CC BY
221
УДК 616.36+616.411]-001-089-005.1-08
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ АППЛИКАЦИОННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ТРАВМАХ И ОПЕРАЦИЯХ НА ПЕЧЕНИ И
СЕЛЕЗЕНКЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
© Майстренко А.Н., Бежин А.И., Липатов В.А., Нетяга А.А., Ишунина Т.А., Чижиков Г.М.
Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]
В статье представлены результаты изучения гемостатической активности новых аппликационных гемо-статических средств (губка гемостатическая коллагеновая, "Биатравм", "Ферробиатравм", "Ресорб-2", "Ферроресорб-2", эндопротез сетчатый полипропиленовый - Россия, "Серджисел" и "Серджисел Нью-Нит" - США) и морфологических изменений в брюшной полости после имплантации средств на раневые поверхности печени и селезенки. В экспериментах in vitro изучение гемостатических свойств препаратов проводили с использованием нативной крови, и in vivo эксперименты выполнены на собаках. Оценка данных свойств осуществлялась с помощью электрокоагулографа. Гемостатическая губка, атравматические раневые покрытия: "Биатравм", "Ресорб-2", "Ферроресорб-2" и гемостатическое рассасывающееся средство -"Серджисел Нью-Нит" обладают выраженной гемостатической активностью.
Реакция тканей на имплантацию гемостатических средств изучалась макроскопически и гистологически, препараты печени и селезенки изучались посредством световой микроскопии. Оптимальные соотношения гемостатической активности и реакции тканей на имплантацию нами выявлены при использовании средства - "Биатравм".
Ключевые слова: гемостатическая активность, аппликационные гемостатические средства, морфологические изменения.
A COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE HEMOSTATIC ACTIVITY OF NEW APPLICATION DRUGS IN EXPERIMENTAL TRAUMAS AND OPERATIONS ON THE LIVER AND SPLEEN Maystrenko A.N., Bezhin A.I., Lipatov V.A., Netyaga A.A., Ishunina T.A., Chizhikov G.M.
Operative Surgery & Topographic Anatomy Department, Histology, Cytology & Embryology Department
of the Kursk State Medical University, Kursk
In this article we present the results of investigations of hemostatic activity of new application hemostatic drugs (hemostatic sponge, Biatravm, Ferrobiatravm, Resorb-2, Ferroresorb-2, polypropylene mesh - Russia, Surgicel, Surgicel nu-knit - USA) and those of morphologic changes in abdominal cavity after implanting the drugs on injured surface of liver and spleen. They were studied in experiments in vitro on biological tissue of the human body (native blood) and in vivo - on dogs. Hemostatic effect of drugs was analyzed according to the data of coagulo-gram. Hemostatic sponge, Biatravm, Resorb-2, Ferroresorb-2, and Surgicel nu-knit had the maximum hemostatic effect.
The tissue reaction on implantation of drugs was studied macroscopically and on histological studies of hepatic and splenic tissues by light microscopy. Optimal correlations of hemostatic effect and tissue reaction were revealed in using Biatravm.
Keywords: hemostatic activity, application hemostatic drugs, morphologic changes.
Одной из проблем хирургии паренхиматозных органов брюшной полости является гемостаз, от которого во многом зависит благоприятное течение послеоперационного периода [1].
Существуют многочисленные методы остановки кровотечения при операциях на печени и селезенке, тем не менее эта пробле-
ма продолжает обсуждаться в литературе и признается далеко не решенной [3, 5, 6, 7].
Наиболее часто в клинической практике используются гемостатические швы [2]. К числу их недостатков можно отнести травма-тичность, при завязывании лигатур нити прорезают ткань, что является причиной рецидивного кровотечения. В позднем послеопе-
рационном периоде некроз паренхимы ди-стальнее линии прошивания приводит к несостоятельности швов, что является причиной возобновления кровотечения и образования желчных свищей [8]. Тампонада ран, окутывание печени и селезенки сеткой или пленкой ведет к развитию массивного спаечного процесса [4].
Таким образом, разработка малотравматичных методов остановки кровотечения, экспериментальная апробация и внедрение в клиническую практику новых эффективных биологически инертных средств с целью остановки паренхиматозного кровотечения при операциях и травмах, а также уменьшение выраженности спаечного процесса брюшной полости (СПБП) в месте их имплантации является важной задачей абдоминальной хирургии.
В связи с этим целью нашего исследования является поиск и обоснование в эксперименте in vitro и на животных новых эффективных аппликационных средств для гемостаза при травмах и операциях на печени и селезенке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальное исследование in vitro выполнено c кровью 18 доноров (18-28 лет). In vivo эксперименты выполнены на 66 беспородных разнополых собаках. В качестве материалов для экспериментальных исследований были использованы новые гемостатические аппликационные средства отечественных производителей и препараты для остановки капиллярно-паренхиматозных кровотечений зарубежных производителей: губка гемостатическая коллагеновая (ОАО Луж-ский завод "БЕЛКОЗИН", Ленинградская область, г. Луга), атравматическое раневое покрытие "Биатравм", атравматическое раневое покрытие "Ферробиатравм", атравматическое раневое покрытие "Ресорб-2", атравматическое раневое покрытие "Ферроресорб-2", эндопротез сетчатый полипропиленовый (ООО "Линтекс", г. Санкт-Петербург), гемостатиче-ские рассасывающееся средства "Серджисел" и "Серджисел Нью-Нит" (ООО "Джонсон и Джонсон", США). Для определения информативности разработанного метода нами был
протестирован материал с заведомо известными тромборезистентными свойствами -поливинилденфторидная мононить с карби-новым покрытием - ПВДФ-К, а для оценки влияния клея на процесс тромбообразования был проведен эксперимент с медицинским клеем БФ-6 (ЗАО "Вертекс", г. Санкт-Петербург).
В экспериментах in vitro изучение гемо-статических свойств препаратов проводили с использованием нативной крови 18 здоровых доноров-добровольцев. Оценка данных свойств осуществлялась с помощью электро-коагулографа (Н-334) с использованием разработанного нами способа.
Животные в экспериментах in vivo были разделены на 8 групп (по 6 в каждой): контрольной группой при аппликации гемоста-тических средств была губка гемостатическая коллагеновая.
В экспериментах in vitro с кровью каждого донора проводили несколько опытов. В первом опыте кювета с донорской кровью была без исследуемого материала и использовалась как контрольная в соответствии с инструкцией к электрокоагулографу проводилась регистрация времени конца свертывания крови (Т2). Во втором и последующих опытах для оценки гемостатических свойств предварительно на дно кюветы медицинским клеем фиксировались изучаемые нами в эксперименте аппликационные гемостатические средства объемом 2 мм3. При проведении сравнительных исследований все хирургические материалы имели одинаковый объем. После постановки контрольного опыта поочередно производилась регистрация времени конца свертывания нативной крови донора (Т2) в кюветах с изучаемыми материалами.
Для контроля исследований в одном из опытов мы использовали материал с заведомо известными тромборезистентными свойствами - поливинилденфторидную мононить с карбиновым покрытием - ПВДФ-К. Проводилась регистрация времени конца свертывания нативной крови донора (Т2). Так как невозможно исключить контакт медицинского клея, фиксирующего изучаемый материал ко дну кюветы, с нативной кровью, мы провели серию по изучению влияния медицинского клея на гемостаз, поместив на дно кюветы каплю клея.
Оценку гемостатических свойств материалов проводили по предложенным нами коагуляционным индексам (КИ): начала свертывания (КИ Ti) - отношение времени начала свертывания крови в опытном исследовании ко времени начала свертывания крови в контрольном опыте, и конца свертывания (КИ Т2), который представляет отношение времени конца свертывания крови в опытном исследовании ко времени конца свертывания крови в контрольном опыте, выраженным в процентах (патент № 2352940), которые вычислялись по нижеприведенным формулам: Т1(м) х 100
КИ Т1 =-------------,
Ti (к)
где Т1 (м) - время начала свертывания исследуемого материала в секундах;
Т1 (к) - время начала свертывания в контроле в секундах.
Т2(м) х 100
КИ Т2 =-------------,
Т2(к)
где Т2 (м) - время конца свертывания исследуемого материала в секундах;
Т2 (к) - время конца свертывания в контроле в секундах.
При проведении исследований считали верным утверждение, что минимальные показатели КИ Т2 свидетельствуют о высокой ге-мостатической активности исследуемых материалов, и наоборот.
Для исследования характера и степени морфологических изменений в брюшной полости при использовании аппликационных гемостатических средств в хроническом эксперименте на собаках моделировалась стандартная травма печени и селезенки.
С целью моделирования стандартной травмы выполнялась краевая резекция органа, отступя 1 см от его края, и рассечение на глубину 2 см. Таким образом, формировалось два типа раны: одна, раневая поверхность которой была обращена в просвет брюшной полости, и другая, две раневые поверхности которой были обращены друг к другу.
Для аппликации и тампонирования ран печени и селезенки использовались изучаемые нами аппликационные гемостатические средства, которые дополнительно фиксировались узловыми швами лавсановой нитью. Все животные выводились из экспериментов
на 14 сут. Выбор нами данного срока обусловлен тем, что к 14 сут. новообразованная соединительная ткань полностью не сформировалась и, учитывая концепцию морфогенеза спаек и рубцовой реституции на более поздних сроках, выраженность фиброзного процесса в брюшной полости, в поврежденных тканях и органах может уменьшиться или увеличиться, их морфологическое изучение на данном сроке позволяет оценить степень зрелости и тенденции эволюции новообразованной соединительной ткани.
Срединным разрезом вскрывалась брюшная полость и оценивалась выраженность СПБП с применением визуально-описательного метода и учетом макроморфологической классификации спаек брюшной полости с помощью метода семантического дифференциала в баллах. В каждом случае из трупа животного извлекались органы (печень, селезенка), где моделировались раны и осуществлялся гемостаз с имплантацией различных изучаемых нами средств с окружающими тканями.
Весь морфологический материал маркировался и фиксировался в буферном 10% растворе нейтрального формалина, по общепринятой гистотехнической методике приготавливались парафиновые срезы, которые затем окрашивались гематоксилин-эозином, пикро-сириус-красным (ПСК), и по Маллори. Препараты изучались посредством световой микроскопии с различным увеличением. При проведении морфологических исследований производилось макро- и микрофотографирование изучаемых объектов (цифровое фотопротоколирование).
Полученные данные были обработаны статистически с вычислением средних величин (сред. арифметической), средних ошибок средних и достоверности различий (р < 0,05). Достоверность различий оценивалась по критериям Стьюдента, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований in vitro с кровью 18 доноров нами было установлено, что укорочение времени начала свертывания крови Ti отмечалось при изуче-
нии всех образцов имплантатов по отношению к контролю (значения достоверны по отношению к контролю р<0,05). Минимальные показатели коагуляционного индекса Т1 по отношению к контролю отмечены при изучении средств "Ферроресорб-2", "Серджисел", "Биатравм", "Ферробиатравм", "Серджисел Нью-Нит", эндопротеза сетчатого полипропиленового (ЭСП).
Достоверность различий средних величин с использованием критерия Манна-Уитни КИ Т1 определялась по отношению к гемостати-ческой губке. Значения оказались статистически недостоверны р>0,05 за исключением опытов с использованием "Ферроресорб-2", где р<0,05. Максимальные показатели КИ Т1
■ Контроль
НГубка гемостатическая
□ "Биатравм"
□ "Ферробиатравм"
■ "Ресорб-2"
В "Ферроресорб-2"
ИЗндопротез сетчатый полтропиленовьй
□ "Серджисел"
□ "Серджисел Нью-Нит"
□ ПВДФ-К
□ Медицинский клей
были выявлены при тестировании мононити ПВДФ-К, медицинского клея и образцов "Ре-сорб-2" (рис. 1).
Исходя из того, что нами не были выявлены достоверные различия при анализе КИ Т1, следует считать, что Т1 - неспецифично указывает на гемостатическую активность материалов, и для характеристики нужно использовать только показатели Т2.
Минимальные показатели укорочения времени конца свертывания крови Т2 отмечены при изучении гемостатической губки, средств "Биатравм", "Серджисел Нью-Нит", "Ресорб-2", "Ферроресорб-2" (различия достоверны р<0,05). Максимальные показатели Т2, близкие к контролю, зарегистрированы
0 Контроль
В Губка гемостатическая
□ "Биатравм"
В "Ферробиатравм"
■ "Р есорб-2"
В "Ферроресорб-2"
В Эндопротез сетчатый полипропиленовьй
□ "Серджисел"
□ "Серджисел Нью-Нит"
□ ПВДФ-К
7
□ Медицинский клей
Рис. 1. Показатели коагулограмм при изучении времени начала свертывания крови.
250
С е к У
н 200
д
ы
150
И Контроль
В Губка гемостатическая
[¡"Биатравм"
□ "Ферробиатравм"
■ "Ресорб-2"
В "Ферроресорб-2"
В Эндопротез сетчатый полтропиленовьй
□ "Серджисел"
□ "Серджисел Нью-Нит"
□ ПВДФ-К
□ Медицинский клей
450
400
350
300
100
50
Т2
В Контроль
□ Губка гемостатическая
П "Биатравм"
□ "Ферробиатравм"
■ "Ресорб-2"
В "Ферроресорб-2"
ИЗндопротез сетчатый полипропиленовый
□ "Серджисел"
□ "Серджисел Нью-Нит"
□ ПВДФ-К
□ Медицинский клей
Рис. 2. Показатели коагулограмм при изучении времени конца свертывания крови.
при тестировании медицинского клея, ЭСП и мононити ПВДФ-К.
Коагуляционный индекс Т2 был минимальным по отношению к контролю при изучении средства "Биатравм", гемостатической губки, "Ресорб-2", "Серджисел Нью-Нит", "Ферроресорб-2", максимальным - при тестировании ЭСП, мононити ПВДФ-К, медицинского клея. Достоверность различий средних величин КИ Т2 определялась по отношению к гемостатической губке с использованием критерия Манна-Уитни. Значения оказались статистически недостоверными (р>0,05), за исключением ЭСП, где р<0,01, и медицинского клея, где р<0,05 (рис. 2).
Проведенные исследования образцов ге-мостатических средств in vitro позволяют утверждать, что гемостатическая губка, атравматические раневые покрытия: "Би-
атравм", "Ресорб-2", "Ферроресорб-2", и ге-мостатическое рассасывающееся средство "Серджисел Нью-Нит", обладают выраженной гемостатической активностью, значительно укорачивающей время начала и конца свертывания крови.
При исследовании характера и степени морфологических изменений в брюшной полости, при использовании аппликационных средств в хроническом эксперименте на собаках при аутопсии в месте травмы органов наблюдался спаечный процесс во всех случаях. При изучении в сравнительном аспекте выраженности спаечного процесса брюшной полости в баллах на модели экспериментальных стандартных травм печени и селезенки, при применении аппликационных гемостати-ческих материалов получены результаты, которые представлены в табл. 1.
При анализе результатов нами было выявлено, что аппликация коллагенсодержащих средств, таких как гемостатическая губка, атравматические раневые покрытия "Биатравм", "Ферробиатравм", "Ресорб-2", "Фер-роресорб-2", гемостатические рассасывающиеся материалы "Серджисел", "Серджисел Нью-Нит" и эндопротез сетчатый полипропиленовый, приводит к образованию спаек. Минимальные показатели выраженности спаечного процесса брюшной полости в баллах отмечены при аппликации эндопротеза сетчатого полипропиленового (различия по отношению к гемостатической губке достоверны, p<0,001), средств "Серджисел", "Серджисел Нью-Нит" (различия по отношению к гемо-статической губке достоверны, p<0,05). Максимальные показатели выраженности спаечного процесса брюшной полости в баллах выявлены при изучении аппликационных средств "Ферробиатравм", "Ферроресорб-2" (различия по отношению к гемостатической губке недостоверны, p>0,05) (рис. 3).
Аппликационные гемостатические материалы "Ферробиатравм", "Ресорб-2", "Ферро-ресорб-2" приводили к выраженным морфологическим изменениям в брюшной полости при их применении. Печень и селезенка в местах имплантации были уплотнены, в нескольких опытах после аппликации " Ферро-биатравм" и "Ферроресорб-2" отмечены абсцессы в печени. При гистологическом исследовании обнаружены выраженные воспалительные изменения, резко выраженный фиброз вокруг имплантата (рис. 4). Реакция тканей на имплантацию этих средств показала, что аппликационные гемостатические материалы "Ферробиатравм", "Ресорб-2", "ФерроТаблица 1
Выраженность СПБП в баллах у животных при использовании аппликационных средств
МАТЕРИАЛ M±m Р
Г убка гемостатическая (контроль) 3,168±0,16 -
"Биатравм" 3,251±0,14 P>0,05
"Ферробиатравм" 3,65±0,38 P>0,05
"Ресорб-2" 2,617±0,36 P>0,05
"Ферроресорб-2" 3,576±0,54 P>0,05
Эндопротез сетчатый полипропиленовый 1,537±0,15 P<0,001
"Серджисел" 2,171±0,32 P<0,05
"Серджисел Нью-Нит""
2,424±0,17
P<0,05
Рис. 3. Спаечный процесс, конгломерат органов, состоящий из печени, большого сальника, диафрагмы у животного на 14-е сутки после операции ("Ферроресорб-2").
Рис. 4. Микрофотография ткани печени в области ушивания экспериментальной травмы на 14-е сутки после операции ("Ферроресорб-2"). Окр. по Маллори; ув. 8х20х6.
Рис. 5. Печень, подпаянная к вентральной стенке желудка у животного на 14-е сутки после операции ("Серджисел").
ресорб-2" не могут быть использованы для При анализе результатов нами было выяв-
остановки паренхиматозного кровотечения. лено, что гемостатические рассасывающиеся
материалы "Серджисел" и "Серджисел Нью-
Нит" также приводили к морфологическим изменениям в брюшной полости, но показатели выраженности спаечного процесса брюшной полости в баллах близки к минимальным (рис. 5).
При анализе результатов гистологического исследования нами были обнаружены воспалительные реакции в паренхиме при аппликации гемостатических рассасывающихся материалов "Серджисел", "Серджисел Нью-Нит" . Однако реакция на имплантат выражена в значительно меньшей степени, чем в сериях при аппликации средств "Ферробиатравм", "Ресорб-2", "Ферроресорб-2".
При изучении результатов аппликации эндопротеза сетчатого полипропиленового нами выявлены минимальные показатели выраженности спаечного процесса брюшной полости в баллах, но при гистологическом исследовании вокруг фрагментов эндопротеза
определялся воспалительный инфильтрат в селезенке, а в печени вокруг фрагментов эндопротеза - сформировавшаяся, достаточно зрелая грануляционная ткань с высоким содержанием коллагеновых волокон I типа.
При исследовании в эксперименте атрав-матического раневого покрытия "Биатравм" нами выявлены оптимальные соотношения показателя выраженности СПБП по отношению к гемостатической губке и реакции тканей на имплантацию. Спайки образуются между долями печени, желудком, двенадцатиперстной кишкой и с большим сальником (рис. 6). Полюсы селезенки так же, как и в других сериях, окутаны большим сальником. Вокруг имплантированного материала в ткани печени и селезенки формировалась плотная рубцовая ткань с плотно упакованными коллагеновыми волокнами I типа. Яв-
Рис. 6. Спаечный процесс, конгломерат из долей печени, сальника, желудка у животного на 14-е сутки после операции ("Биатравм").
Рис. 7. Микрофотография ткани печени в области ушивания экспериментальной травмы на 14-е сутки после операции ("Биатравм"). Окр. ПСК; ув. 8х40х6.
лений инфильтрации не выявлено. Паренхима, окружающая гранулему, патоморфологических изменений не имела (рис. 7).
Сравнительные исследования по данным литературы таких аппликационных форм, как растворы и мягкие гели, пасты, пленки, губки, тканые и нетканые материалы, привели к выводу, что лучшими гемостатическими свойствами благодаря капиллярно-пористой структуре обладает коллагеновая губка. В основе механизма гемостатического действия коллагеновой губки лежат ее высокие сорбционные свойства в сочетании со способностью моделировать поверхность раны, механизм гемостатического действия коллагена характеризуется быстрым взаимодействием его с тромбоцитами, что приводит к активации адгезивно-агрегационных свойств тромбоцитов [1].
В состав изучаемых нами новых аппликационных средств входит сочетание губки ге-мостатической коллагеновой и нетканых ("Биатравм", "Ферробиатравм") и тканых материалов ("Ресорб-2", "Ферроресорб-2"), что объясняет их выраженную гемостатическую активность.
Выраженные воспалительные изменения и фиброз вокруг имплантата, абсцессы при имплантации средств "Ферробиатравм" и "Ферроресорб-2", мы считаем, связаны с тем, что все слои этих средств пропитаны раствором коллоидного железа (реакция тканей на коллоидное железо), при имплантации средства "Ресорб-2" - реакция тканей на активированную угольную ткань. Поэтому аппликационные средства "Ферробиатравм", "Ферро-ресорб-2" и "Ресорб-2" не могут быть рекомендованы в качестве аппликационного средства для гемостаза при паренхиматозных кровотечениях.
Воспалительные реакции в паренхиме при аппликации гемостатических рассасывающихся материалов "Серджисел", "Серджисел Нью-Нит" мы объясняем их кислой средой (рН 2,5-З,0). По данным литературы, применение препаратов оксицеллюлозы ограничено их местно-раздражающим действием, предрасполагающим к развитию инфекции [5, 9], что подтверждается нашими исследованиями.
Эндопротез сетчатый полипропиленовый не обладает гемостатическими свойствами, он не может быть рекомендован как аппликационное средство для остановки кровотечения, но может быть использован как каркасное средство, усиливающее сдавление ткани органа по линии гемостатического шва и уменьшающее риск прорезывания швов [5].
Таким образом, проведенные нами экспериментальные исследования показали, что атравматическое раневое покрытие "Биатравм" обладает выраженной гемостатиче-ской активностью, значительно укорачивающей время начала и конца свертывания крови, и биологической инертностью, вызывающей минимальные реакции тканей на имплантацию, и может быть использовано как аппликационное средство для остановки кровотечений из паренхиматозных органов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Абоянц Р.К. и др. Аппликационное средство гемостаза при капиллярно-паренхиматозном кровотечении // Хирургия. - 2004. - № 9. - С. 55-59.
2. Владимирова Е.С., Абакумов М.М. Хирургическая тактика при закрытых повреждениях печени // Хирургия. - 1997. - № 3. - С. 53-57.
3. Горский В.А., Шуркалин Б.К., Леоненко И.В. Применение ТахоКомба в абдоминальной хирургии. - М.: Изд-во "Атмосфера", 2003. -168 с.
4. Ермолов А.С., Абакумов М.М., Владимирова Е.С. Травма печени. - М.: Медицина, 2003. - 192 с.
5. Литвин А.А., Цыбуляк Г.Н. Местный гемостаз в хирургии повреждений печени и селезенки // Хирургия. - 2000. - № 4. - С. 74-76.
6. Масляков В.В., Барсуков В.Г. Клинические проявления закрытой травмы селезенки // Анналы хирургии. - 2006. - № 5. - С. 41-43.
7. ЧеркасовМ.Ф., Ситников В.Н., Саркисян В.А., Турбин М.В. Балонно-компрессионный метод гемостаза при повреждении паренхиматозных органов // Хирургия. - 2005. - № 3. - С. 4951.
8. Feliciano D.V. Surgery for liver trauma // Surg. Clin. Nort Am. - 1989. - Vol. 69, N 2. - P. 273284.
9. GabayM. Absorbable hemostatic agents // Am. J. Health Syst. Pharm. - 2006. - Vol. 63, N 7. -P.1244-1253.
