CC BY
191
УДК 616.36-089:616.411-089]-092.4:615.273.5
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ СРЕДСТВ МЕСТНОГО ГЕМОСТАЗА
В ХИРУРГИИ ПЕЧЕНИ И СЕЛЕЗЕНКИ
© Чижиков Г.М., Бежин А.И., Иванов А.В., Майстренко А.Н., Липатов В.А.,
Нетяга А.А., Жуковский В.А.
Кафедра кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: ChGM@inbox. ru
Изучены гемостатические, антиадгезивные свойства и биологическая инертность новых аппликационных материалов «Образец № 1», «Образец № 2» и «Образец № 3» относительно распространенных материалов - губка гемо-статическая коллагеновая, «Биатравм», «Серджисел» и «Серджисел Нью-Нит». Эксперименты in vitro проводили в 98 опытах с использованием нативной крови 14 доноров-добровольцев на электрокоагулографе Н-334. Изучение свойств материалов in vivo выполнено на 64 крысах и 42 кроликах. Результаты показали, что максимальной гемостатической активностью и биологической инертностью обладают новые средства гемостаза «Образец № 1» и «Образец № 2», а показатели материала «Образец № 3» сопоставимы с гемостатическими свойствами препаратов губка гемостатическая коллагеновая и «Биатравм». В эксперименте доказано, что новые материалы «Образец № 1», «Образец № 2» и «Образец № 3» обладают выраженными антиадгезивными свойствами.
Ключевые слова: гемостаз, аппликационные средства, гемостатический материал, биологическая инертность, спаечный процесс брюшной полости.
EXPERIMENTAL STUDY OF NEW DRUGS OF LOCAL HEMOSTASIS IN SURGERY OF LIVER AND SPLEEN Chizhikov G.M., Bezhin A.I., Ivanov A. V., Maystrenko A.N., Lipatov V.A., Netyaga A.A., Zhukovsky V.A.
Department of Operative Surgery & Topographic Anatomy, Histology, Cytology & Embryology Department
of the Kursk State Medical University, Kursk Investigations of hemostasis, antiadhesive properties and biological inertia of new materials "Sample №1", "Sample №2" and "Sample №3"regsrding relatively common materials - collagen hemostatic sponge, "Biatravm", "Surgicel" and "Surgicel Nu-Knit"were made. In vitro experiments were carried out in 98 cases with native blood of 14 donors-volunteers at device "Elektrokoagulograf H-334". Studying of the properties of materials in vivo were carried out on 64 rats and 42 rabbits. The results showed that the maximal hemostatic activity and biological inertness of hemostasis "Sample №1" and "Sample №2", and indicators of material "Sample №3" are comparable to the hemostatic properties of preparations collagen hemostatic sponge and "Biatravm". The experiment proved that the new materials "Sample №1", "Sample №2" and "Sample №3" have expressed antiadhesive activity.
Keywords: hemostasis, application drugs, hemostatic material, biological inertness, adhesions of the abdominal cavity.
Актуальной проблемой современной хирургии является остановка кровотечения при травмах и операциях на паренхиматозных органах, в том числе на печени и селезенке. Большой интерес к проблеме гемостаза повреждений данных органов обусловлен постоянно растущим количеством их травматизации, что связано с научно-техническим прогрессом, увеличением интенсивности дорожного движения, популяризацией силовых видов спорта и другими социальными факторами [1].
По частоте травматизации печень занимает второе место среди всех повреждений органов брюшной полости [8]. Встречаемость повреждений печени при закрытой травме органов брюшной полости варьирует от 20 до 47%, при проникающих ранениях от 57 до 86% [4]. Послеоперационные осложнения при травме печени возникают в 17-36% наблюдений, а летальность достигает 9-35% [7].
Частота повреждений селезенки соответствует 22,3-30% при травме органов брюшной полости и занимает второе место среди разрывов паренхиматозных органов. Летальность после спле-нэктомии, проводимой при травме селезенки, составляет 18-30% при изолированных ее ранениях
[5].
Для остановки кровотечения из печени и селезенки предложено множество способов, технических приемов и материалов, но простая и надежная методика пока не разработана, что нередко затрудняет выполнение операции.
В последнее время широкое внимание и распространение получили местные аппликационные гемостатические материалы. Г.Г. Белозерская считает, что применение кровоостанавливающих средств местного действия является одним из перспективных способов остановки паренхиматозного кровотечения [2]. Однако широкому вне-
дрению в хирургию современных гемостатиче-ских средств местного действия («Берипласт- II», «Тиссукол», «Тахокомб») препятствует их высокая стоимость [9]. Поиск новых методов, разработка современных средств гемостаза, обладающих высокой эффективностью и простотой применения, является неотложной проблемой хирургии.
Цель исследования: изучить в сравнительных экспериментальных условиях гемостатическую и противоспаечную активность, а также биологическую инертность новых аппликационных кровоостанавливающих материалов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сравнительному анализу степени гемостати-ческой активности были подвергнуты следующие кровоостанавливающие материалы:
1. Губка гемостатическая коллагеновая (ГГК);
2. Атравматическое раневое покрытие «Биа-травм»;
3. Гемостатическое рассасывающееся средство «Серджисел»;
4. Гемостатическое рассасывающееся средство «Серджисел Нью-Нит»;
5. Губка гемостатическая с противоспаечной активностью «Образец № 1»;
6. Губка гемостатическая с противоспаечной активностью «Образец № 2»;
7. Губка гемостатическая с противоспаечной активностью «Образец № 3».
Технология приготовления и состав кровоостанавливающих материалов «Образец № 1», «Образец № 2» и «Образец № 3» представляет собой ноу-хау. Все включенные в экспериментальное исследование образцы материалов приготовлены официнальным способом.
Исследование по изучению гемостатических свойств аппликационных кровоостанавливающих средств включало эксперименты in vitro и in vivo.
В экспериментах in vitro изучение гемостати-ческих свойств препаратов проводили в 98 опытах с использованием нативной крови 14 здоровых доноров-добровольцев (18-23 лет). Оценку гемостатической активности изучаемых материалов осуществляли с помощью электрокоагуло-графа Н-334 посредством разработанного нами способа (патент РФ № 2373532 от 20.11.09). Кровоостанавливающие материалы на основе коллагена (ГГК, «Биатравм», «Образец № 3») были объединены в одну опытную группу - «коллаген-содержащие гемостатические материалы» (КсГМ). Это связано с тем, что для их изготовления используется коллаген, априори обладающий сходными гемостатическими свойствами, кото-
рый составляет их основу. Их числа КсГМ в экспериментальном исследовании in vitro была использована губка гемостатическая коллагеновая (ГГК) (ОАО Лужский завод «БЕЛКОЗИН», Ленинградская область, г. Луга). С целью изучения влияния на процесс скорости свертывания крови, в исследование был включен медицинский клей БФ-6 (далее медицинский клей) (ЗАО «Вертекс», г. Санкт-Петербург), который составил отдельную группу экспериментов in vitro. Включение медицинского клея в исследование связано с необходимостью его использования при проведении экспериментов in vitro в качестве вспомогательного компонента.
Эксперименты in vivo выполнены на 64 белых крысах-самцах линии Wistar, массой 180-200 гр. и 42 кроликах породы шиншилл, массой 2-2,5 кг. В эксперименте использовали животных без внешних признаков заболевания, прошедших карантинный режим в условиях вивария Курского государственного медицинского университета. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном питьевом и пищевом рационе.
В остром эксперименте на крысах изучено влияние кровоостанавливающих средств на время остановки кровотечения и величину кровопотери в условиях моделирования травм печени и селезенки и применения гемостатических материалов. Животные были разделены на 8 групп, в каждую группу было включено по 8 животных. Контрольной считалась группа с применением тампона из марлевой салфетки.
Характер и степень морфологических изменений органов брюшной полости, выраженность степени спайкообразования изучали в хроническом эксперименте на кроликах породы шиншилла при моделировании травм печени и селезенки по разработанной нами методике с последующей имплантацией аппликационных гемостатических препаратов. Животные были разделены на 7 групп по 6 животных в каждой, контрольной считалась серия с применением ГГК.
Выведение животных из хронического эксперимента осуществляли на 14-е сутки путем передозировки средств для наркоза. Проводили тщательную ревизию органов брюшной полости с оценкой состояния гемостатических материалов, реакции брюшины и органов брюшной полости на инородный материал. Оценивали выраженность спаечного процесса брюшной полости (СПБП) с применением визуально-описательного метода и учетом макроморфологической классификации спаек брюшной полости с помощью метода семантического дифференциала в баллах [6].
Полученные данные были обработаны статистически с вычислением средних величин (про-
стая арифметическая средняя), средних ошибок средних арифметических. Определяли равномерность распределения признака в выборочной совокупности по критерию Колмогорова, а в зависимости от типа распределения оценивали межгрупповую достоверность различий по критериям Стьюдента, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса (существенными считали отличия при Р<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение в эксперименте in vitro гемостати-ческих свойств аппликационных материалов показало, что все исследуемые препараты обладают выраженной достоверной гемостатической активностью относительно контрольного исследования (табл. 1). Максимальная гемостатическая активность наблюдалась при исследовании материалов
Показатели коагулограмм при изучении образцов материалов
«Образец № 1» и «Образец № 2» (р<0,001), применение которых способствовало снижению времени свертывания крови относительно контрольных исследований (контроль, медицинский клей) в 1,54-1,62 раза. Использование в эксперименте медицинского клея не привело к существенным изменения времени свертывания крови относительно контроля и сократилось на 1,5% (р>0,05), из чего следует, что медицинский клей может быть использован в качестве вспомогательного вещества при изучении гемостатических свойств хирургических материалов разработанным нами способом.
Данные сравнительного анализа времени остановки кровотечения из экспериментальных травм печени и селезенки в условиях применения исследуемых аппликационных гемостатических материалов представлены на рис. 1.
Таблица 1
гемостатической активности исследуемых в опытах in vitro (M±m)
Материал № Т2 р* КИ Т2 р** р ***
Контроль 14 510,0±24,40 - 100 - -
Медицинский клей 14 501,4±22,98 >0,05 98,5±0,83 - <0,001
КсГМ 14 395,7±23,61 <0,05 78,1±3,26 <0,001
«Серджисел» 14 402,9±23,54 <0,05 79,4±3,38 <0,001
«Серджисел Нью-Нит» 14 391,4±29,85 <0,05 76,5±4,14 <0,001
«Образец № 1» 14 314,3±32,82 <0,001 62,3±5,61 <0,001
«Образец № 2» 14 322,9±22,09 <0,001 63,9±3,65 <0,001
Примечание: 1. р* - достоверность различий средних величин по отношению к контролю (рассчитывалась с использованием критерия Стьюдента).
2. р** - достоверность различий средних величин по отношению к губке гемостатической коллагеновой (рассчитывалась с использованием критерия Манна-Уитни).
3. р*** - достоверность различий средних величин при комплексном сравнении (рассчитывалась с использованием критерия Крускала-Уоллиса).
70-
60-
50-
40-
30-
В Контроль И ГГК
H "Биатравм" В "Серджисел" Ш "Серджисел Нью-Нит" И "Образец № 1" И "Образец № 2" H "Образец № 3"
Модель травмы печени Модель травмы селезенки
Рис. 1. Средние показатели времени остановки кровотечения на модели стандартной травмы.
Из результатов исследования следует, что время остановки кровотечения из травм печени и селезенки при применении всех гемостатических материалов значительно уменьшалось, за исключением эксперимента с материалом «Серджисел», показатели которого приближаются к контролю. Время кровотечения из травмы печени в условиях применения материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» сократилось на 52,6-58,8% относительно контроля и на 27,3-33,7% относительно ГГК. Укорочение времени остановки кровотечения из стандартной травмы селезенки было максимальным при тестировании материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» и было в 1,85-1,94 раза (р<0,001) меньше относительно контроля и в 1,42-1,49 раза (р<0,05) - относительно ГГК. Показатели времени остановки кровотечения материалов ГГК, «Биатравм», «Серджисел Нью-Нит» и «Образец № 3» были приблизительно равны, их применение способствовало снижению времени остановки кровотечения из травмы печени на 34,0-40,4% и из травмы селезенки на 19,6-26,2% относительно контроля.
Анализ данных величины кровопотери при осуществлении гемостаза из травм печени и селезенки указывает на значительное снижение показателей в условиях применения изучаемых кровоостанавливающих материалов и соответствует снижению кровопотери из травмы печени на 43,5% и более, из травмы селезенки на 51,0% и более. Использование материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» с целью гемостаза способствовало уменьшению величины кровопотери из раны печени в 3,68-3,82 раза (р<0,001), из раны селезенки в 2,91-3,18 раза (р<0,001) относительно контрольного эксперимента (рис. 2).
Оценка степени выраженности морфологических изменений в брюшной полости в условиях
моделирования экспериментальных травм печени и селезенки и имплантации кровоостанавливающих средств, включенных в исследование, позволяют сделать выводы о том, что во всех случаях наблюдался разной степени выраженности спаечный процесс брюшной полости (СПБП), который является следствием как повреждения целостности структуры паренхиматозных органов в процессе моделирования травм, так и признаком степени биологической инертности исследуемых материалов. Результаты исследования представлены в табл. 2.
Низкая степень выраженности спайкообразо-вания в условиях применения материалов «Образец № 1», «Образец № 2» и «Образец № 3» указывает на наличие у данных препаратов антиадгезивной активности. Показатели СПБП при экспериментальном изучении материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» носили минимальный характер, при этом достоверность показателей с использованием критерия Стьюдента составила р<0,001, а критерия Манна-Уитни - р<0,05. Кровоостанавливающее средство с противоспаечной активностью «Образец № 3», основой которого является коллаген, априори обладающее сопоставимыми характеристиками биологической инертности с ГГК, показало значительно меньшую выраженность спайкообразования по отношению к ГГК (р<0,05), сопоставимую с материалами «Серджисел» и «Серджисел Нью-Нит», что доказывает наличие у данного препарата противоспа-ечной активности. Максимальные показатели выраженности спаечного процесса были зарегистрированы при использовании материалов ГГК и «Биатравм».
Анализ результатов гистологической картины микропрепаратов мест моделирования травм печени и селезенки и имплантации исследуемых ге-
400
350
200
в 150
В Контроль
НГГК
H "Биатравм" H "Серджисел" Ш "Серджисел Нью-Нит" В "Образец № 1" 0 "Образец № 2" H "Образец № 3"
Модель травмы печени Модель травмы селезенки
300
250
100
50
0
Рис. 2. Средние показатели массы кровопотери на модели стандартной травмы.
Таблица 2
Выраженность СПБП в баллах у животных при использовании средств гемостаза (M±m)
МАТЕРИАЛ Баллы р* р ** р ***
ГГК 2,52 0,162 -
«Биатравм» 2,65 0,114 р>0,05 р>0,05
«Серджисел» 1,65 0,354 р<0,05 р>0,05
«Серджисел Нью-Нит» 1,62 0,103 р<0,001 р<0,05 р<0,001
«Образец № 1» 0,75 0,094 р<0,001 р<0,05
«Образец № 2» 1,04 0,099 р<0,001 р<0,05
«Образец № 3» 1,61 0,193 р<0,05 р<0,05
Примечание: 1. Р* - достоверность различий средних величин по отношению к контролю (рассчитывалась с использованием критерия Стьюдента). 2. Р**- достоверность различий средних величин по отношению к губке гемостатической коллагеновой (рассчитывалась с использованием критерия Манна-Уитни). 3. Р***- достоверность различий средних величин при комплексном сравнении (рассчитывалась с использованием критерия Крускала-Уоллиса).
мостатических материалов, показал, что признаки воспаления присутствуют во всех сериях экспериментального исследования. Установлено, что минимальная выраженность степени воспалительных изменений наблюдалась при использовании гемостатических материалов «Образец № 1» и «Образец № 2». Большое количество макрофагов и ГКИТ в присутствии материала «Образец № 2», может быть объяснено более длительным сроком биодеградации данного средства. Причиной воспалительного процесса является повреждение тканей паренхимы печени и селезенки в процессе моделирования травмы, и его выраженность зависит от состава и биоинертности исследуемых материалов. Учитывая стандартизован-ность экспериментальной модели, следует предположить, что выраженность наблюдаемых воспалительных явлений зависит исключительно от биологической инертности материалов.
В местах моделирования травм и имплантации исследуемых материалов наблюдалось формирование разной по толщине и структурной организации соединительнотканной капсулы (СТК). Применение в эксперименте коллагенсодержащих материалов (ГГК, «Биатравм», «Образец № 3») способствует формированию максимальной по толщине и наиболее сложно организованной капсулы (рис. 3). Наоборот, минимальная выраженность толщины капсулы наблюдалась в условиях применения гемостатических материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» (р<0,001) (рис. 4). Выраженность толщины СТК представлена на рис. 5.
Таким образом, проведенное исследование показало, что все включенные в эксперимент кровоостанавливающие аппликационные препараты являются гемостатическими материалами, способствуя эффективному снижению показателей Т2, КИ Т2, времени остановки кровотечения (за
исключением материала «Серджисел») и массы кровопотери. Изучение новых средств гемостаза «Образец № 1» и «Образец № 2», основой которых является карбоксиметилцеллюлоза, в сравнительном аспекте относительно используемых материалов (губка гемостатическая коллагеновая, «Биатравм», «Серджисел», «Серджисел Нью-Нит») выявило наличие у них высокой гемоста-тической активности и биологической инертности, превышающей таковую в группах сравнения. В основе механизма гемостатического действия новых разработанных материалов на основе кар-боксиметилцеллюлозы лежит образование эрит-роцитарно-целлюлозного тромба, обладающего адгезивными свойствами [3]. Общеизвестными являются данные о высокой биологической инертности и антиадгезивной активновти препаратов в основе которых лежат производные целлюлозы, а также их положительное влияние на процесс регенерации тканей.
Мы считаем, что губчатая матрица материалов «Образец № 1» и «Образец № 2» обеспечивает им высокую сорбционную активность, способствующую эффективной адгезии и агрегации форменных элементов крови и ускоренному формированию эритроцитарно-целлюлозного тромба. Способ и состав изготовления материалов обеспечивает им высокую адгезивность к раневой поверхности, способствующую механической остановки кровотечения ввиду плотного прилегания материала к подлежащим тканям. Оптимальные сроки биологической деградации и антиадгезивная активность новых материалов способствуют максимальному снижению степени выраженности спайкообразования брюшной полости, а репара-тивные свойства целлюлозы ускоряют процесс регенерации паренхимы органа и мезотелизации.
Рис. 3. Паренхима печени в области стояния материала «Биатравм» на 14-е сутки после моделирования экспериментальной травмы. Окр. Г+Э; ув. 100.
шшшшщшш
Рис. 4. Паренхима печени в области стояния материала «Образец № 2» на 14-е сутки после моделирования экспериментальной травмы. Окр. Р8Я; ув. 100.
0,7
0,6
0,5-"
¡- 0,4 " : =
ч 0,3 " ._
0,2"
0,1
а ггк
Н "Биатравм" В "Серджисел" 0 "Серджисел Нью-Нит" Ш "Образец № 1" И "Образец № 2"
И "Образец № 3"
□
Толщина СТК (печень) Толщина СТК (селезенка)
Рис. 5. Толщина СТК места моделирования травмы печени и селезенки с последующей имплантацией исследуемых образцов материалов.
0
Разработанное новое средство «Образец № 3» обладает сопоставимыми гемостатическими свойствами с материалами ГГК, «Биатравм», однако степень выраженности спаечного процесса брюшной полости в условиях его применения значительно снижается.
Материалы «Образец № 1», «Образец № 2» и «Образец № 3», обладающие эффективными ге-мостатическими и антиадгезивными свойствами, после проведения необходимых клинических исследований можно рекомендовать в качестве аппликационных средств для остановки кровотечений из паренхиматозных органов при повреждениях и операциях на них. Гемостатические материалы с противоспаечной активностью «Образец № 1» и «Образец № 2» могут быть использованы в качестве локальных средств профилактики спайкообразования наряду с местными антиадгезивными препаратами (например, средство «Ш;ег-сее^»). Очевидно превосходство разработанных новых материалов обладающих как кровоостанавливающей способностью, так и противоспаеч-ной активностью над современными аппликационными средствами гемостаза, не предотвращающих, а зачастую способствующих спайкооб-разованию, и препаратами локальной профилактики спаечного процесса, не способных останавливать кровотечения, а в ряде случаев противопоказанных к применению в условиях неустойчивого гемостаза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабич И.И., Матвеев О.Л., Панченко С.Н. и др.
Способ лечения комбинированных повреждений
печени и селезенки у детей // Вестник хирургии. -2008. - Т. 167, № 1. - С. 57-61.
2. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Абоянц Р.К. и др. Аппликационное средство гемостаза при капиллярно-паренхиматозном кровотечении // Хирургия. - 2004. - № 9. - С. 55-59.
3. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Жидков Е.А. и др. Гемостатические средства местного действия (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - № 7. - С. 9-15.
4. Борисов А.Е., Кубачев К.Г., Левин Л.А. и др. Применение миниинвазивной технологии при травмах печени // Анналы хирургической гепатологии. -2007. - Т. 12, № 3. - С. 6-9.
5. Рагимов Г. С., Абдарашидов Х.А., Гаджиев Д.П. др. Выбор способа гемостаза при повреждениях и очаговых поражениях селезенки // Хирургия. -2006. - № 5. - С. 42-45.
6. Суковатых Б.С., Мясников А.Д., Бежин А.И. и др. Эффективность антиспаечного средства с барьерным действием «Мезогель» после рассечения спаек у пациентов с острой спаечной кишечной непроходимостью // Вестник хирургии . - 2008. -№ 5. - С. 29-32.
7. Тимербулатов В.М., Хасанов А.Г., Фаязов Р.Р. Миниинвазивные и органосберегающие операции при травмах печени // Хирургия. - 2002. - № 4. -С. 29-33.
8. Хоробрых Т.В., Антонов А.Н., Антонов О.Н. и др. Опыт использования фибринового клея для лечения травматических повреждений печени // Анналы хирургии. - 2005. - № 3. - С. 50-53.
9. Черноусов А.Ф., Хоробрых Т.В., Пастухов Д.В. Использование фибринового клея в лечении больных с колотыми ранениями печени // Анналы хирургии. - 2008. - № 1. - С. 46-49.
