,19,25 17
24 M56S РФ, Мордовия, Саранск, 1974 ctxB3 VSP-II 8,6,7,19,23 18
25 M569 РФ, Мордовия, Саранск, 1974 ctxB3 VSP-II 8,6,7,19,23
26 M5S9 РФ, Пермь, 1974 ctxB3 VSP-II 8,6,7,19,23
27 С-402 РФ, Ставрополь, 1990 ctxB3 VSP-II 9,6,8,22,20 19
2S С-447 РФ, Ставрополь, 1990 ctxB3 VSP-II 9,6,8,22,20
29 M1261 РФ, Пермь, 1990 ctxB3 VSP-II 9,6,8,23,20 20
30 M1259 РФ, Пермь, 1990 ctxB3 VSP-II 9,6,8,23,20
Генетически измененные пандемические штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор
31 P153S4 Украина, г. Вилкино, 1991 ctxB1 VSP-II 8,7,8,16,6 21
З2 P15653 Украина, г. Николаев, 1991 ctxB1 VSP-II 8,7,8,15,14 22
ЗЗ M1297 РФ, Дагестан, Махачкала, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,14,20 2З
34 M1275 РФ, Дагестан, Махачкала, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,14,20
35 М1264 РФ, Краснодар, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,20 24
36 М1266 РФ, Пермь, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,20
37 M1299 РФ, Краснодар, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,24 25
3S M1272 РФ, Краснодар, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,21 26
39 M1271 РФ, Татарстан, Казань, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,21
40 M1270 РФ, Татарстан, Казань, 1993 ctxB1 VSP-II 8,7,8,11,21
41 М1293 РФ, Дагестан, с. Сулина, 1994 ctxB1 VSP-II 8,7,8,15,20 27
42 M1294 РФ, Дагестан, с.АйдиКутан,1994 ctxB1 VSP-II 8,7,8,15,20
43 M1269 РФ, Магнитогорск, 1994 ctxB1 VSP-II 8,7,8,15,20
44 M126S РФ, Магнитогорск, 1994 ctxB1 VSP-II 8,7,8,15,20
45 Р17647 РФ, Ачинск, 1997 ctxB1 VSP-II Дvc0495-0498 9,8,6,13,24 28
46 Р17644 РФ, Ачинск, 1997 ctxB1 VSP-II Дvc0495-0498 9,8,6,13,24
47 М1326 РФ, Дагестан, с. Рубас, 1998 ctxB1 VSP-II 9,7,8,15,22 29
4S M1327 РФ, Дагестан, с. Хорези, 1998 ctxB1 VSP-II 9,7,8,15,22
49 M132S РФ, Дагестан, с. Хорези, 1998 ctxB1 VSP-II 9,7,8,15,22
50 М1344 РФ, Татарстан, Казань, 2001 ctxB1 VSP-II 11,7,6,9,13 30
51 М1345 РФ, Татарстан, Казань, 2001 ctxB1 VSP-II 11,7,6,6,13
Продолжение табл. см. на стр. 18
52 М1349 РФ, Татарстан, Казань, 2001 ^1 VSP-II 11,7,6,6,13
53 М1429 РФ, Башкирия, Уфа, 2004 ^1 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,20,17 31
54 М1430 РФ, Тверь, 2005 ^1 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,20,18 32
55 Р18899 РФ, Мурманск, 2006 ^1 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,10,19 33
56 Л-3225 РФ, Москва, 2010 ^7 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,14,19 34
57 Л-3226 РФ, Москва, 2010 ^7 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,15,19 35
58 Л-4150 РФ, Москва, 2010 ^7 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,13,20 36
59 301 РФ, Таганрог, 2011 ^1 VSP-II Дvc0495-0512 8,3,6,19,18 37
60 М1509 РФ, Москва, 2012 ^1 VSP-II Дvc0495-0512 9,3,6,14,22 38
Примечание. * - остров пандемичности VSP-II - интактный; VSP-II Дvc0495-0498 - несущий короткую делецию из 4-х генов; VSP-II Дvc0495-0512 - имеет протяженную делецию из 21 гена.
изолированных в 1937 г. на о. Целебес (Индонезия) до начала текущей пандемии холеры. При анализе молекулярно-генетических свойств этих предпандеми-ческих штаммов обнаружено присутствие в их геноме профага СТХфс1аж с аллелем ctxBl, но отсутствие VSP-II, что подтверждено другими работами [1, 2].
Третья группа состояла из 49 клинических штаммов V. cholerae биовара Эль-Тор, выделенных в разные периоды 7-й пандемии холеры, и 1 штамма, изолированного из морской воды. Среди них 20 клинических штаммов изолированы в начальный период пандемии (1967-1990 гг.) на территории Индии и России и несли в составе профага СТХЕ14огф аллель ctxB3, а также интактный VSP-II [19]. Другие 30 штаммов, включая штамм из морской воды, были занесены на территорию России и Украины из различных неблагополучных по холере стран в течение двух последних десятилетий (1991-2012 гг.) и относились к описанным выше геновариантам, содержащим в геноме участок ДНК холерных вибрионов классического биовара. Совокупность полученных нами данных говорит о том, что представленные штаммы геновариантов различались между собой по структуре генома [19, 21]. Характерным свойством 90% изученных геновариантов было наличие в их геноме аллеля ctxB 1. Вместе с тем были обнаружены штаммы, отличающиеся от других геновариантов присутствием в профаге другого аллеля гена ctxB, а именно ctxB7, в котором имелась дополнительная мутация - несинонимичная замена С на А в позиции 58. Более того, геноварианты, выделенные в 2 последних десятилетия (1991-2001 гг. и 2002-2012 гг.), различались между собой структурой острова пандемичности VSP-II. Если геноварианты, изолированные в 1991-2001 гг., несли интактный VSP-II или VSP-II с короткой делецией, захватывающей 4 гена (VSP-IIДvc0495-vc0498), то все геноварианты, занесенные в Россию в последнее десятилетие (20022012 гг.), имели VSP-II с протяженной делецией или VSP-IIДvc0495-vc0512 (см. табл. 2) [19, 21]. Причина изменчивости VSP-II геновариантов пока неясна. Но важно, что указанная перестройка в этом геномном острове может, видимо, служить в качестве генетической метки штаммов с высоким пандемическим потенциалом, поскольку именно штаммы, содержащие VSP-II с протяженной делецией, вытеснили геноварианты с прототипным VSP-II во многих эндемичных по холере регионах.
Таким образом, для исследуемых штаммов возбудителя холеры, изолированных от больных и из внешней среды во время различных эпидемических осложнений, характерно значительное генетическое разнообразие,
которое проявлялось в наличии одиночных нуклеотид-ных замен, делеций, а также приобретенной генетической информации, влияющей на проявление вирулентных свойств и адаптацию к стрессовым воздействиям.
Молекулярное типирование исследуемых штаммов V. cholerae методом MLVA.
Для проведения MLVA-типирования взятых штаммов в качестве вариабельных участков генома V chol-erae использовали 5 локусов, обозначенных VC0147, VC0436-7, VC1650, VCA0171, VCA0283 [11, 14]. Ло-кусы VC0147, VC0436-7, VC1650 находятся на I хромосоме в районе 136806-137459, 466811-467459 и 1778210-1778872 н.п. соответственно, тогда как локу-сы vca0171 и vca0283 расположены на II хромосоме в районе 187459-188196 и 303639-304322 н.п. соответственно. Нуклеотидные последовательности локусов и использованные специфические праймеры к ним указаны в табл. 1. В результате исследования ДНК 60 штаммов было установлено, что для локусов I хромосомы характерно присутствие 3-5 аллелей, тогда как локусы II хромосомы представлены 14-15 аллелями. На разный уровень полиморфизма сравниваемых ло-кусов указывает также индекс разнообразия Нея (Р^ [20]. Для локусов I хромосомы DI составил 0,66-0,68, а для локусов II хромосомы - 0,91-0,92. Это означает более высокий уровень стабильности первых трех хромосомных локусов по сравнению с двумя другими, локализованными на II хромосоме, что полностью согласуется со многими известными данными [13, 14, 22].
Анализ полученных результатов показал, что 60 изученных штаммов относились к 38 различным MLVA-типам. При этом 8 штаммов V. cholerae классического биовара принадлежали к 8, а 2 предпандемических изолята - к 2 MLVA-типам. Такое значительное генетическое разнообразие штаммов, изолированных примерно 40-70 лет назад, было связано лишь с большой вариабельностью исследуемых локусов II хромосомы (см. табл. 2). Что касается штаммов V. cholerae биовара Эль-Тор, то среди 20 типичных штаммов было выявлено 10 MLVA-типов, а среди 30 геновариантов - 19. Эти данные свидетельствуют о заметной вариабельности генома взятых штаммов, которая возможно обусловлена временной (1967-2012 гг.) и географическими разобщенностью, а также связана с эволюционными процессами в природных популяциях возбудителя.
Построение филогенетического древа на основе MLVA-типирования по 5 указанным выше локусам и его анализ позволили выявить 7 кластеров (!^П), каждый из которых содержал близкородственные штаммы, имеющие идентичный или близкий генотип (см. рисунок). Кластер I был образован классическими
Филогенетическое древо, построенное методом «maximum parsimony tree» с использованием программы Bionumerics, v.7.1, на основе MLVA-типирования по 5 хромосомным VNTR-локусам штаммов Vibrio cholerae классического и Эль-Тор биоваров.
Овалами выделены клональные кластеры (I-VII), в которые входят штаммы V. cholerae классического биовара (I), и V.cholerae биовара Эль-Тор: предпандемические (II), пандемические типичные (III, IV, V) и генетически измененные (VI и VII). В кружках указаны изученные штаммы.
штаммами, аллельные профили которых четко отличались от таковых других штаммов. Все эти штаммы несли классический профаг СТХфс1ж8 с аллелем ctxBl и не имели островов пандемичности VSP-I и VSP-II. В кластер II входили предпандемические изоляты V cholerae биовара Эль-Тор с очень сходными аллель-ными профилями 10,6,7,14,13/10,6,7,14,16, которые так же, как и классические штаммы, содержали геном профага СТХфс1аж и были лишены VSP-I и VSP-II. В 3 отдельных кластера (III, IV и V) попадали типичные штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор, несущие профаг СТХфЕ14ог с аллелем ctxB3 и прототипным VSP-II. Распределение типичных штаммов по разным клональ-ным кластерам зависело от времени и места выделения культур. Кластер III был представлен 14 изолятами, относящимися к 6 разным MLVA-типам (11,12,13,14,17 и 18). Из них 12 штаммов были связаны с первым заносом холеры Эль-Тор в Поволжье и Центральную Россию из стран Юго-Восточной Азии в 1970-1974 гг. [23]. Сопоставление их аллельных профилей показывает, что они различались между собой лишь по числу повторов в двух наиболее вариабельных локусах II хромосомы (VCA0171 и VCA0283), тогда как локусы VC0147, VC0436-7 и VC1650 из I хромосомы были идентичны. Число аллелей в них во всех сравниваемых штаммах составило 8, 6 и 7 соответственно. Это указывало на их клональное происхождение. Что касается двух других минорных кластеров IV и V, то они включали в себя по 2 и 4 штамма, занесенных либо в тот же период пандемии (1970 г.) в Украину, либо через 20 лет после этих событий в Ставрополь и Пермь (1990 г.). Эти изо-ляты отличались как друг от друга, так и от штаммов кластера III по структуре всех 5 локусов (см. табл. 2). Это может означать, что эпидемические осложнения в Украине (1970 г.), а также Перми и Ставрополе (1990 г.) были вызваны заносом двух разных клонов возбудителя, отличающихся от клонов, обусловивших эпидемическую вспышку холеры в России в 1970-1974 гг. Тем не менее в целом аллельный полиморфизм исследуемых локусов у всех типичных штаммов из 3 кластеров невелик, что указывает на их близкое родство между собой (см. табл. 2, см. рисунок).
Особый интерес представляли штаммы геновариантов V. cholerae E1-Tor, вызвавшие эпидемические вспышки или отдельные случаи холеры в России в современный период 7-й пандемии - 1993-2012 гг. Как указывалось выше, новые варианты возбудителя отличались от типичных штаммов биовара Эль Тор присутствием в их геноме аллеля ctxB 1, характерного для V. cholerae классического биовара. Обнаружено, что на филогенетическом древе исследуемые геновариан-ты вошли в состав двух отдельных кластеров - VI и VII (см. рисунок). Их аллельные профили существенно отличались от таковых типичных штаммов, образующих кластеры III, IV и V (см. табл. 2). Из этого следует, что MLVA-типирование по 5 вариабельным локусам позволяет дифференцировать пандемические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные. Другая важная информация, полученная из анализа представленных данных, состоит в том, что с помощью этого метода возможна дифференциация различных групп геновариантов, различающихся между собой по генетическим свойствам и завезенных в Россию в различные временные
периоды. Об этом свидетельствует тот факт, что исследуемые геноварианты входили в состав двух четко обособленных друг от друга кластеров. К одному из них (VI) относились 20 клинических штаммов, имеющих 10 различных аллельных профилей и изолированных в 1991-2001 гг. в период эпидемических вспышек (Дагестан, 1993, 1994, 1998 г.; Татарстан, 1993, 2001 г.; Украина, 1991 г.) и при единичных заносах холеры. При исключении из анализа двух гипервариабельных локусов, расположенных на хромосоме II, аллельные профили геновариантов этого кластера были следующие: 8,7,8,Х,Х (70% изолятов), 9,7,8,Х,Х (15% изолятов) и 11,7,6,Х,Х (15%). Представленные данные свидетельствуют о генетической неоднородности штаммов этого кластера, что возможно связано с разными источниками инфекции. В другой (VII) кластер входили 10 геновариантов, выделенных на территории России в 1997 г. (Ачинск) и 2004-2012 гг. (г. Уфа, Тверь, Мурманск, Москва, Таганрог). Характерной особенностью этих изолятов, отличающих их от штаммов VI кластера, было присутствие в их острове пандемичности VSP-II короткой или протяженной делеции. Их аллельные профили (9,8,6,Х,Х и 9,3,6,Х,Х) заметно отличались от таковых геновариантов из VI кластера (см. табл. 2, рисунок). Это может означать, что сравниваемые группы геновариантов, занесенные в Россию из неблагополучных по холере стран, не ведут своего происхождения от одного клона. Скорее всего, эпидемии холеры, зарегистрированные в современный период в различных регионах мира, вызваны геновариантами, имеющими поликло-нальное происхождение, что согласуется с таким же предположением других исследователей [10]. Тем не менее все эти гипотезы требуют проведения дополнительных исследований.
Что касается генетических связей V cholerae классического биовара с пандемическими штаммами V. cholerae биовара Эль-Тор, то, согласно нашим данным, наиболее близки к ним были геноварианты, изолированные в основном в последнее десятилетие текущей пандемии (VII кластер). Этот не совсем ожидаемый факт возможно объясняется большим генетическим сходством именно этой группы геновариантов с классическими вибрионами, поскольку первые претерпели дополнительные изменения генома и утратили значительную часть генов VSP-II, который полностью отсутствует у возбудителя азиатской холеры
Предпандемические штаммы V cholerae биовара Эль-Тор на филогенетическом древе образуют отдельную ветвь, расположенную между геновариантами из 2 разных кластеров. Эти данные говорят о том, что предпандемические штаммы с уникальной структурой генома имеют, видимо, независимое происхождение.
Сравнение аллельных профилей изученных нами геновариантов с профилями штаммов, циркулирующих в разных эндемичных по холере странах, полученных разными группами исследователей, позволило предположить, что штаммы, вызвавшие эпидемические осложнения по холере в Дагестане (1993,1994 гг.), в Краснодаре (1993 г.), Перми (1993 г.), Татарстане (1993 г.), Магнитогорске (1994 г.), могли быть занесены из Бангладеш. Основанием для этого служит тот факт, что аллельные профили геновариантов возбудителя холеры Эль-Тор (8,7,8,Х,Х), изолированные в указанных
регионах России, не отличались от таковых штаммов MJ1236, ME116926, e1271, циркулировавших среди больных и во внешней среде в этой стране в 1991, 1994 г. [24]. Что касается последнего десятилетия, то практически все заносы клинических штаммов в Россию связаны с Бангладеш или Индией, поскольку выявленные нами аллельные профили геновариантов (9,3,6,Х,Х) были такие же, как у штаммов, изолированных в этих эндемичных по холере регионах в 2004 г. (Бангладеш) и 2006-2007 гг. (Индия) [14]. Эти данные в целом совпадают с результатами эпидемиологических расследований. Исходя из данных MLVA-типирования остается неизвестным происхождение лишь штамма 301, также входящего в состав этого кластера. Этот штамм был выделен из морской воды Азовского моря вблизи Таганрога в 2011 г. и, согласно нашим результатам, по своим молекулярно-генетическим свойствам входит в группу вирулентных геновариантов с высоким эпидемическим потенциалом [5]. Вместе с тем на основании результатов сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома 54 штаммов V. cholerae недавно было показано, что он связан с изолятами, вызвавшими холеру в ЮАР и Пакистане [25].
Таким образом, MLVA-типирование 52 штаммов V.cholerae биовара Эль-Тор, изолированных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры, а также 8 штаммов V.cholerae классического биовара - возбудителя предыдущих пандемий азиатской холеры, показало, что исследуемые штаммы, различающиеся по молекулярно-генетическим свойствам и относящиеся к 38 MLVA-типам, входят в состав 7 клональных кластеров. Из них кластеры I и II образованы штаммами V.cholerae классического биовара и предпандемиче-скими штаммами, соответственно, а кластеры III-VII - штаммами V.cholerae биовара Эль Тор, выделенными во время 7-й пандемии. Установлено, что MLVA-типирование позволяет четко дифференцировать штаммы V.cholerae биовара Эль Тор, изолированные в разные периоды текущей пандемии, на типичные и генетически измененные. Обнаружена также возможность дифференциации геновариантов, выделенных в разные временные периоды и отличающихся друг от друга по структуре острова пандемичности VSP-II. Поскольку существует прямая связь между структурой VSP-II и эпидемическим потенциалом штаммов, то выявленная возможность дифференциации изолятов с интактным и делетированным VSP-II методом MLVA заслуживает большого внимания. Следует также отметить, что генетическое разнообразие геновариантов является отражением продолжающихся эволюционных изменений генома новых вариантов возбудителя холеры в результате накопления мутаций и выражается в их принадлежности к разным MLVA-типам. На основе полученных сведений высказано предположение о по-ликлональном происхождении разных геновариантов, что согласуется с результатами ряда других исследователей [8]. Кроме того MLVA-типирование показало реальную возможность выявления возможных источников инфекции, что является одной из основных задач молекулярно-эпидемиологического мониторинга за холерой.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант 12-04-00285а.
Сведения об авторах:
Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»:
Смирнова Нина Ивановна - д-р биол. наук, проф., зав. отделом микробиологии, E-mail: [email protected]
Кульшань Татьяна Алексеевна - канд. мед. наук, научный сотр. лаборатории патогенных вибрионов, E-mail: [email protected]
Краснов Ярослав Михайлович - канд. хим. наук, зав. лабораторией геномного и протеомного анализа, E-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Chun J., Grim C.J., Hasan N.A., Lee J.H., Choi S.Y., Haley B.J. et al. Comparative genomics reveals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (36): 15442-7.
2. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser C.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1556-61.
3. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae. Curr Opin. Microbiol. 2003; 6 (1): 35-42.
4. Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B. Uhlén M., Popovic T., Wachsmuth I.K. et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (1): 22-5.
5. Frerichs R.R., Keim P.S., Barrais R., Piarroux R. Nepalese origin of cholera epidemic in Haiti. J. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18 (6): 158-63.
6. Khuntia H.K., Pal B.B., Samal S.K., Kar S.K. Rapid spread of Vibrio cholerae O1 El Tor variant in Odisha, Eastern India, in 2008 and 2009. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (6): 1909-12.
7. Okada K., Roobthaisong A., Swaddiwudhipong W., Hamada S., Chantaroj S. Vibrio cholerae 01 isolate with novel genetic background, Thailand-Myanmar. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19 (6): 1015-6.
8. RashedS.M., Azman A.S., Alam M., Li S., SackD.A., Morris J.G.Jr. et al. Genetic Variation of Vibrio cholerae during Outbreaks, Bangladesh, 2010-2011. Emerg. Infect. Dis. 2014; 20 (1): 54-60.
9. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (11): 3739-49.
10. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Yamamoto S., Nair G.B., Matsushita S. Emergence and genetic diversity of El Tor Vibrio cholerae O1 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan. J. Med. Microbiol. 2010; 59: 708-12.
11. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Сучков И.Ю. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae. Биотехнология. 2001; 6: 85-8.
12. Danin-Poleg Y., Cohen L.A., Gancz H., Broza Y.Y., Goldshmidt H., Malul E. et al. Vibrio cholerae strain typing and phylogeny study based on simple sequence repeats. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(3): 736-46.
13. Мишанькин Б.Н., Романова Ю.М., Ломов Ю.М. Vibrio cholerae O139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиол. 2000; 3: 3-7.
14. Choi S. Y., Lee J. H., Jeon Y. S., Lee H.R., Kim E.J., Ansaruzzaman M. et al. Multilocus variable-number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring classical toxin B. J. Med. Microbiol. 2010; 59 (3): 763-9.
15. Hasan N.A., Choi S.Y., Eppinger M., Clark P.W., Chen A., Alam M. et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (18): 2011-7.
16. Okada K., Roobthaisong A., Nakagawa I., Hamada S., Chantaroj S. Genotypic and PFGE/MLVA analyses of Vibrio cholerae O1: geographical spread and temporal changes during the 2007-2010 cholera outbreaks in Thailand. PLoS One. 2012; 8 (1): 1-10.
17. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52 (6): 314-7.
18. Cha R.S., Zarbl H., Keohavong P., ThillyW.G. Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the c-H-ras gene. PCR Methods Appl. 1992; 2: 14-20.
19. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013; 49: 1-12.
20. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K., Klevytska A.M., Jackson P. J., Friedlander A.M. et al. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersiniapestis. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(4): 1516-9.
21. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период. Молекулярна генетика, микробиология, вирусология. 2011; 4: 11-8.
22. Lam C., Octavia S., Reeves R.P., Lan R. Multi-locus variable number tandem repeat analysis of 7th pandemic Vibrio cholerae. BMC Microbiol. 2012; 12 (82). Available at: http://www.biomedcentral. com/1471-2180/12/82.
23. Кологоров А.И., Кедрова О.В., Пахомов Д.А., Пискунова Н.В., Ковтунов А.И., Васенин А.С. и др. Закономерности распространения холеры в бассейне Волги в 1970-1973 гг. Проблемы Особо опасных инфекций. 2010; 104: 22-8.
24. Choi S.Y., Lee J.H., Kim E.J., Lee H.R., Jeon Y.S., von Seidlein L. et al. Classical RS1 and environmental RS1 elements in Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring a tandem repeat of CTX prophage: revisiting Mozambique in 2005. J. Med. Microbiol. 2010; 59: 302-8.
25. Кулешов К.В., Маркелов М.Л., Дедков В.Г., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Керманов А.В. и др. Филогенетический анализ геномов штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территории Ростовской области. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013; 6: 13-20.
Поступила 06.03.14
REFERENCES
1. Chun J., Grim C.J., Hasan N.A., Lee J.H., Choi S.Y., Haley B.J. et al. Comparative genomics reveals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (36): 15442-7.
2. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser C.M., Heidelberg J.F., Me-kalanos J.J. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1556-61.
3. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae. Curr Opin. Microbiol. 2003; 6 (1): 35-42.
4. Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B. Uhlen M., Popovic T., Wa-chsmuth I.K. et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (1): 22-5.
5. Frerichs R.R., Keim P.S., Barrais R., Piarroux R. Nepalese origin of cholera epidemic in Haiti. J. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18 (6): 158-63.
6. Khuntia H.K., Pal B.B., Samal S.K., Kar S.K. Rapid spread of Vibrio cholerae O1 El Tor variant in Odisha, Eastern India, in 2008 and 2009. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (6): 1909-12.
7. Okada K., Roobthaisong A., Swaddiwudhipong W., Hamada S., Chan-taroj S. Vibrio cholerae O1 isolate with novel genetic background, Thailand-Myanmar. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19 (6): 1015-6.
8. Rashed S.M., Azman A.S., Alam M., Li S, Sack D.A., Morris J.G.Jr. et al. Genetic Variation of Vibrio cholerae during Outbreaks, Bangladesh, 2010-2011. Emerg. Infect. Dis. 2014; 20 (1): 54-60.
9. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G. Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (11): 3739-49.
10. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Yamamoto S., Nair G.B., Matsushita S. Emergence and genetic diversity of El Tor Vibrio cholerae O1 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan. J. Med Microbiol. 2010; 59: 708-12.
11. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Mishan'kin M.B., Suchkov I.Yu. Variable tandem repeats identified by means of computer analysis of Vibrio cholerae genome. Biotekhnologiya. 2001; 6: 85-8. (in Russian)
12. Danin-Poleg Y., Cohen L.A., Gancz H., Broza Y.Y., Goldshmidt H., Malul E. et al. Vibrio cholerae strain typing and phylogeny study based on simple sequence repeats. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(3): 736-46.
13. Mishan'kin B.N., Romanova Yu.M., Lomov Yu.M. Vibrio cholerae O139 isolated from humans and water samples from surface water bodies: comparative genotyping. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii i immunobiologii. 2000; 3: 3-7. (in Russian)
14. Choi S. Y., Lee J. H., Jeon Y. S., Lee H.R., Kim E.J., Ansaruzzaman M. et al. Multilocus variable-number tandem repeat analysis of
Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring classical toxin B. J. Med Microbiol. 2010; 59 (3): 763-9.
15. Hasan N.A., Choi S.Y., Eppinger M., Clark P.W., Chen A., Alam M. et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (18): 2011-7.
16. Okada K., Roobthaisong A., Nakagawa I., Hamada S., Chantaroj S. Genotypic and PFGE/MLVA analyses of Vibrio cholerae O1: geographical spread and temporal changes during the 2007-2010 cholera outbreaks in Thailand. PLoS One. 2012; 8 (1): 1-10.
17. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52 (6): 314-7.
18. Cha R.S., ZarblH., Keohavong P., ThillyW.G. Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the c-H-ras gene. PCR Methods Appl. 1992; 2: 14-20.
19. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Agafonov D.A., Shashkova A.V., Cheldyshova N.B., Cherkasov A.V. Comparative molecular-genetic analysis of mobile elements in natural strains of cholera agent. Genetika. 2013; 49: 1-12. (in Russian)
20. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K., Klevytska A.M., Jackson P.J., Friedlander A.M. et al. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(4): 1516-9.
21. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae El Tor isolated in the territory of Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2011; 4: 11-8. (in Russian)
22. Lam C., Octavia S., Reeves R.P., Lan R. Multi-locus variable number tandem repeat analysis of 7th pandemic Vibrio cholerae. BMC Microbiol. 2012; 12 (82). Available at: http://www.biomedcentral. com/1471-2180/12/82.
23. Kologorov A.I., Kedrova O.V., Pakhomov D.A., Piskunova N.V., Kovtunov A.I., Vasenin A.S. et al. Regularities of cholera dissemination in the Volga basin in 1970-1973. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2010; 104: 22-8. (in Russian)
24. Choi S.Y., Lee J.H., Kim E.J., Lee H.R., Jeon Y.S., von Seidlein L. et al. Classical RS1 and environmental RS1 elements in Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring a tandem repeat of CTX prophage: revisiting Mozambique in 2005. J. Med Microbiol. 2010; 59: 302-8.
25. Kuleshov K.V., Markelov M.L., Dedkov V.G., Vodop'yanov S.O., Vodop'yanov A.S., Kermanov A.V. et al. Phylogenetic analysis of the genomes of Vibrio cholerae strains isolated in the territory of the Rostov region. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii i immunobiologii. 2013; 6: 13-20. (in Russian)
Received 06.03.14
MLVA-TYPING OF CLINICAL VIBRIO CHOLERAE STRAINS ISOLATED DURING DIFFERENT PERIODS OF THE CURRENT CHOLERA PANDEMIC
N. I. Smirnova, T. A. Kul'shan', and Ya. M. Krasnov
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Saratov, Russia
MLVA-typing of 5 variable loci of the 52 strains Vibrio cholerae of the biovar L-Tor isolated before and during 7 different periods of the current cholera pandemic was carried out. 8 strains V cholerae of classical biovar (antigen of previous cholera Asia pandemic) were also typed. The strains differing by molecular-genetic properties and attributed to 38 MLVA-types were found to be included into 7 clone clusters. Clusters I and II were formed by the strains V cholerae of classical biovar and pandemic strains, clusters III-VII were formed by the strains V cholerae of the biovar L-Tor isolated at different periods of present pandemic. The MLVA-typing was shown to provide distinct differentiation between strains V. cholerae of the biovar L-Tor as typical and genetically modified. The genetically modified strains differ from typical strains by higher virulence and the gene ctxB of classical cholerae vibrion. The possibility of differentiation between gene variants isolated at different periods and having different structures of pandemic island VSP-II was demonstrated. Because VSP-II structure directly correlates with epidemic potential of the strains, the isolate differentiation with intact and deleted VSP-II was implemented in the MLVA-method, which deserves further research. Based on the results obtained in this work, the hypothesis of polyclonal origin of different genovariants was put forward. Key words: Vibrio cholerae, genovariants, gene allele ctxB, pandemic island VSP-II, MLVA- typing
