CC BY
126
Для корреспонденции
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-92 E-mail: apryatin@mail.ru
С.А. Апрятин, К.В. Мжельская, Н.В. Трусов, А.С. Балакина, С.Н. Кулакова, Х.С. Сото, М.А. Макаренко, Н.А. Ригер, В.А. Тутельян
Сравнительная характеристика in vivo моделей гиперлипидемии у крыс линии Вистар и мышей линии C57BÍ/6
Comparative characteristics of in vivo models of hyperlipidemia in Wistar rats and C57BI/6 mice
S.A. Apryatin, K.V. Mzhelskaya, N.V. Trusov, A.S. Balakina, S.N. Kulakova, Kh.S. Soto, M.A. Makarenko, N.A. Riger, V.A. Tutelyan
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow
Моделирование in vivo нарушений липидного обмена (гиперлипидемия, ожирение, метаболический синдром, атеросклероз) представляет значительный интерес для поиска геномных, транскриптомных и метаболомных маркеров, позволяющих осуществлять дифференциальную диагностику, прогноз и выбор персонифицированной диетотерапии у больных при этих состояниях. Целью исследования стала разработка и характеристика базовых биохимических параметров in vivo модели алиментарной гиперлипидемии у аутбредных крыс и инбредных мышей. Эксперимент проведен на 48 растущих крысах-самках линии Вистар и 48 растущих мышах-самках линии C57Black/6, которые были разделены на 12 групп по 8 животных в каждой. В течение 63 дней крысы и мыши 1-х групп (контроль) получали сбалансированный полусинтетический рацион (СПР), 2-х групп - высокожировой рацион с содержаним 30% общих жиров от массы сухого корма, 3-х групп - СПР и 20% водный раствор фруктозы вместо воды, 4-х групп - высокожировой рацион+фруктозу, 5-х групп - СПР с добавкой 0,5% холестерина по массе сухого корма, 6-х групп - СПР с холестерином и фруктозой. Количество и состав потребляемых рационов корректировали на протяжении эксперимента для их максимального сближения по калорийности. После выведения животных из эксперимента определяли массу внутренних органов, содержание липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), общего холестерина, тригли-церидов, глюкозы плазмы, общее содержание липидов печени и их жирно-кислотный состав, уровни грелина, GIP, GLP-1, глюкагона, лептина, PAI-1, резистина плазмы крови. Установлено, что у обоих видов печень наиболее чувствительна к алиментарному дисбалансу, причем нутриентом, оказывающим на этот орган наибольшее воздействие, является фруктоза. У крыс в сравнении с мышами отмечалась значительно более выраженная реакция спектра липопротеинов на алиментарные дисбалансы, в особенности на уровень холестерина, что проявилось в возрастании содержания ЛПНП, снижении ЛПВПи увеличении индекса атерогенности. В печени крыс, получавших рационы с холестерином, отмечено развитие стеатоза, проявлявшегося в многократном увеличении содержания липидов и сопровождавшегося изменениями в их жирнокислотном составе, в частности возрастанием соотношения ю-6/ю-3 полиненасыщенных жирных кислот. Изменение уровней гормонов - регуляторов углеводного обмена (GLP, глюкагона), а также грелина вследствие потребления добавки фруктозы было значительно большим у мышей в сравнении с крысами.
Влияние сочетания холестерина и фруктозы на уровни лептина у двух видов имело противоположную направленность. Обсуждаются значения выявленных межвидовых различий в свете особенностей липидного и углеводного обмена у двух указанных линий животных, являющихся наиболее распространенными моделями алиментарно-зависимой патологии.
Ключевые слова: гиперлипидемия, in vivo модель, крысы, мыши, холестерин, фруктоза, пептидные гормоны
In vivo simulation of lipid disorders (hyperlipidemia, obesity, metabolic syndrome, atherosclerosis) is of considerable interest to search for genomic, transcriptomic and metabolomic markers that allow for differential diagnosis, prognosis and selection of personalized diet therapy in patients with such pathology. The aim of the study was the development and characterization of basic biochemical parameters of in vivo models of alimentary hyperlipidemia in outbred rats and inbred mice. The experiment was conducted on 48 growing female Wistar rats, and 48 growing female mice of line C57Black/6, which were divided into 12 groups of 8 animals per group. Within 63 days the rats and mice of first (control) group received a balanced semi synthetic diet (BD), the animals of the second groups - high-fat diet (HFD) with 30% of the total fat by weight of dry feed, third groups - BD and fructose solution (Fr) instead of water, the fourth groups -HFD + Fr, fifth groups - BD supplemented with 0.5% cholesterol (Cho) by weight of dry feed, sixth groups - BD with Cho and Fr. The amount and composition of diets consumed were corrected during the experiment for their closest approach in calories. After removal of animals from the experiment there were determined the mass of internal organs, HDL, LDL, total cholesterol, triglycerides, glucose in blood plasma, total lipids and their fatty acid composition in liver, ghrelin, GIP, GLP-1, glucagon, leptin, PAI-1, resistin levels in blood plasma. It was found that in both species the liver is the most sensitive to nutritional imbalance, nutrient exerting the greatest impact on this was Fr. In rats, as compared to mice, there was significantly more pronounced shifts in lipoprotein spectrum in response to nutritional imbalances, especially to the consumption of additional Cho, which was manifested in an increase of LDL, decrease of HDL and magnification of atherogenic index. In the liver of rats fed diets with Cho, marked steatosis developed manifested in a disproportionate increase in the lipid content and accompanied by changes in their fatty acid composition, especially in the ratio a»6 to w3 PUFAs. Changing of hormones - regulators of carbohydrate metabolism (GLP, glucagon) and ghrelin was significantly greater in mice than in rats as a result of consumption of additional Fr. Effect had the opposite direction in two species of Cho and Fr combining on leptin levels. The significance is discussed of the revealed interspecies differences in the light of the characteristics of lipid and glucose metabolism in these two lines of animals that are the most common models of alimentary-dependent diseases.
Keywords: hyperlipidemia, in vivo model, rats, mice, cholesterol, fructose, peptide hormones
Моделирование in vivo нарушений липидного обмена (гиперлипидемия, ожирение, метаболический синдром, атеросклероз) представляет значительный интерес с позиции поиска чувствительных биохимических и молекулярно-генетических (геномных, транскриптом-ных) маркеров, позволяющих осуществлять дифференциальную диагностику, прогноз и выбор персонифицированной диетотерапии у больных при этих состояниях. Разработка таких экспериментальных моделей является сложной задачей, поскольку целый ряд особенностей липидного обмена у человека и наиболее распространенных видов лабораторных животных (крыс, мышей) существенно различается [1, 2]. Существуют два различных подхода к данной проблеме, один из них использует так называемые нокаутные линии животных с отключением определенных генов или их групп (гены аполипротеинов, лептина, липопротеидлипазы, рецепторов липопротеидов, синтазы NO эндотелия и др.), что
позволяет приблизить профиль липопротеидов плазмы крови к тому, который наблюдается у больных людей с гиперлипидемией и атеросклерозом [1, 3]. Другой подход состоит в использовании обычных линий мышей и крыс, получающих в течение длительного времени рационы с разбалансированным содержанием пищевого жира и простых сахаров (глюкоза, фруктоза) [4-6]. В этих условиях у животных с алиментарно-индуцированными ожирением, гиперлипидемией и метаболическим синдромом изменяется экспрессия большого числа функционально значимых генов, причем профиль этих изменений не совпадает с таковым у нокаутных животных и в ряде случаев более релевантен тем патологическим сдвигам в обмене веществ, которые наблюдаются у людей с соответствующими нарушениями пищевого поведения [7].
Наиболее распространенными лабораторными линиями мышей и крыс для большинства биомедицинских
исследований являются аутбредная линия крыс Вис-тар и инбредные линии мышей C57Black/6 и BALB/C. Животные этих линий отличаются высокой воспроизводимостью результатов с однотипным и стабильным ответом организма на экспериментальные воздействия пищевыми веществами и фармакологическими препаратами. В литературе описаны различные варианты воспроизведения гиперлипидемии у животных этих линий путем кормления рационами с повышенной квотой жира, простых сахаров и добавками холестерина и желчных кислот [1, 2, 4-6]. Проблемы, возникающие при интерпретации данных этих работ, связаны преимущественно с тем, что в них, как правило, не была обеспечена изо-калорийность опытных и контрольных рационов в условиях свободного доступа животных к корму.
Целью данного исследования явилась разработка и характеристика базовых биохимических параметров in vivo модели алиментарной гиперлипидемии у аутбредных крыс линии Вистар и инбредных мышей линии C57Black/6, получающих рационы с повышенным содержанием общего жира, фруктозы, холестерина и сочетанием этих факторов в условиях максимального приближения рационов к изокалорийности.
Материал и методы
Исследования проводили на 48 крысах-самках линии Вистар со средней начальной массой тела 123±1 г и 48 мышах-самках линии C57Black/6 со средней массой тела 17,8±0,1 г, полученных из питомника лабораторных животных филиала «Столбовая» ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Животных содержали группами по 2 особи в прозрач-
ных пластмассовых клетках из поликарбоната на подстилке из опилок при 20-22 °С и режиме освещения 12/12 ч. Работу с животными выполняли в соответствии с [8] и приказом Минздравсоцразвития России № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении Правил лабораторной практики».
Крысы и мыши были разделены на 12 групп, по 8 животных в каждой (крысы: группы 1а, 2а, 3а, 4а, 5а, 6а; мыши: группы 1б, 2б, 3б, 4б, 5б, 6б). Средняя масса тела в группах каждого вида не различалась (р>0,05, АЫОУА). В течение 63 дней животные 1а и 1б групп (контрольные группы) получали модифицированный полусинтетический рацион по А1Ы93 [9], 2а и 2б групп - полусинтетический рацион с повышенным содержанием общих жиров (30% от массы сухого корма) за счет снижения углеводного компонента (крахмал) и сохраненным соотношением минеральных веществ и витаминов; 3а и 3б групп - полусинтетический рацион с добавлением 20% водного раствора фруктозы вместо воды, 4а и 4б групп - полусинтетический рацион с повышенным содержанием общих жиров и добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды, 5а и 5б групп - полусинтетический рацион с повышенным содержанием холестерина (0,5% по массе сухого корма за счет подсолнечного масла) и соотношением остальных нутриентов, идентичным рациону контрольной группы, 6а и 6б групп - полусинтетический рацион с повышенным содержанием холестерина и добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды. Состав рационов представлен в табл. 1. Животные получали жидкость в режиме свободного доступа и рацион изначально из расчета 15 г на крысу и 4 г на мышь сухого корма в сутки. Для достижения изокалорийности рационов, а также удовлетворения изменяющейся с возрастом физиоло-
Таблица 1. Исходный состав рационов для крыс и мышей из расчета на 100 г массы сухого рациона
Ингредиент Группы крыс/мышей
1а/б 2а/б 3а/б 4а/б 5а/б 6а/б
Казеин, г 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0
Крахмал кукурузный, г 60,05 40,05 60,05 40,05 60,05 60,05
Целлюлоза микрокристаллическая, г 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Солевая смесь*, г 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Холин хлорид (60% холина), г 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
L-цистеин, г 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Витаминная смесь**, г 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Масло подсолнечное, г 5,0 15,0 5,0 15,0 4,5 4,5
Лярд (свиной жир), г 5,0 15,0 5,0 15,0 5,0 5,0
Холестерин, г 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,5
Итого, г 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
П р и м е ч а н и е. * - состав (г): кальций углекислый, безводный - 357; калий фосфорнокислый однозамещенный - 250; натрий хлористый - 74; калий сернокислый - 46,6; калий лимоннокислый моногидрат - 28; магния оксид - 24; железо лимоннокислое - 6,06; цинк углекислый - 1,65; марганец углекислый - 0,63; медь углекислая - 0,3; калия йодат - 0,01; натрия селе-нат безводный - 0,01025; аммония парамолибдат 4-водный - 0,00795; натрия метасиликат - 0,63; хромокалиевые квасцы 12-водные - 0,275; борная кислота - 0,0815; натрий фтористый - 0,0635; никель углекислый - 0,0318; литий хлористый - 0,0174; аммония ванадат - 0,0066; сахароза - до 1000; ** - состав (г): никотиновая кислота - 3,0; пантотенат кальция - 1,6; пиридок-сина гидрохлорид - 0,7; тиамина гидрохлорид - 0,6; рибофлавин - 0,6; фолиевая кислота - 0,2; В-биотин - 0,02; цианокоба-ламин - 0,0025; менадион - 0,075; ретинол ацетат (500 000 МЕ/г) - 0,8; витамин В3 (100 000 МЕ/г) - 1,0; витамин Е (500 МЕ/г) -8,0; сахароза - до 1000.
600 500 400 300 200 100 0
1a
□ 1 п2
2a
□ 3
3a ■ 4 ■ 5
4a
06 еэ7
5a
6a
8 в9
1200 1000 800 600 400 200 0
1б 2б
□1 □2 d3
3б
4б 5б
15 06 и 7
6б
î 8 н9
Недели эксперимента
Недели эксперимента
Рис. 1. Динамика удельного энергопотребления у крыс (а) и мышей (б) на протяжении эксперимента
По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - удельное энергопотребление в среднем за неделю, ккал на 1 кг массы тела в сутки (М±т).
4
гической потребности животных в нутриентах и энергии в ходе эксперимента производили ряд изменений в количественном составе экспериментальных рационов. В ходе эксперимента животных еженедельно взвешивали с точностью ±1 г (крысы) и ±0,1 г (мыши), фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстного покрова, стула, особенности поведения.
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 63-й день путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с добавлением 10% по объему 1% раствора гепарина в стерильном 0,15 М NaCl и центрифугировали при 3000 об/мин (600 g) в течение 15 мин для отделения плазмы. Отбор органов и тканей (печень, селезенка, сердце, почки, тимус, легкие, головной мозг, жировая ткань) осуществляли стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали. Немедленно после отбора органы и ткани охлаждали на льду до 0-2 °С, взвешивали. Биологический материал подвергали анализу непосредственно после отбора или хранили до исследования при -80 °С. Массу внутренних органов и жировой ткани определяли с точностью ±0,01 г.
Содержание липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), низкой плотности (ЛПНП), общего холестерина, триглицеридов, глюкозы в плазме крови определяли на биохимическом анализаторе Konelab 20i («Konelab», Финляндия). Экстракцию липидов печени проводили согласно [10]. Содержание общих липидов в печени определяли гравиметрическим методом [11]. Подготовку проб для определения состава жирных кислот осуществляли согласно официальному методу IUPAC [12]. Анализ состава жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии [13].
Уровни грелина, гастроингибиторного пептида (GIP), глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагона, леп-
тина, ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), резистина в плазме крови мышей определяли методом мультиплексного анализа Luminex на мультианалитных флуоресцирующих магнитных микросферах Bio-Plex Pro («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) с использованием набора Bio-Plex Mouse Diabetes Panel 8-Plex; уровни леп-тина, грелина, GLP-1, глюкагона, PAI-1 в плазме крови крыс - набора Bio-Plex Reagent Kit, 1x96-well, дополняемого реагентами: Pro-Rat 33-Plex Standarts, Rat Diabetes Ghrelin SET, Rat Diabetes Leptin SET, Rat Diabetes GLP-1 SET, Rat Diabetes Glucagon SET, Rat Diabetes PAI-1 SET («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Измерения выполняли на мультиплексном проточном анализаторе Luminex 200 («Luminex Corporation», США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1 («Luminex Corporation», США).
Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрических критериев ANOVA, двустороннего f-критерия Стьюдента для несвязанных показателей с поправкой Levine на неравенство выборочных дисперсий, непараметрического критерия Манна-Уитни при уровне значимости p<0,05.
Результаты
Удельное энергопотребление
Как показало ежедневное определение удельного потребления энергии и белка, использованные пищевые режимы не позволили в начале эксперимента обеспечить равенство этих показателей в опытных и контрольных группах животных (рис. 1). Это было связано в первую очередь с наименьшей в сравнении с другими рационами поедаемостью высокожирового рациона, а также с высокой калорийностью добавки фруктозы. В целях сближения уровней удельного потребления
энергии и белка в опытных группах животных их рацион на протяжении эксперимента подвергали ряду последовательных модификаций. Так, в 3, 4 и 6-х группах, получавших фруктозу, на 3-й день опыта снижали количество потребляемого крахмала на 20%, во 2, 3 и 4-х группах, получавших повышенную квоту жира и/или фруктозы, на 24-й день увеличивали квоту белка за счет удаления 5% по массе целлюлозы и на 31-й день - за счет удаления 10% по массе крахмала; на 37-й день опыта во всех группах, не получавших избыток жира (1-е, 3-и, 5-е, 6-е), снижали суточное количество предоставляемых рационов на 20 или 30%, а начиная с 50-го дня повышали его в этих же группах на 10% для крыс и на 20% для мышей. В результате этих манипуляций в последние недели эксперимента удельное энергопотребление в группах животных удалось сблизить между собой, о чем свидетельствуют данные рис. 1.
Интегральные показатели
На протяжении эксперимента животные большинства групп равномерно прибавляли в массе тела, за исключением крыс группы 5а (добавка холестерина), которые практически перестали прибавлять в массе к концу эксперимента и статистически значимо отстали по этому показателю от животных групп 2а-4а и 6а (р<0,05). В группах мышей животные группы 2б, получавшие высокожировой рацион, прибавляли в массе тела достоверно быстрее животных групп 1б, 3б и 4б (р<0,05), несмотря на то, что удельное энергопотребление на этом рационе было, во всяком случае, не больше, чем в остальных группах (см. рис. 1). Явные признаки заболеваемости и летальность отсутствовали на протяжении всего периода эксперимента у всех животных.
Обзорное патологоанатомическое исследование внутренних органов показало наличие жировой дистрофии печени крыс и мышей, наиболее выраженной в 5-х и 6-х группах, получавших добавку холестерина.
Определение относительной массы внутренних органов крыс и мышей (табл. 2) выявило достоверное повышение массы печени у крыс и мышей всех групп, получавших фруктозу (3-и, 4-е и 6-е) по сравнению
с контрольной группой. У крыс группы 6а, получавших добавки холестерина и фруктозы, и мышей группы 4б, получавших высокожировой рацион с фруктозой, увеличение массы печени было наиболее выражено. Относительная масса почек была достоверно повышена в обеих группах крыс, получавших фруктозу (3а, 4а); в отличие от этого у мышей выявлено снижение массы почек на рационе с избытком жира (группа 2б). Масса головного мозга мышей достоверно повышалась в результате приема ими добавки холестерина и фруктозы (группа 6б); для группы 5б (холестерин) это изменение было на уровне тенденции. При этом у крыс прием холестерина не вызывал изменения массы мозга в сравнении с контрольной группой. Масса жировых депо, охарактеризованная для общего, забрюшинного жира, а также подкожно-пахового и брыжеечного жира (данные не показаны) достоверно не отличалась от контроля во всех опытных группах крыс и мышей. Однако для обоих видов животных отмечалось снижение размеров жировых депо на рационе с избытком фруктозы и холестерина (6-е группы) в сравнении с избытком жира (2-е группы).
Для остальных изученных органов (селезенка, сердце, легкие, тимус) при сравнении опытных групп между собой был выявлен ряд разнонаправленных изменений, обсуждение которых не входит в задачи настоящей статьи (данные не показаны).
Показатели липидного и углеводного обмена
Как следует из данных табл. 3, у крыс потребление рационов с холестерином (группы 5а, 6а) вызывало достоверное и многократное повышение уровня общего холестерина и ЛПНП и достоверное снижение уровня ЛПВП. Индекс атерогенности (ЛПНП/ЛПВП) возрастал в этих группах соответственно в 5,5 и 7,4 раза по сравнению с контролем. При потреблении высокожирового рациона статистически значимые изменения в показателях липопротеинов отсутствовали. Добавка фруктозы в группах 3а и 4а оказывала эффект, противоположный холестерину - индекс атерогенности был снижен в 1,5 и 1,4 раза по сравнению с контрольной группой (1а)
Таблица 2. Относительная масса органов и тканей животных 1-6-й групп на 62-е сутки эксперимента (% от массы тела, М±т, п=8)
Орган, ткань Вид Группа животных
1 а/б 2а/б 3а/б 4а/б 5а/б 6а/б
Печень Крысы 3,31±0,143, 4, 6 3,59±0,106 3,76±0,141. 6 3,73±0,101. 6 3,67±0,146 4,32±0,131-5
Мыши 3,82±0,173, 4, 6 3,96±0,183, 4 4,47±0,14125 4,51±0,091. 2. 5 3,71 ±0,214, 6 4,33±0,191. 5
Почки Крысы 0,627±0,0313, 4 0,681 ±0,026 0,705±0,0111 0,719±0,0191 0,679±0,021 0,669±0,029
Мыши 1,09±0,062 0,938±0,0341,3, 4, 6 1,07±0,032 1,13±0,032, 5 0,984±0,0384 1,09±0,032
Головной мозг Крысы 0,741 ±0,030 0,713±0,032 0,703±0,0175 0,707±0,041 0,789±0,0353, 6 0,697±0,0245
Мыши 1,56±0,076 1,49±0,095, 6 1,73±0,10 1,65±0,056 1,71 ±0,042 1,83±0,061, 2, 4
Жир забрюшинный Крысы 4,35±0,61 5,31 ±0,395 5,09±0,30 5,97±0,695 3,86±0,60 2-4 4,63±0,47
Мыши 5,00±0,67 5,92±0,613, 4, 6 4,04±0,542 4,03±0,192 4,97±0,456 3,51 ±0,522, 5
Жир общий Крысы 5,75±0,72 6,86±0,505 5,94±0,89 7,34±0,81 4,89±0,695 5,90±0,612. 4
Мыши 6,04±0,77 7,27±0,713, 4,6 5,15±0,522 5,10±0,302 6,13±0,59 4,56±0,482
Пр и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 3 и 5: надстрочные индексы - номера групп, различие с которыми статистически значимо (р<0,05) согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни.
Таблица 3. Биохимические показатели плазмы крови крыс и мышей (М±т, п=8)
Показатель Вид животных Группа
1 а/б 2а/б 3а/б 4а/б 5а/б 6а/б
ЛПВП, ммоль/дм3 Крысы 0,53±0,043, 5, 6 0,63±0,045, 6 0,70±0,041, 5, 6 0,58±0,055, 6 0,17±0,041-4, 6 0,32±0,021,4, 5
Мыши 0,53±0,04 0,60±0,045, 6 0,65±0,065, 6 0,66±0,075, 6 0,40±0,052, 3, 4 0,42±0,042, 4
ЛПНП, ммоль/дм3 Крысы 0,14±0,024, 5, 6 0,18±0,024, 5, 6 0,13±0,025, 6 0,10±0,011, 2, 5, 6 0,81 ±0,211-4 0,61±0,101-4
Мыши 0,18±0,02 0,24±0,09 0,16±0,01 0,17±0,015 0,14±0,014 0,15±0,01
ЛПНП/ЛПВП (индекс атерогенности) Крысы 0,275±0,0053-6 0,308±0,0825, 6 0,183±0,0251, 5, 6 0,193±0,0271, 5, 6 1,510±0,2371-4 2,030±0,3831-4
Мыши 0,349±0,056 0,255±0,045 0,257±0,0316 0,271 ±0,0316 0,359±0,041 0,368±0,0253, 4
Холестерин, ммоль/дм3 Крысы 1,52±0,105, 6 1,579±0,15, 6 1,85±0,145, 6 1,50 ±0,145, 6 6,28±1,081-4 6,32±0,871-4
Мыши 2,20±0,09 2,19±0,16 2,42±0,26 2,16±0,09 2,23±0,19 2,13±0,10
Триглицериды, ммоль/дм3 Крысы 1,20±0,245 0,85±0,243, 5, 6 1,64 ±0,302, 5 1,03 ±0,185, 6 0,64 ±0,11-4, 6 1,81 ±0,251-5
Мыши 0,98±0,125, 6 0,80±0,08 0,70±0,07 0,76±0,05 0,71 ±0,071 0,64±0,091
Глюкоза, ммоль/дм3 Крысы 7,31 ±0,49 8,43±0,495 7,79 ±0,235 8,29±0,475 6,66±0,312-4 7,79 ±0,26
Мыши 9,86±0,51 11,07±0,835 11,35±0,865 9,77±0,545 8,12±0,512, 3, 4, 6 10,11 ±0,465
и в 8,2 и 7,8 раза по сравнению с группой с повышенным содержанием холестерина в рационе (5а) соответственно. Содержание триглицеридов плазмы крови повышалось под влиянием приема фруктозы, что было наиболее заметным на фоне добавки холестерина (из сравнения 5-й и 6-й групп).
У мышей наблюдалось снижение содержания ЛПВП в плазме крови в группах, потреблявших высокохолестериновый рацион (5б, 6б), однако выраженность этого эффекта в сравнении с крысами была незначительной. Достоверных изменений в уровне ЛПНП и общего холестерина в сравнении с контролем не было выявлено ни в одной опытной группе. Индекс атерогенности незначительно возрастал в результате потребления высокохолестеринового рациона только на фоне потребления фруктозы (как следует из сравнения групп 3б и 6б). Уровень триглицеридов достоверно, но незначительно по абсолютной величине снижался в группах 5б и 6б, потреблявших холестерин.
Как у крыс, так и у мышей отмечалось выраженное снижение уровня глюкозы в группах 5а и 5б, получавших добавку холестерина (см. табл. 3).
Потребление крысами рациона с увеличенной квотой жира (группа 2а) приводило к умеренному по абсолютной величине (на 36%), но достоверному увеличению накопления общих липидов в печени (рис. 2). Рацион с повышенным содержанием холестерина (группа 5а) резко и достоверно увеличивал этот показатель в 3,6 раза. При этом потребление фруктозы крысами группы 6а приводило к достоверному снижению накопления липидов по сравнению с животными группы 5а, получавшими только добавку холестерина.
Данные, представленные в табл. 4, показывают, что в жирнокислотном составе печени крыс при всех типах экспериментальных рационов наблюдались достоверные изменения по сравнению с контрольной группой. Так, потребление высокожирового рациона приводило к увеличению содержания линолевой кислоты, суммы С20, суммы С22, суммы общих полиненасыщенных
жирных кислот (ПНЖК), ПНЖК ю-6, соотношения ю-6/ ю-3 и снижению уровня С14, С16, С17 кислот. Рацион с фруктозой вызывал увеличение содержания С14, С16:0, С16:1, цис-С18:1 и снижение уровня суммы С20, суммы С22, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот, суммы ПНЖК ю-3 и ю-6. При потреблении добавки холестерина увеличивался уровень С16 и С18:1 жирных кислот, снижался - С15, С18:0, суммы С22, арахидоно-вой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот. Суммарное содержание насыщенных жирных кислот и всех классов ПНЖК снижалось, как можно предположить, вследствие частичного замещения содержащих
18,00 п 16,00-_ 14,00 -
е
^ 12,00-
СЗ
Ю 10,00-
о
0
СЗ
1 8,00-С
з" 6,00 -^
г с
I 4,002,000,0-
1 2 3 4 5 6 Рис. 2. Содержание общих липидов в печени крыс групп 1а-6а
Значения с разными буквенными индексами (а, б, в) различаются статистически значимо (р<0,05) согласно ^критерию Стьюдента и непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни.
в
в
б
а
а
Таблица 4. Содержание отдельных жирных кислот в общих липидах печени крыс групп 1а-6а (% по массе липидов, М±т, п=8)
Жирные кислоты Группа животных
1а 2а 3а 4а 5а 6а
С14:0 0,479±0,043 0,364±0,032* 0,629±0,060* 0,421±0,032 0,554±0,047 1,090±0,085
С15:0+С15:1 0,289±0,010 0,105±0,008 0,268±0,040 0,156±0,021 * 0,236±0,014* 0,269±0,025
16:0 16,8±0,2 15,4±0,6* 19,0±0,9* 15,3±0,6 17,6±0,5 19,4±0,9
16:1 1,70±0,30 0,70±0,07* 3,41 ±0,38* 1,13±0,17 4,07±0,43* 7,58±0,88
С17:0+С17:1 0,600±0,068 0,500±0,019* 0,538±0,050 0,525±0,053 0,425±0,082 0,500±0,078
18:0 20,0±0,8 19,2±1,4 18,4±1,1 20,1 ±1,0 13,3±1,4* 11,3±0,7*
С18:1 ю-9 цис 15,3±0,8 14,4±1,2 20,0±1,5* 16,2±1,0 24,7±2,0* 26,7±0,7*
С18:1 ю-11 цис 2,17±0,09 1,53±0,07* 2,85±0,16* 1,88±0,06* 3,02±0,22* 4,21 ±0,14*
С18:2 ю-6 15,5±0,8 18,9±1,2* 10,6±0,8* 17,5±0,9 16,8±0,7 11,2±0,9*
ЕС20:0-2 0,278±0,015 0,328±0,021 0,139±0,022* 0,298±0,047 0,215±0,032 0,161 ±0,023*
ЕС20:0-3 0,515±0,041 0,759±0,042* 0,569±0,051 0,633±0,029* 0,631 ±0,071 0,956±0,080*
С20:4 ю-6 18,5±0,8 18,2±1,0 16,9±1,1 18,1 ±1,0 13,6±1,4* 11,5±0,8*
ЕС22:0-4 2,65±0,26 4,05±0,53* 2,49±0,18* 2,95±0,40 1,26±0,18* 0,79±0,07*
С22:5 ю-3 0,234±0,014 0,236±0,016 0,170±0,017* 0,221 ±0,009 0,136±0,015* 0,093±0,009*
С22:6 ю-3 2,34±0,17 1,93±0,18 1,88±0,14* 2,26±0,15 1,45±0,13* 1,01±0,10*
Сумма НЖК, % 37,8±0,7 35,8±0,9 38,0±0,9 35,8±0,5* 31,4±1,3* 31,9±0,6*
Сумма ПНЖК, % 37,2±1,0 40,0±0,5* 30,2±1,9* 38,6±0,7 32,7±1,4* 24,5±1,8*
Сумма ПНЖК ю-6, % 34,4±0,8 37,7±0,5* 27,9±1,73* 36,0±0,7 30,9±1,2* 23,3±1,7*
Сумма ПНЖК ю-3, % 2,76±0,21 2,38±0,18 2,29±0,10* 2,64±0,19 1,76±0,18* 1,27±0,11 *
Отношение ю-6/ю-3 12,73±0,85 16,41 ±1,15* 12,30±0,39 13,89±1,06 18,21±1,50* 18,70±1,32*
П р и м е ч а н и е. * - различие с группой 1а (контроль) статистически значимо согласно Ь-критерию Стьюдента и/или непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни, р<0,05.
их липидов холестерином. Соотношение ПНЖК ю-6/ю-3 при потреблении холестерина достоверно возрастало. Потребление фруктозы на фоне высокожирового и высокохолестеринового рациона также оказывало разнонаправленные влияния на состав жирных кислот.
Уровни пептидных гормонов
Как следует из данных, представленных в табл. 5, уровень грелина не отличался от контроля во всех опытных группах мышей и крыс. Однако у мышей прослеживалось снижение содержания этого гормона под действием фруктозы на фоне высокожирового рациона (из сравнения групп 3б и 4б). Аналогичная закономерность у крыс отмечалась только на уровне тенденции. В числе гормонов семейства инкретинов, являющихся ключевыми регуляторами гомеостаза глюкозы [14], уровни GIP у мышей статистически значимо возрастали по сравнению с контролем в группах 3б и 4б, получавших добавку фруктозы, тогда как на содержание GLP-1 фруктоза оказывала такое же воздействие только в сочетании с холестерином (из сравнения групп 3б и 6б). У крыс различия в уровнях этого гормона не выявлены, что указывает на меньшую чувствительность углеводного обмена этих более крупных животных к действию фруктозы. Наименьшая концентрация глю-кагона в плазме крови отмечена у мышей, получавших фруктозу (группа 3б), а у крыс - при сочетании фруктозы с высокожировым рационом (группа 4а). Уровень лептина в опытных группах животных обоих видов статистически значимо не отличался от контроля; при этом
наименьшие (в сравнении с остальными опытными группами) концентрации этого гормона отмечались у крыс, получавших холестерин (группа 5а), а у мышей - холестерин с раствором фруктозы (группа 6б). Содержание РА1-1 во всех группах крыс различалось недостоверно, тогда как у мышей отмечено его выраженное снижение в группах, получавших фруктозу и/или жир (3б и 4б) по сравнению с получавшими холестерин (5б и 6б). Уровни резистина у мышей достоверно снижались при приеме раствора фруктозы только на фоне высокожирового рациона (из сравнения групп 3б и 4б), что совпадает с данными литературы [15].
Обсуждение
При кормлении высокожировыми и высокоуглеводными рационами в организме экспериментальных животных развивается комплексный патофизиологический процесс, в основе которого лежат макрофагальная инфильтрация и воспаление жировой ткани. Следствием этих процессов является нарушение гормональной регуляции чувства голода и насыщения [16, 17], снижение чувствительности клеток ряда органов и тканей к инсулину, влекущее развитие гиперлипидемии, метаболического синдрома и стеатоза печени [1, 18].
У животных с вызванными рационом ожирением, ги-перлипидемией и метаболическим синдромом отмечается изменение в экспрессии большого числа функционально значимых генов, что в значительной степени
соответствует нарушениям углеводного и липидного обмена алиментарного происхождения, наблюдаемым в генетически гетерогенной человеческой популяции, и является объектом диетической коррекции [5, 19-21].
Как показали результаты настоящего исследования, у использованных линий мышей и крыс отмечаются как общие, так и различные по характеру реакции на применяемые алиментарные воздействия. Определение относительных масс внутренних органов показало, что у обоих видов печень наиболее чувствительна к алиментарному дисбалансу, причем нутриентом, оказывающим на этот орган наибольшее воздействие, является фруктоза. Изучение алиментарно-индуцированных изменений транскриптомных и протеомных показателей в ткани печени на данных экспериментальных моделях представляет наибольший интерес с позиции выявления взаимосвязи между нарушениями липидного и углеводного обмена, опосредуемыми, по современным данным, системой печеночного рецептора желчных кислот FXR (фарнезоид-Х-рецептор) [7, 22, 23].
Оценка стандартных показателей липидного обмена в плазме крови показала, что у крыс в сравнении с мышами отмечается значительно более выраженная реакция спектра липопротеидов на алиментарные дисбалансы, в особенности на уровень холестерина рациона. По данным литературы, преобладающей формой липопротеидов у грызунов являются ЛПВП [1, 2], тогда как у человека - ЛПНП. Полученные в настоящей работе данные подтвердили это положение для контрольных крыс и мышей и животных, получавших рационы с разбалансированным содержанием моносахаридов и жира (группы 2, 3, 4а/б). Вместе с тем при потреблении добавки всего 0,5% (по массе рациона) холестерина происходит полное «обращение» профиля липоп-ротеидов у крыс с многократным возрастанием ЛПНП (группа 5а), тогда как для мышей ничего подобного не наблюдается. Последнее согласуется с данными о том, что у мышей ненокаутных линий потребление рациона западного типа с повышенной квотой моно-
и дисахаридов и холестерина не приводит к развитию дислипидемии [1]. Для выяснения механизмов алиментарно-индуцированных нарушений липидного обмена большой интерес представляет выяснение того, какие межвидовые различия в экспрессии генов ключевых регуляторов транспорта и обмена липидов определяют такие расхождения между мышами и крысами в реакции на холестерин.
Резкие изменения в профиле липопротеидов, наблюдаемые у крыс при потреблении рациона с 0,5% холестерина, приводят, как можно предположить, к сдвигам в тканевом транспорте и накоплении липидов, в частности к развитию стеатоза печени, отражением чего стало многократное увеличение содержания липидов в печени крыс 5-й и 6-й групп. В литературе имеются указания на то, что к аналогичным последствиям приводили и такие диетические манипуляции, как кормление крыс рационами, дефицитными по холину и серосодержащим аминокислотам [24].
Выявленные изменения в жирнокислотном составе липидов печени, такие как более чем 2-кратное снижение содержания ПНЖК семейства ю-3 на рационе с добавкой фруктозы и холестерина, могут привести к изменениям в реологических свойствах мембран клеток и опосредованно повлиять на активность мем-бранно-связанных ферментных и транспортных белков. Помимо этого наблюдаемое возрастание отношения ПНЖК ю-6/ю-3 может привести к увеличению продукции провоспалительных простагландинов и лейкотриенов 4-й серии. Это может быть одним из факторов развития хронического воспаления печени и жировой ткани, характерного для алиментарно-индуцированной дислипи-демии, ожирения и метаболического синдрома [18, 25].
Исследованные опытные рационы по-разному влияли на уровни пептидных гормонов, регулирующих углеводно-энергетический обмен, чувство голода и насыщения в группах мышей и крыс. Чувствительность гормонов, являющихся регуляторами углеводного обмена, таких как GLP, глюкагон [14], а также грелина к уровню пот-
Таблица 5. Уровни пептидных гормонов (пг/см3) в плазме крови животных 1-6-й групп на 62-е сутки эксперимента (М±т, п=8)
Показатель Вид животных Группа животных
1 а/б 2а/б 3а/б 4а/б 5а/б 6а/б
Грелин Крысы 2,00±0,46 1,06±0,216 2,18±0,54 1,57±0,22 1,55±0,22 2,25±0,412
Мыши 0,803±0,1763* 1,126±0,268 1,374± 0,2584 0,668±0,1113 0,921 ±0,127* 1,418±0,341
GIP Мыши 0,224±0,0173 4* 0,248±0,018* 0,335±0,0521* 0,325±0,0381 0,309±0,074 0,247±0,017
GLP-1 Крысы 0,727±0,206 0,480±0,104 0,493±0,150 0,470±0,123 0,389±0,103 0,884±0,337
Мыши 0,168±0,021 0,181 ±0,030 0,113±0,0185, 6 0,137±0,018 0,217±0,0363 0,178±0,0163
Глюкагон Крысы 5,56±1,70 4,23±0,92 4,92±1,36 3,51 ±1,026 4,27±1,16 9,55±2,784
Мыши 0,487±0,097 0,509±0,0653 0,288±0,0592, 5, 6 0,460±0,068 0,503±0,0543 0,515±0,0683
Лептин Крысы 4,32±1,39 4,32±0,765 3,22±0,92 4,08±0,825 1,38±0,362, 4, 6 3,68±0,815
Мыши 9,52±3,08 12,21±2,894, 6 6,63±1,506 4,44±1,052 5,81 ±1,186 2,41 ±0,302, 3, 5*
РА1-1 Крысы 0,532±0,118 0,339±0,086 0,441 ±0,164 0,363±0,137 0,430±0,118 0,482±0,179*
Мыши 2,25±0,69 1,89±0,45 1,58±0,175 1,30±0,125, 6 2,81 ±0,473, 4 2,14±0,324*
Резистин Мыши 129±12 129±16 188±264 115±103, 6 142±13 155±164
* - п=6.
ребления фруктозы оказывается значительно большей у мышей по сравнению с крысами, что может быть связано с большей интенсивностью углеводно-энергетического обмена у мышей. Влияние сочетания холестерина и фруктозы на уровни лептина у двух видов имело прямо противоположную направленность. Причины этих различий, связанные, по-видимому, с дифференцированной экспрессией различных ключевых генов метаболизма липидов, углеводов и энергии [1, 2], можно
будет установить после проведения транскриптомного анализа биосубстратов животных, получавших экспериментальные рационы.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО России, задание № 0529-2015-0006 «Поиск новых молекулярных маркеров алиментарно-зависимых заболеваний: геномный и постгеномный анализ».
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболом-ного и протеомного анализа E-mail: apryatin@mail.ru
Мжельская Кристина Владимировна - лаборант-исследователь лаборатории энзимологии питания E-mail: kristik13@yandex.ru
Трусов Никита Вячеславович - научный сотрудник лаборатории энзимологии питания E-mail: nikkitosu@yandex.ru
Балакина Анастасия Станиславовна - младший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания E-mail: balakina.a.s@yandex.ru
Кулакова Светлана Николаевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории мета-боломного и протеомного анализа E-mail: kulakova@ion.ru
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и про-теомного анализа E-mail: jsotoc@mail.ru
Макаренко Мария Андреевна - лаборант-исследователь лаборатории химии пищевых продуктов E-mail: dragon.soul92@rambler.ru
Ригер Николай Александрович - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: rieger_63@mail.ru
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией энзимологии питания, научный руководитель E-mail: tutelyan@ion.ru
Литература
1. Jawien J., Nastalek P., Korbut R. Mouse models of experimental 7. atherosclerosis // J. Physiol. Pharmacol. 2004. Vol. 55, N 3.
P. 503-517.
2. Woods S.C., Seeley R.J., Rushing P.A., D'Alessio D. et al. A controlled high-fat diet induces an obese syndrome in rats // J. Nutr. 2003. 8. Vol. 133, N 4. P. 1081-1087.
3. Nakanishi N., Nakagawa Y., Tokushige N., Aoki N. et al. The up-regulation of microRNA-335 is associated with lipid metabolism in liver and white adipose tissue of genetically obese mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. Vol. 385. P. 492-496.
4. Buettner R., Parhofer K.G., Woenckhaus M., Wrede C.E. et al. 9. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of different fat types // J. Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 36. P. 485-501.
5. Yogalakshmi B., Bhuvaneswari S., Sreeja S., Anuradha C.V. Grape seed proanthocyanidins and metformin act by different mechanisms
to promote insulin signaling in rats fed high calorie diet // J. Cell 10. Commun. Signal. 2014. Vol. 8. P. 13-22. 11.
6. Siddiqui R.A., Xu Z., Harvey K.A., Pavlina T.M. et al. Comparative study of the modulation of fructose/sucrose-induced hepatic 12. steatosis by mixed lipid formulations varying in unsaturated fatty
acid content // Nutr. Metab. 2015. Vol. 12. P. 41. doi: 10.1186/s12986- 13. 015-0038-x
Glastras S.J., Wong M.G., Chen H., Zhang J. et al. FXR expression is associated with dysregulated glucose and lipid levels in the offspring kidney induced by maternal obesity // Nutr. Metab. 2015. Vol. 12. P. 40.
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8 the ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Re-search (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.
Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. 1993. Vol. 123, N 11. P. 19391951.
Кейтс М. Техника липидологии. М. : Мир, 1975. Гл. 3. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В. и др. Препаративная биохимия липидов. М. : Наука, 1981. 259 с.
IUPAC 2.301, 2.302 «Standard methods for the analysis of oils, fats and derivatives». Oxford : Pergamon Press, 1979. Руководство по методам контроля качества и безопасности БАД к пище Р. 4.1.1672-03. М. : МЗ России, 2004.
14. Kim W., Egan J.M.. The role of incretins in glucose homeostasis and diabetes treatment // Pharmacol. Rev. 2008. Vol. 60, N 4. P. 470-512. doi: 10.1124/pr.108.000604.
15. Nowacka-Woszuk J., Pruszynska-Oszmalek E., Szydlowski M., Sadkowski S. et al. Diet-induced variability of the resistin gene (Retn) transcript level and methylation profile in rats // BMC Genet. 2015. Vol. 16. P. 113.
16. Cheung W.W., Mao P. Recent advances inobesity: genetics and beyond // ISRN Endocrinol. 2012. Article ID 536905. 11 p. doi: 10.5402/2012/536905.
17. Margetic S., Gazzola C., Pegg G.G., Hill R.A. Leptin: a review of its peripheral actions and interactions // Int. J. Obes. 2002. Vol. 26, N 11. P. 1407-1433.
18. Kim Y., Park T. DNA microarrays to define and search for genes associated with obesity // Biotechnol. J. 2010. Vol. 5. P. 99-112.
19. Cordero P., Gomez-Uriz A.M., Campion J., Milagro F.I. et al. Dietary supplementation with methyl donors reduces fatty liver and modifies the fatty acid synthase DNA methylation profile in rats fed an obesogenic diet // Genes Nutr. 2013. Vol. 8. P. 105-113. doi: 10.1007/ s12263-012-0300
20. Park D.-Y., Ahn Y.-T., Huh C.-S., McGregor R.A. et al. Dual probiotic strains suppress high fructose-induced metabolic syndrome // World J. Gastroenterol. 2013. Vol. 19, N 2. P. 274-283.
21. Al-Rejaie S.S., Abuohashish H.M., Alkhamees O.A., Aleisa A.M. et al. Gender difference following high cholesterol diet induced renal injury and the protective role of rutin and ascorbic acid combination in Wistar albino rats // Lipids Health Dis. 2012. Vol. 11. P. 41.
22. Jiao Y., Lu Y., Li X.Y. Farnesoid X receptor: a master regulator of hepatic triglyceride and glucose homeostasis // Acta Pharmacol. Sinica. 2015. Vol. 36, N 1. P. 44-50.
23. Prawitt J., Abdelkarim M., Stroeve J.H.M., Popescu I. et al. Farnesoid X receptor deficiency improves glucose homeostasis in mouse models of obesity // Diabetes. 2011. Vol. 60, N 7. P. 1861-1871.
24. Kucera O., Cervinkova Z. Experimental models of non-alcoholic fatty liver disease in rats // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20, N 26. P. 8364-8376.
25. Kumar M.S., Priyanka J., Prashant M. Microarray evidences the role of pathologic adipose tissue in insulin resistance and their clinical implications // J. Obes. 2011. Article ID 587495. doi:10.1155/2011/587495
References
1. Jawien J., Nastalek P., Korbut R. Mouse models of experimental atherosclerosis. J Physiol Pharmacol. 2004; Vol. 55 (3): 503-17.
2. Woods S.C., Seeley R.J., Rushing P.A., D'Alessio D., et al. A controlled high-fat diet induces an obese syndrome in rats. J Nutr. 2003; Vol. 133 (4): 1081-7.
3. Nakanishi N., Nakagawa Y., Tokushige N., Aoki N., et al. The up-regulation of microRNA-335 is associated with lipid metabolism in liver and white adipose tissue of genetically obese mice. Biochem Biophys Res Commun. 2009; Vol. 385: 492-6.
4. Buettner R., Parhofer K.G., Woenckhaus M., Wrede C.E., et al. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of different fat types. J Mol Endocrinol. 2006; Vol. 36: 485-501.
5. Yogalakshmi B., Bhuvaneswari S., Sreeja S., Anuradha C.V. Grape seed proanthocyanidins and metformin act by different mechanisms to promote insulin signaling in rats fed high calorie diet. J Cell Commun Signal. 2014; Vol. 8: 13-22.
6. Siddiqui R.A., Xu Z., Harvey K.A., Pavlina T.M., et al. Comparative study of the modulation of fructose/sucrose-induced hepatic steatosis by mixed lipid formulations varying in unsaturated fatty acid content. Nutr Metab. 2015; Vol. 12: 41. doi: 10.1186/s12986-015-0038-x
7. Glastras S.J., Wong M.G., Chen H., Zhang J., et al. FXR expression is associated with dysregulated glucose and lipid levels in the offspring kidney induced by maternal obesity. Nutr Metab. 2015; Vol. 12: 40.
8. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8 the ed. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Re-search (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the nationalacademies. Washington: The National Academies Press, 2011: 248 p.
9. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 1993; Vol. 123 (11): 1939-51.
10. Kates M. Techniques of lipidology. Moscow: Mir, 1972. Ch. 3. (in Russian)
11. Bergelson L.D., Gyatlovitskaya E.V. Preparative biochemistry of lipids. Moscow: Nauka, 1981. 259 p. (in Russian)
12. IUPAC 2.301, 2.302 «Standard methods for the analysis of oils, fats and derivatives». Oxford : Pergamon Press, 1979.
13. Guidelines on food supplements safety and quality control methods (R 4.1.1672-03). Moscow: MZ RF, 2004. (in Russian)
14. Kim W., Egan J.M.. The role of incretins in glucose homeostasis and diabetes treatment. Pharmacol Rev. 2008; Vol. 60 (4): 470-512. doi: 10.1124/pr.108.000604.
15. Nowacka-Woszuk J., Pruszynska-Oszmalek E., Szydlowski M., Sad-kowski S., et al. Diet-induced variability of the resistin gene (Retn) transcript level and methylation profile in rats. BMC Genet. 2015; Vol. 16: 113.
16. Cheung W.W., Mao P. Recent advances inobesity: genetics and beyond. ISRN Endocrinol. 2012. Article ID 536905: 11 p. doi: 10.5402/2012/536905.
17. Margetic S., Gazzola C., Pegg G.G., Hill R.A. Leptin: a review of its peripheral actions and interactions. Int J Obes. 2002; Vol. 26 (11): 1407-33.
18. Kim Y., Park T. DNA microarrays to define and search for genes associated with obesity. Biotechnol J. 2010; Vol. 5: 99-112.
19. Cordero P., Gomez-Uriz A.M., Campion J., Milagro F.I., et al. Dietary supplementation with methyl donors reduces fatty liver and modifies the fatty acid synthase DNA methylation profile in rats fed an obe-sogenic diet. Genes Nutr. 2013; Vol. 8: 105-13. doi: 10.1007/s12263-012-0300
20. Park D.-Y., Ahn Y.-T., Huh C.-S., McGregor R.A., et al. Dual probiotic strains suppress high fructose-induced metabolic syndrome. World J Gastroenterol. 2013; Vol. 19 (2): 274-83.
21. Al-Rejaie S.S., Abuohashish H.M., Alkhamees O.A., Aleisa A.M., et al. Gender difference following high cholesterol diet induced renal injury and the protective role of rutin and ascorbic acid combination in Wistar albino rats. Lipids Health Dis. 2012; Vol. 11: 41.
22. Jiao Y., Lu Y., Li X.Y. Farnesoid X receptor: a master regulator of hepatic triglyceride and glucose homeostasis. Acta Pharmacol Sinica. 2015; Vol. 36 (1): 44-50.
23. Prawitt J., Abdelkarim M., Stroeve J.H.M., Popescu I., et al. Farne-soid X receptor deficiency improves glucose homeostasis in mouse models of obesity. Diabetes. 2011; Vol. 60 (7): 1861-71.
24. Kucera O., Cervinkova Z. Experimental models of non-alcoholic fatty liver disease in rats. World J Gastroenterol. 2014; Vol. 20 (26): 8364-76.
25. Kumar M.S., Priyanka J., Prashant M. Microarray evidences the role of pathologic adipose tissue in insulin resistance and their clinical implications. J Obes. 2011. Article ID 587495. doi:10.1155/2011/587495
