CC BY
432
Для корреспонденции
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-92 E-mail: [email protected]
С.А. Апрятин, О.А. Вржесинская, Н.А. Бекетова, О.В. Кошелева, П.В. Кудан, А.Д. Евстратова, В.М. Коденцова, И.В. Гмошинский
Показатели обеспеченности витаминами при экспериментальной алиментарной гиперлипидемии у грызунов
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Крысы и мыши различных линий используются как модели метаболических нарушений, вызванных потреблением рационов, разбалансированных по содержанию макронутриентов (жира, легкоусвояемых углеводов), а также содержащих повышенные квоты холестерина (ХС). Целью настоящего исследования явилось определение величины и направленности изменений показателей витаминной обеспеченности у крыс и мышей с экспериментальной гиперлипидемией, развивающейся при потреблении рационов с повышенным содержанием жира (ВЖР), фруктозы и холестерина (ХС). Эксперимент проведен на 48растущих самках крысах линии Вистар с исходной массой тела 122 + 12 г и 48 растущих самках мышей линии C57Black/6 с исходной массой тела 18+1 г, которые были разделены на 12 групп по 8 животных в каждой. В течение 63 дней крысы и мыши 1-х групп (контроль) получали сбалансированный полусинтетический рацион (СПР), 2-х групп - ВЖР с содержанием общих жиров 30% от массы сухого корма, 3-х групп - СПР и раствор фруктозы вместо воды, 4-х групп - ВЖР + фруктозу, 5-х групп - СПР с добавкой ХС (0,5% от массы сухого корма), 6-х групп -СПР с ХС и фруктозой. После выведения животных из эксперимента определяли содержание витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (а-токо-ферола) в плазме крови и в печени методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, 25-гидроксихолекальциферола [25(OH)D] в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии, витаминов В1, В2 и окисленных нико-тинамидных коферментов в печени - флуориметрическими методами. При потреблении ВЖР отмечался рост концентрации витамина А в плазме крови крыс на 32% и на 45% в печени мышей, повышение содержания витамина Е на 46% в печени крыс. В отличие от крыс содержание витамина Е в печени мышей, получавших ВЖР, было меньше на 32% по сравнению с контролем. Потребление добавки ХС приводило к повышенному накоплению витамина Е в печени крыс и мышей (уровень а-токоферола соответственно в 2,5 и 1,5 раза выше, чем в контроле). Убедительных свидетельств влияния добавочного количества
Для цитирования: Апрятин С .А., Вржесинская О.А., Бекетова НА., Кошелева О.В., Кудан П.В., Евстратова А.Д. и др. Показатели обеспеченности витаминами при экспериментальной алиментарной гиперлипидемии у грызунов. Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 1. С. 6-16. Статья поступила в редакцию 08.06.2016. Принята в печать 28.12.2016.
For citation: Apryatin S.A., Vrzhesinskaya OA., Beketova N.A., Kosheleva O.V., Kudan P.V., Evstratova A.D., et al. Indicators of vitamins safety in experimental alimentary hyperlipidemia in rodents. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; Vol. 86 (1): 6-16. (in Russian) Received 08.06.2016. Accepted for publication 28.12.2016.
Indicators of vitamins safety in experimental alimentary hyperlipidemia in rodents
S.A. Apryatin, O.A. Vrzhesinskaya, N.A. Beketova, O.V. Kosheleva, P.V. Kudan, A.D. Evstratova, V.M. Kodentsova, I.V. Gmoshinsky
фруктозы на показатели А- и Е-витаминной обеспеченности у крыс и мышей не получено. Добавка фруктозы на фоне ВЖР приводила у крыс к достоверному снижению уровня 25(OH)D по сравнению с приемом ВЖР без фруктозы. Прием фруктозы в сочетании с добавкой ХС достоверно снижал запасы витаминов А и повышал витамина Ев печени крыс и мышей. Уровень 25(OH)D при этом типе рациона был достоверно снижен. Потребление добавки ХС у крыс достоверно снижало содержание никотинамидадениндинуклеотидов и никотинамида-дениндинуклеотидфосфатов в печени на 12%; введение в рацион фруктозы нейтрализовало данное воздействие. Кормление крыс ВЖР привело к достоверному повышению, а введение добавки ХС - к снижению уровня витамина В2 в печени на 12,8 и 28% соответственно. Фруктоза частично нейтрализовала эти эффекты. Таким образом, изменения в соотношении макронутриентов и ХС в рационе крыс и мышей могут приводить к частично видоспецифическим изменениям витаминной обеспеченности, включая развитие в ряде случаев функциональной недостаточности витаминов А, В2, D и никотинамидных коферментов.
Ключевые слова: гиперлипидемия, in vivo модель, крысы, мыши, фруктоза, холестерин, витамин А, витамин Е, витамин D, водорастворимые витамины
Rats and mice of different strains are used as a model of metabolic disturbances, caused by the consumption of diets with unbalanced content of macro-nutrients (fat, carbohydrate), as well as having elevated cholesterol quota. The aim of this study was to determine the magnitude and direction in change of vitamins status indices produced in rats and mice with experimental-mental hyperlipidemia, developing under consumption of high fat diet (HFD), fructose (Fr) and cholesterol (Cho). The experiment was conducted on 48 female growing Wistar rats with initial body weight 122 ±12 g, and 48 female growing C57Black/6 mice with initial body weight 18±1 g, which were divided into 12 groups of 8 animals per group. Within 63 days the rats and mice of the first (control) group received a balanced semi-synthetic (BD), 2nd groups - HFD with 30% of the total fat by weight of dry feed, 3rd groups - BD and Fr solution instead of water, 4th groups - HFD+Fr, 5th groups - BD supplemented with 0.5% Cho by weight of dry food, 6th groups - the same ration and Fr. After removal of animals from the experiment there were determined the content of vitamin A (retinol and retinol palmitate) and E (a-tocopherol) in blood plasma and liver by HPLC, 25-hydroxycholecalciferol [25(OH)D] in blood plasma by HPLC-MS, vitamins B1, B2 and oxidized NAD coenzymes in liver by fluorimetric methods. Consumption of HFD resulted in marked increase in the concentration of vitamin A by 32% and by 45% in rat blood plasma and in the mice liver respectively, elevation of vitamin E level by 46% in the rat liver. Unlike rats, vitamin E in the liver of mice treated with HFD was lower by 32% compared with the control. Cho additive resulted in increased vitamin E accumulation in rat and mice liver (a-tocopherol level was 2.5 u 1.5 fold higher than in control respectively). Convincing evidence wasn't revealed of the impact of the additional Fr on vitamins A and E safety in rats and mice. Consumption of Fr on background of HFD in rats significantly reduced the level of 25(OH)D compared with HFD without Fr. Fr reception in combination with the addition of Cho significantly reduced stores of vitamin A and increased - of vitamin E in the liver of rats and mice. 25(OH)D level for this type of diet was significantly reduced. Cho consumption in rats significantly decreased the content of NAD+NADP in the liver by 12%; the introduction of fructose into the diet neutralized this impact. Feeding rats with HFD resulted in a significant improvement, and uptake of Cho in reduce of vitamin B2 levels in the liver by 12.8 and 28%, respectively. Fr partially neutralized these effects. Thus, changes in the ratio of macronutrients and Cho in the diet of rats and mice may lead to a partially species-specific vitamin sufficiency variations, including in some cases the development of functional deficiency of vitamins A, B2, D and NAD coenzymes.
Keywords: hyperlipidemia, in vivo model, rats, mice, fructose, cholesterol, vitamin A, vitamin E, vitamin D, water-soluble vitamins
Лабораторные животные (крысы, мыши) различных линий используются как модели метаболических нарушений, вызванных потреблением рационов, разба-лансированных по содержанию макронутриентов (жира, легкоусвояемых углеводов), а также содержащих повы-
шенные квоты холестерина (ХС). При этом необходимо иметь в виду, что ряд особенностей липидного обмена у крыс и мышей существенно различается и, соответственно, характер их реакций на изменения пищевого режима специфичен как для обоих видов животных, так
и для отдельных линий в пределах одного вида [1, 2]. Данное обстоятельство следует учитывать при выборе in vivo модели алиментарно-зависимых заболеваний (дислипидемии, атеросклероз, метаболический синдром, диабет и др.), наиболее адекватной этим состояниям у человека, в целях разработки методов их молекулярной диагностики и персонализированной фармакологической и диетической коррекции.
Важным фактором, определяющим поддержание го-меостаза внутренней среды организма и его сопротивляемости неблагоприятным внешним воздействиям, является обеспеченность водо- и жирорастворимыми витаминами. Влияние состава макронутриентов на статус витаминов в организме может осуществляться как непосредственно, за счет модуляции их усвояемости из рациона, так и косвенно, путем воздействия компонентов рациона на процессы метаболизма витаминов на тканевом уровне и их экскреции. В работе, выполненной на крысах, было показано, что рационы как с избыточной, так и с недостаточной квотой жира способны спровоцировать развитие у крыс гиповитаминозных состояний [3]. Вместе с тем воздействие на статус витаминов уровня потребления легкоусвояемых углеводов и избытка ХС изучено недостаточно.
Цель настоящего исследования - определение величины и направленности изменений показателей обеспеченности витаминами А, D, Е, В1 и В2, а также суммарного содержания окисленных форм коферментов никотинамидадениндинуклеотидов (НАД) и никотина-мидадениндинуклеотидфосфатов (НАДФ) с использованием ткани печени и плазмы крови в качестве биосубстратов у крыс и мышей, получающих рационы с повышенным содержанием жира, легкоусвояемого углевода (фруктоза) и ХС.
Материал и методы
Исследования проводили на 48 самках крыс линии Вистар с исходной массой тела 122±12 г и 48 самках мышей линии C57Black/6 с исходной массой тела 18±1 г, полученных из филиала «Столбовая» ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Животных содержали группами по 2 особи в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната на подстилке из опилок при 20-22 °С и режиме освещения 12/12 ч. Работу с животными выполняли в соответствии с [4] и Правилами лабораторной практики (приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708Н).
В начале эксперимента животные были распределены на 12 групп равной численности по 8 особей (крысы: группы 1к, 2к, 3к, 4к, 5к, 6к; мыши: группы 1м, 2м, 3м, 4м, 5м, 6м). Исходная масса тела в группах животных каждого вида не различалась (p>0,05, ANOVA). В течение 63 дней животные 1к и 1м групп (контрольные группы) получали базовый полусинтетический рацион, представляющий собой незначительно модифицирова-ный AIN93 [5], 2к и 2м групп - полусинтетический рацион
с повышенным содержанием жира в виде смеси 1:1 подсолнечного масла и свиного лярда (30% от массы сухого корма) за счет снижения квоты крахмала c сохраненным соотношением микронутриентов (минеральных веществ и витаминов) по массе корма; 3к и 3м групп - базовый рацион с добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды, 4к и 4м групп - полусинтетический рацион с повышенным содержанием жира и добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды, 5к и 5м групп - базовый рацион с добавлением ХС (0,5% по массе сухого корма), 6к и 6м групп - базовый рацион с добавлением ХС и 20% раствора фруктозы вместо воды. Животные получали рационы изначально из расчета 15 г на крысу и 4 г на мышь сухого корма в сутки и воду, очищенную методом обратного осмоса, в режиме свободного доступа. По ходу эксперимента ежедневно определяли массу корма, потребляемого животными, и корректировали объем потребления рационов для достижения изокало-рийности.
Из эксперимента животных выводили на 63-й день путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с добавлением 10% по объему 1% раствора гепарина в стерильном 0,15 М NaCl для отделения плазмы путем центрифугирования. Отбирали печень, которую немедленно охлаждали на льду до температуры 0-2 °С, взвешивали. Образцы ткани печени и плазмы крови анализировали немедленно после их отбора или хранили до исследования при -80 °С.
Собранную плазму крови животных анализировали в день отбора пробы или хранили при -20 °С не более 1 мес. Печень гомогенизировали при температуре +(2-4) °С в 50 мМ трис-HCL буфере (рН 7,4). Содержание витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (а-токоферола) в сыворотке крови и в гомогенате печени крыс определяли методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6, 7].
Содержание в гомогенате печени витамина В1 определяли флуориметрически тиохромным методом, витамина В2 - флуориметрическим титрованием рибофла-винсвязывающим апобелком после проведения кислотно-ферментативного гидролиза [6, 8]. Содержание окисленных никотинамидных коферментов в ТХУ-экстракте печени определяли флуориметрическим методом [6, 9].
Концентрацию 25-гидроксихолекальциферола [25(OH)D] определяли в плазме крови методом ВЭЖХ с использованием хроматографической системы Agilent Technologies 1200 Series (Agilent, США) с масс-спектрометрическим детектором Thermo Scientific Orbitrap Elite ETD, колонки Agilent Eclipse XDB-C8 3.5 um 2.1x100 в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Элю-ировали градиентом смеси ацетонитрил (MeCN) - вода при скорости 0,5 см3/мин и температуре колонки 40 °С. Параметры градиента: от 66 до 100% MeCN за 6,25 мин, 100% MeCN 3,75 мин, от 100 до 66% MeCN за 0,5 мин, 66% MeCN 4,5 мин. Объем вводимой пробы 100 мкл. Параметры детектирования: разрешение 60 000 (при
400 а.е.м.), детектируемый ион 383,310-383,316 а.е.м. (МН+-Н20). При подготовке пробы к 300 мкл плазмы крови добавляли 900 мкл метанола, перемешивали в течение 30 с, выдерживали 30 мин при 4 °С, после чего центрифугировали 15 мин при 16 000д; супернатант отбирали для анализа [10].
Статистическую обработку данных проводили с определением выборочного среднего (М) и стандартной ошибки среднего (т). Достоверность различия групп устанавливали с использованием критерия Стьюдента с поправкой 1_еу1пе на неравенство выборочных дисперсий, однофакторного дисперсионного анализа АЫОУА и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Потребление и показатели обеспеченности жирорастворимыми витаминами
Расчет поступления жирорастворимых витаминов с изокалорийными рационами (табл. 1) свидетельствует, что потребление витамина А (на 61-е сутки опыта) крысами и мышами и витамина D крысами 2-х и 4-х групп было снижено по сравнению с контролем в 2,0-2,1 раза, в то время как потребление этих витаминов животными других групп различалось не более чем на 30%. Это связано с большей энергетической плотностью высокожирового рациона в сравнении с рационами, потребляемыми остальными группами животных в условиях приблизительной изокалорийности.
Потребление витамина Е крысами и мышами всех опытных групп различалось менее значительно, что было обусловлено высоким удельным содержанием этого витамина в растительном масле, входящем в состав рациона животных 2-х и 4-х групп в количестве 15% по массе. В табл. 2, 3 приведены показатели обеспеченности животных витаминами А, D, Е по их удельному содержанию
в плазме крови и печени. Для большей наглядности эти значения представлены в прямоугольной системе координат против величин среднего потребления витаминов соответствующими группами животных (см. рисунок).
Влияние повышенного содержания жира в рационе
Как видно из данных табл. 2 и 4 и рис. а, в, д, увеличение содержания жира в рационе с 10 до 30% (группы 2к и 2м) сопровождалось достоверным ростом концентрации ретинола в плазме крови крыс на 32%, практически не отразилось на содержании ретинола пальмитата в печени крыс, но приводило к достоверному увеличению на 45% содержания последнего в печени мышей, несмотря на сниженный в 2 раза относительно контроля уровень потребления данного витамина. В целом полученные данные свидетельствуют о повышении усвоения витамина А у животных с увеличением содержания жира в рационе. Уровень а-токоферола в плазме крови крыс группы 2к не отличался от контроля, в то время как в печени этих животных содержание витамина Е было выше на 46% (р<0,05) (см. рис. б, г). Аналогичные данные были получены в работах [3, 11] у растущих крыс-самцов, получавших в течение 6 нед корм с повышенным до 30% уровнем жира; при этом ограничения по поступлению энергии с рационом не проводились. В отличие от крыс содержание витамина Е в печени мышей группы 2м (см. рис. е) не только не увеличилось, но было достоверно меньше на 32% по сравнению с контролем (группа 1м).
Содержание 25(0Н^, являющегося маркером обмена и показателем обеспеченности витамином D, в плазме крови крыс, получавших высокожировой рацион, не отличалось от контроля (см. табл. 2).
Влияние повышенного содержания холестерина в рационе
Увеличение содержания ХС в рационе животных групп 5к и 5м не отражалось на уровне ретинола в плазме крови крыс и содержании ретинола пальмитата в пе-
Таблица 1. Расчетное потребление животными жирорастворимых (МЕ на 1 кг массы тела в сутки)
Группа Витамин А Витамин Е Витамин Р3
3 сут 31 сут 61 сут 3 сут 31 сут 61 сут 3 сут 31 сут 61 сут
Крысы
1к 473 404 341 8,6 7,4 6,2 127,6 109,0 91,9
2к 277 224 167 9,6 7,7 5,8 85,5 69,1 51,4
3к 536 337 262 9,7 6,1 4,8 144,3 90,9 70,6
4к 330 195 159 11,4 6,7 5,5 101,9 60,2 49,0
5к 430 378 308 7,8 6,9 5,6 116,8 102,8 83,8
6к 448 356 310 8,2 6,5 5,6 121,7 96,7 84,2
Мыши
1м 636 878 601 11,6 16,1 10,9 - - -
2м 392 393 392 13,6 13,5 13,6 - - -
3м 836 674 517 15,1 12,2 9,5 - - -
4м 437 518 477 15,1 17,8 16,5 - - -
5м 678 870 535 12,3 15,9 9,7 - - -
6м 802 852 607 14,7 15,5 11,0 - - -
80 -|
70-
« 60-
со о_
II 50 4
40-
¿5 30
20
у = -0,082а + 67,39 Я2 = 0,348
{6
100 150 200 250 300 350 400 Витамин А рациона, МЕ на 1 кг массы тела в сутки
а
110-1
1100-ан
90
£ 80 г к
м70 и
Р 60Н
е
С
§ 50-р
е
в- 40-о
^ 3020
у = 5,491х + 24, Я2 = 0,011
Н
4 4,5 5 5,5 6 6,5
Витамин Е рациона, мг на 1 кг массы тела в сутки
26
24
: 22
£20
! 18 116 |14 12 10
у = -0,026х + 25,66 Я2 = 0,301
»6
100 150 200 250 300 350 400 Витамин А рациона, МЕ на 1 кг массы тела в сутки в
2,5-,
2-
¡1,5-
1 -
"0,5-
у = -0,144а- + 1,893 Я2 = 0,016
Ь \
4,5 5 5,5 6 6,5
Витамин Е рациона, мг на 1 кг массы тела в сутки г
Содержание витаминов в биосубстратах животных в зависимости от фактического потребления витаминов А, й, Е: а - витамин А печени (крысы), б - витамин Е печени (крысы), в - витамин А плазмы крови (крысы), г - витамин Е плазмы крови (крысы). По оси абсцисс - фактическое потребление с рационом на 61-й день опыта; по оси ординат - содержание метаболитов в биосубстратах (М±т) в соответствующих единицах
На графиках приведены уравнения линейной регрессии и квадратичные коэффициенты корреляции по Пирсону для представленных значений.
6
4
1
3
6
1
3
1
5
0
4
чени как крыс, так и мышей (см. табл. 2 и 3, см. рис. а, в, д), что свидетельствует об отсутствии влияния ХС на усвоение витамина А. В отличие от витамина А уровень а-токоферола в печени крыс и мышей достоверно увеличивался соответственно в 2,5 и 1,5 раза (см. рис. б, е). Концентрация токоферола в плазме крови крыс изменялась недостоверно (см. рис. г). При этом у крыс группы 5к повышенное накопление токоферола в ткани печени сочеталось со значительным возрастанием содержания
в ней общего жира (16,88% по массе ткани против 4,72% в контроле; данные были представлены в предыдущей статье из данного цикла работ [12]). По-видимому, повышение содержания в печени крыс и мышей групп 5к и 5м токоферола, являющегося антиоксидантом в реакциях перекисного окисления липидов, можно рассматривать как одно из последствий стеатоза печени, развивающегося вследствие потребления высокохолестеринового рациона.
300-,
280г
| 260-I—
- 240-
га
о 220-о_
| 2001 180-Ф
160-
0
1 140-
сь
120100-
у = -0,487х + 462,7 Я2 = 0,891
1
♦ 6
300 350 400 450 500 550 600 650 Витамин А рациона, МЕ на 1 кг массы тела в сутки
110-1
100-
и
ан к т 90-
г
на 80-
г
мк 70-
и
н
:т е 60-
с
л о р 50-
е -а
о к 40-
30-
20-
у = -6,575х + 146,9 Я2 = 0,497
{3
7 9 11 13 15 17 19 Витамин Е рациона, мг на 1 кг массы тела в сутки
д
80,0 и
75,0 -
л 70,0 -
нг 65,0 -
Е
га л 60,0-
□ "Г 55,0 -
о
52 50,0-
45,0 -
40,0-
у = -0,059х + 68,27 Я2 = 0,022
Содержание витаминов в биосубстратах животных в зависимости от фактического потребления витаминов А, й, Е (окончание): д - витамин А печени (мыши), е - витамин Е печени (мыши), ж - витамин й3 в плазме крови (крысы)
40 50 60 70 80 90 100 Витамин й3 рациона, МЕ на 1 кг массы тела в сутки
4
2
3
5
4
6
ж
Как следует из данных табл. 3 и рис. ж, потребление крысами группы 5к повышенных доз ХС значимо не влияло на показатель обеспеченности их витамином D при приблизительно равном его потреблении животными данной группы и контрольной.
Влияние дополнительного потребления фруктозы
При потреблении с водой фруктозы на фоне адекватного содержания жира в рационе уровень витамина А в плазме крови крыс (группа 3к) изменялся недостоверно по сравнению с контролем (см. табл. 2, см. рис. в), а в печени был ниже на 19%, чем в контроле (см. рис. а), в условиях существенно меньшего (приблизительно на 40%) потребления витамина А этими животными. У мышей (группа 3м) содержание ретинола пальмитата в печени не отличалось от контроля (см. рис. д). Добавление в полноценный полусинтетический рацион фруктозы также не
отражалось и на содержании витамина Е в плазме крови крыс и печени крыс и мышей (см. рис. б, г, е). Таким образом, убедительных свидетельств влияния дополнительного введения фруктозы на показатели А- и Е-витаминной обеспеченности у животных не получено.
На фоне рациона с повышенным содержанием жира и потреблении фруктозы с водой (группы животных 4к и 4м) уровень витамина А в плазме и печени крыс и в печени мышей достоверно не отличался от контрольных значений (см. табл. 2, 3, см. рис. а, в, д). Содержание токоферола в печени крыс группы 4к также не отличалось от контроля. Однако у мышей на этом диетическом режиме (группа 4 м, см. табл. 3, см. рис. е) имело место достоверное (на 42%) снижение запасов токоферола, несмотря на то что его потребление было большим, чем у животных контрольной группы (за счет увеличенной квоты растительного масла). Полученный результат, по-видимому, от-
ражает различия в особенностях метаболизма жировой ткани у крыс (преимущественно представленной белым жиром) и мышей (белый и бурый жир).
У крыс группы 4к сочетание в составе диеты добавки фруктозы с повышенной квотой жира приводило к достоверному снижению уровня 25(ОН^ по сравнению с показателем животных группы 2к, не получавших фруктозу. При этом достоверных различий показателя с контролем (группа 1к) в обеих группах не отмечено.
Поступление фруктозы с водой на фоне повышенного уровня ХС в рационе (группа 6к) не влияло на уровень витамина А в плазме крови крыс, но достоверно снижало его запасы в печени, что в целом свидетельствовало об ухудшении А-витаминного статуса крыс при данном рационе как по сравнению с животными группы 5к, так и относительно контроля. В печени мышей группы 6м также наблюдалась тенденция к снижению запасов ретинола пальмитата печени (наиболее заметная в сравнении с группами 3м и 4м, получавшими добавочно фруктозу в отсутствие избытка ХС). Таким образом, в отличие от потребления крысами и мышами 5-х групп ХС на фоне сбалансированного рациона сочетание высокого ХС с добавкой фруктозы у животных 6-х групп приводило к развитию признаков А-витаминной недостаточности у обоих видов.
Принципиально иная зависимость в 6-х группах животных отмечена для уровней токоферола, которые были значительно по абсолютной величине и достоверно повышены в плазме крови крыс, печени крыс и мышей по сравнению с контролем. Как было показано в предыдущей статье данного цикла работ [12], у крыс группы 6к отмечалось по сравнению с контролем возрастание уровня липопротеинов низкой плотности плазмы в 4,1 раза и содержания общих липидов печени в 2,3 раза, что, по-видимому, указывает на развитие выраженной гиперлипидемии и стеатоза печени при
данном пищевом режиме. Можно предположить, что одним из признаков, маркирующих эти неблагоприятные сдвиги, является повышенное накопление токоферола в составе указанных жировых депо.
Как следует из данных табл. 2, сочетание добавки фруктозы с избытком ХС в рационе у крыс группы 6к привело к достоверному снижению уровня циркулирующего в крови 25(ОН^ по сравнению как с контролем (на 22%), так и с уровнем в плазме крови животных группы 3к (на 21%), получавших добавку фруктозы без ХС. Известно, что повышенное потребление фруктозы оказывает незначительное влияние на начальные этапы эндогенного синтеза витамина D в форме 25(ОН^ в печени, но вызывает снижение концентрации в сыворотке крови 1,25-дигидроксивитамина D [1,25(ОН)^] [13], влияя на его синтез в почках, которые повреждаются при избыточном потреблении фруктозы. Таким образом, фруктоза индуцирует функциональный дефицит витамина D [14, 15]. Данное обстоятельство указывает на важную роль нарушения обеспеченности витамином D в развитии вызванных избыточным потреблением легкоусвояемых углеводов алиментарно-зависимых заболеваний. В эпидемиологических исследованиях убедительно установлена ассоциация между недостаточной обеспеченностью организма витамином D и развитием трех взаимовлияющих друг на друга звеньев патологического процесса: окислительного стресса, эндотелиальной дисфункции и воспаления, приводящих к развитию ожирения, гипертензии, дислипидемии, инсулинорезистентности [16].
Потребление и показатели обеспеченности водорастворимыми витаминами
Обсуждая индуцированные диетой изменения в маркерах обеспеченности водорастворимыми витаминами (ниацин, В1 и В2), следует учитывать, что их потребление
Таблица 2. Содержание метаболитов витаминов А, Е и Э в плазме крови и печени крыс на 62-е сутки эксперимента (M±m, п=8)
Метаболит Группа крыс
1 к 2к 3к 4к 5к 6к
Плазма крови
Ретинол, мкг/100 см3 18,5±1,1 24,5±1,71 4-6 22,0±1,34-6 17,8±1,62, 3 15,0±2,12, 3 15,4±1,22, 3
а-Токоферол, мг/100 см3 0,75±0,10 0,71 ±0,073, 5, 6 1,06±0,102, 4 0,72±0,053, 5, 6 1,190,182, 4 2,10±0,391, 2, 4
25(ОН)Э3, нг/смз 69,1 ±8,56 72,4±4,24, 6 68,5±7,36 58,4±3,02 61,9±7,5 53,9±6,71, 2, 3
Печень
Ретинола пальмитат, мкг РЭ/г 52,4±5,1 58,9±4,63 42,2±4,31, 2, 4, 6 53,2±3,73, 5 41,3±4,32 28,7±1,71-5
а-Токоферол, мкг/г 36,1 ±3,5 52,63,51, 3-5 37,7±4,92, 5, 6 37,2±2,82, 5, 6 90,5±10,31-4 78,9±11,31, 3, 4
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 3, 4: надстрочные индексы - номера групп, различие с которыми статистически значимо (р<0,05, непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни).
Таблица 3. Содержание пальмитата ретинола и а-токоферола в печени мышей на 62-е сутки эксперимента (M±m, п=8)
Метаболит Группа животных
1м 2м 3м 4м 5м 6м
Ретинола пальмитат, мкг РЭ на 1 г печени 191±22 276±171, 3, 5, 6 196±62, 6 239±186 191±192 158±22-4
а-Токоферол, мкг на 1 г печени 69,6±7,2 47,6±4,71, 5, 6 58,8±3,64-6 40,2±3,21, 3, 5, 6 101,2±6,21-4 96,4±6,21-4
Таблица 4. Содержание водорастворимых витаминов в печени крыс на 62-е сутки эксперимента (M±m, n=8)
Показатель Группа животных
1 к 2к 3к 4к 5к 6к
Удельное содержание, мкг/г
Окисленные никотинамидные коферменты 456±155 403±213 507±212, 5 452±165 399±181, 3, 4 443±25
Витамин В2 28,8±1,12, 5, 6 32,5±1,21, 3-6 28,6±1,12, 5, 6 27,7±1,32, 5, 6 20,7±2,71-4 23,4±0,81-4
Витамин В! 5,95±1,63 (n=3) 4,51 ±0,30 (n=6) 4,16±0,93 (n=8) 4,77±0,95 (n=7) 5,49±1,89 (n=7) 4,67±1,34 (n=5)
Содержание в целой печени, мкг
Окисленные никотинамидные коферменты 3726±306 3871 ±314 5171±3921 4566±3451 3374±2316 5166±3241, 5
Витамин В2 232,6±16,42, 5 314±281, 3-6 289,4±16,9 281,2±24,9 172,5±22,714, 6 276,7±19,15
Витамин В! 38,7±8,05, 6 (n=3) 42,6±3,2 (n=6) 43,6±10,9 (n=8) 44,5±7,7 (n=7) 48,2±17,51 (n=7) 55,7±11,61 (n=5)
в составе рациона у наименее обеспеченных ими крыс (группы 2к и 4к) находилось вместе с тем на уровне адекватного обеспечения потребности, поэтому дальнейшее увеличение размера их потребления в остальных группах само по себе не должно было привести к значимому увеличению их накопления в биосубстратах [17].
Как известно, никотинамидные коферменты участвуют в окислительно-восстановительных реакциях энергетического метаболизма. Как следует из данных табл. 4, содержание крыс группы 2к на высокожировом рационе в течение 62 сут сопровождалось тенденцией (р=0,057) к снижению содержания суммарных окисленных форм (НАД и НАДФ) в печени на 11,6% по сравнению с контролем. Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов о снижении уровня НАД+ в печени мышей, получавших высокожировой рацион [18]. Введение в сбалансированную диету фруктозы оказало противоположный эффект: содержание НАД+НАДФ в печени имело тенденцию (р=0,076) к повышению на 11,2%, что подтверждается факторным анализом (р<0,05, АЫОУА, по фактору фруктоза). Сочетанное воздействие высокожирового рациона и введения в него фруктозы привело к взаимной нейтрализации этих возможных эффектов.
Потребление крысами рациона, содержащего 0,5% ХС (группа 5к), привело к достоверному снижению содержания НАД+НАДФ в печени на 12%. Такое снижение у крыс 5к группы коррелирует с предполагаемым развитием при этом пищевом режиме жировой дистрофии печени (что потверждается вышеуказанным многократным увеличением накопления общих липидов). Предполагается, что воспаление и/или окислительный стресс, вызванный гепатостеатозом, является причиной уменьшения активности никотинамидфосфорибозилтрансферазы -скорость лимитирующего фермента биосинтеза НАД+ у млекопитающих [19]. Таким образом, снижение содержания НАД+НАДФ является неблагоприятным маркером, поскольку известно, что увеличение содержания НАД+ на клеточном уровне имеет положительный эффект, предотвращая развитие ожирения [20, 21],
метаболического синдрома и сахарного диабета типа 2 [20-22]. При этом введение в высокохолестериновый рацион крыс фруктозы (группа 6к) нейтрализовало данное воздействие: уровень окисленных никотинамидных коферментов в расчете на 1 г ткани не отличался от контроля, хотя за счет увеличения массы печени в пересчете на целый орган (см. табл. 4) он превышал таковой у контрольных животных на 38,6%.
Рибофлавин в форме коферментов (флавинаденинди-нуклеотид, флавинмононуклеотид) участвует в разнообразных окислительно-восстановительных реакциях метаболизма. Как показано в табл. 4, добавление фруктозы в рацион крыс группы 3к не оказало влияния на общее содержание витамина В2 в печени. Ранее в 42-дневном эксперименте на растущих крысах Вистар с исходной массой тела 80-100 г было показано, что повышение содержания жиров (лярд и подсолнечное масло в соотношении 1:1) в полусинтетическом рационе до 31% не изменяло содержание витаминов В1 и В2 в печени крыс [3]. В данном более длительном эксперименте кормление взрослых крыс группы 2к высокожировым рационом привело к достоверному повышению уровня этого витамина в печени на 12,8% по сравнению с контрольной группой. Замена питьевой воды раствором фруктозы на фоне высокожирового рациона приводила к отмене эффекта жира в отношении удельного содержания витамина В2 в печени.
Введение ХС в диету крыс групп 5к и 6к вызывало достоверное снижение концентрации витамина В2 в печени на 28 и 19% соответственно, что может рассматриваться как признак снижения метаболической активности ткани в условиях вызванного диетой жирового гепатоза. Добавление фруктозы на фоне избыточного ХС способствовало только незначительному снижению этого неблагоприятного эффекта (что было заметно только по общему, но не удельному содержанию витамина в органе).
Достоверных изменений содержания в печени витамина В1, играющего значительную роль в углеводно-энергетическом обмене, в данной серии опытов выявлено не было (см. табл. 4).
Заключение
Анализ полученных данных показывает, что различные изменения пищевого режима у крыс и мышей в ряде случаев приводят к значимым и отчасти видоспеци-фичным изменениям витаминной обеспеченности. Так, в случае витамина А (характеризуемого содержанием его метаболитов в плазме крови и печени) фактором, способствующим возрастанию показателей его обеспеченности у обоих видов животных, является увеличение доли общего жира в рационе, что достаточно просто объясняется повышением биодоступности этого витамина под действием пищевого жира [23]. При этом диетическим режимом, ухудшающим показатели статуса витамина А как у крыс, так и у мышей, является сочетание повышенного потребления ХС и фруктозы, что может рассматриваться как следствие негативного действия диеты такого типа на печень. ХС рациона в сочетании с добавкой фруктозы оказывал также неблагоприятное влияние на показатели обеспеченности витамином D. В случае витамина Е его уровни в плазме крови крыс, печени крыс и мышей, напротив, значительно возрастали на фоне высокохолестериновых рационов симбатно уровню липидемии и накоплению общего жира в ткани печени. Влияние жира рациона на содержание токоферола в печени было существенным только у крыс, но не у мышей, у которых в отличие от крыс при этом происходит преимущественное накопление бурого жира, менее склонного к депонированию токоферолов в отличие от белой жировой ткани.
Сведения об авторах
Различие в направленности изменений показателей статуса витаминов А и D, с одной стороны, и Е - с другой, по-видимому, может объясняться тем, что первые два витамина представлены в организме преимущественно комплексами с их транспортными и эффек-торными белками, на экспрессию которых изменение состава рациона способно оказывать специфическое разнонаправленное действие. Накопление витамина Е, напротив, сопряжено по преимуществу с жировыми депо (липопротеины плазмы, жировые вакуоли адипоцитов и гепатоцитов), в которых он выполняет функцию антиоксиданта, поэтому не вызывает удивления повышение накопления этого витамина в печени и плазме крови на высокохолестериновых рационах.
Что же касается водорастворимых витаминов, таких как ниацин и рибофлавин, биодоступность и бионакопление которых, как следует из полученных данных, не являются мишенями воздействия изучаемых диет, основную роль в нарушении их статуса играет, по-видимому, общее снижение метаболической активности в тканях на фоне нарушений липидного обмена, вызванных потреблением крысами высокохолестериновых рационов.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО России, задание № 0529-2015-0006 «Поиск новых молекулярных маркеров алиментарно-зависимых заболеваний: геномный и постгеномный анализ».
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва): Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболом-ного и протеомного анализа E-mail: [email protected]
Вржесинская Оксана Александровна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Бекетова Нина Алексеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Кошелева Ольга Васильевна - научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Кудан Павел Валерьевич - научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нано-
технологий
E-mail: [email protected]
Евстратова Анна Дмитриевна - лаборант-исследователь лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности
нанотехнологий
E-mail: [email protected]
Коденцова Вера Митрофановна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: [email protected]
Литература
1. Jawien J., Nastalek P., Korbut R. Mouse models of experimental 12. atherosclerosis// J. Physiol. Pharmacol. 2004. Vol. 55, N 3. P. 503517.
2. Woods S.C., Seeley R.J., Rushing P.A., D'Alessio D., Tso P. A controlled high-fat diet induces an obese syndrome in rats// J. Nutr. 13. 2003. Vol. 133, N 4. P. 1081-1087.
3. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Кошелева О.В., Гусева Г.В., Трусов Н.В. Влияние содержания жира в рационе на обеспеченность крыс витаминами // Вопр. питания. 2012. Т. 81, 14. № 3. С. 52-57.
4. Guide for the care and use of laboratory animals. 8 the ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use
of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research 15. (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.
5. Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements 16. metabolism in rodents // Trace Elements in Laboratory Rodents /
ed. R.R. Watson. New York, etc : CRC Press, 2000.
6. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Методы оцен- 17. ки витаминной обеспеченности населения : учебно-методическое пособие. М. : ПКЦ Альтекс, 2001. 68 с.
7. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов 18. в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1993. Т. 62. № 1. С. 43-48.
8. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. 19. М. : Брандес-Медицина, 1998. 340 с.
9. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Сокольников А.А. Определение 1-метилникотинамида и никотиновых коферментов в био- 20. логических средах флуоресцентным методом // Вопр. питания. 1992. Т. 61. № 2. С. 62-67.
10. Rogatsky E., Browne S., Cai M., Jayatillake H., Stein D. Quantitative Analysis of 25-OH Vitamin D Using Supported Liquid Extraction 21. and Liquid Chromatography - Mass Spectrometry // J. Chromatogr. Separat. Techniq. 2014. Vol. 5, N 5. P. 224-230. doi:10.4172/2157-7064.1000224.
11. Бекетова Н.А., Кравченко Л.В., Кошелева О.В., Вржесинская О.А., 22. Коденцова В.М. Влияние биологически активных соединений индол-3 карбинола и рутина на обеспеченность крыс витаминами А и Е при различном содержании жира в рационе // Вопр. 23. питания. 2013. Т. 82, № 2. С. 23-30.
Douard V., Patel C., Lee J., Tharabenjasin P., Williams E., Fritton J. C. et al. Chronic high fructose intake reduces serum 1,25 (OH)2D3 levels in calcium-sufficient rodents // PLoS One. 2014. Vol. 9, N 4. Article ID e93611. doi: 10.1371/journal.pone.0093611. Апрятин С.А., Мжельская К.В., Трусов Н.В., Балакина А.С., Кулакова С.Н., Сото Х.С. и др. Сравнительная характеристика in vivo моделей гиперлипидемии у крыс линии Вистар и мышей линии C57BI/6 // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 24-33. Douard V., Asgerally A., Sabbagh Y., Sugiura S., Shapses S.A. et al. Dietary fructose inhibits intestinal calcium absorption and induces vitamin D insufficiency in CKD // J. Am. Soc. Nephrol. 2010. Vol. 21. P. 261-271.
Nakayama T., Kosugi T., Gersch M., Connor T., Sanchez-Lozada L.G. et al. Dietary fructose causes tubulointerstitial injury in the normal rat kidney // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2010. Vol. 298, N 3. P. F712-F720.
Strange R.C., Shipman K.E., Ramachandran S. Metabolic syndrome: a review of the role of vitamin D in mediating susceptibility and outcome // World J. Diabetes. 2015. Vol. 6, N 7. P. 896-911. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Сокольников А.А. Эффективность разных доз витаминов для коррекции полигиповитаминоза у крыс // Бюл. экспер. биол. 2014. Т. 157, № 5. С. 626-629.
Choi S.E., Fu T., Seok S., Kim D.H., Yu E., Lee K.W. et al. Elevated microRNA-34a in obesity reduces NAD+ levels and SIRT1 activity by directly targeting NAMPT // Aging Cell. 2013. Vol. 12, N 6. P. 1062-1072. doi: 10.1111/acel.12135
Stein L.R., Imai S. The dynamic regulation of NAD metabolism in mitochondria // Trends Endocrinol. Metab. 2012. Vol. 23, N 9. P. 420-428.
Barbosa M.T., Soares S.M., Novak C.M., Sinclair D., Levine J.A., Aksoy P. et al. The enzyme CD38 (a NAD glycohydrolase, EC 3.2.2.5) is necessary for the development of diet-induced obesity // FASEB J. 2007. Vol. 21, N 13. P. 3629-3639.
Bai P., Canto C., Oudart H., Brunyanszki A., Cen Y., Thomas C. et al. PARP-1 inhibition increases mitochondrial metabolism through SIRT1 activation // Cell Metab. 2011. Vol. 13, N 4. P. 461-468. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.004.
Yoshino J., Mills K.F., Yoon M.J., Imai S. Nicotinamide mononucleotide, a key НАД(+) intermediate, treats the pathophysiology of diet- and age-induced diabetes in mice // Cell Metab. 2011. Vol. 14, N 4. P. 528-536. Schmolz L., Birringer M., Lorkowski S., Wallert M. Complexity of vitamin E metabolism // World J. Biol. Chem. 2016. Vol. 7, N 1. P. 14-43.
References
Jawien J., Nastalek P., Korbut R. Mouse models of experimental atherosclerosis. J Physiol Pharmacol. 2004; Vol. 55 (3): 503-17.
Woods S.C., Seeley R.J., Rushing P.A., D'Alessio D., Tso P. A controlled high-fat diet induces an obese syndrome in rats. J Nutr. 2003; Vol. 133 (4): 1081-7.
Beketova N.A., Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M., Kosheleva O.V., Guseva G.V., Trusov N.V. Influence of dietary fat content on vitamins safety in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2012; Vol. 81 (3): 52-7. (in Russian)
Guide for the care and use of laboratory animals. 8 the ed. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011: 248 p.
Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements metabolism in rodents. Trace Elements in Laboratory Rodents. Ed. R.R. Watson. New York, etc : CRC Press, 2000.
10.
Spirichev V.B., Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A. Methoda of estimation of vitamins safety in population: Training Toolkit. Moscow: PKC Al'tex, 2001: 68 p. (in Russian) Yakushina L.M., Beketova N.A., Bender E.D., Kharitonchik L.A. Use of HPLC for vitamins determination in biological liquids and foods. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 1993; Vol. 62 (1): 43-8. (in Russian)
Guidelines on food quality and safety analysis. Edited by I.M. Skurikhin, V.A. Tutelyan. Moscow: Brandes-Meditsina, 1998: 340 p. (in Russian)
Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Sokolnikov A.A. 1-methyl-nicotinamide and nicotinic coenzymes measurement in biological media by fluorescent method. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 1992; Vol. 61 (2): 62-7. (in Russian) Rogatsky E., Browne S., Cai M., Jayatillake H., Stein D. Quantitative Analysis of 25-OH Vitamin D Using Supported Liquid Extraction and Liquid Chromatography - Mass Spectrometry. J Chromatogr Separat Techniq. 2014; Vol. 5 (5): 224-30. doi:10.4172/2157-7064.1000224.
1.
6.
2
7
3.
8.
9
5
11. Beketova N.A., Kravchenko L.V., Kosheleva O.V., Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M. Influence of biologically active substances indol-3-karbinol and rutin on A- and E- vitamins safety in rats with different level of dietary fat. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2013; Vol. 82 (2): 23-30. (in Russian)
12. Douard V., Patel C., Lee J., Tharabenjasin P., Williams E., Fritton J.C. et al. Chronic high fructose intake reduces serum 1,25 (OH)2D3 levels in calcium-sufficient rodents. PLoS One. 2014; Vol. 9 (4). Article ID e93611. doi: 10.1371/journal.pone.0093611.
13. Apryatin S.A., Mzhelskaya K.V., Trusov N.V., Balakina A.S., Kula-kova S.N., Soto H.S., et al. Comparative characteristics of in vivo models of hyperlipidemia in Wistar rats and C57Bl / 6 mice. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; Vol. 85 (6): 24-33. (in Russian)
14. Douard V., Asgerally A., Sabbagh Y., Sugiura S., Shapses S.A., et al. Dietary fructose inhibits intestinal calcium absorption and induces vitamin D insufficiency in CKD. J Am Soc Nephrol. 2010; Vol. 21: 261-71.
15. Nakayama T., Kosugi T., Gersch M., Connor T., Sanchez-Lozada L.G., et al. Dietary fructose causes tubulointerstitial injury in the normal rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2010; Vol. 298 (3): F712-20.
16. Strange R.C., Shipman K.E., Ramachandran S. Metabolic syndrome: a review of the role of vitamin D in mediating susceptibility and outcome. World J Diabetes. 2015; Vol. 6 (7): 896-911.
17. Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Beketova N.A., Kosheleva O.V., et al. Efficiency of different doses of vitamins for vitamins defi-
ciency correction in rat. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2014; Vol. 157 (5): 626-9. (in Russian)
18. Choi S.E., Fu T., Seok S., Kim D.H., Yu E., Lee K.W., et al. Elevated microRNA-34a in obesity reduces NAD+ levels and SIRT1 activity by directly targeting NAMPT. Aging Cell. 2013; Vol. 12 (6): 1062-72. doi: 10.1111/acel.12135
19. Stein L.R., Imai S. The dynamic regulation of NAD metabolism in mitochondria. Trends Endocrinol Metab. 2012. Vol. 23 (9): 420-8.
20. Barbosa M.T., Soares S.M., Novak C.M., Sinclair D., Levine J.A., Aksoy P., et al. The enzyme CD38 (a NAD glycohydrolase, EC 3.2.2.5) is necessary for the development of diet-induced obesity. FASEB J. 2007; Vol. 21 (13): 3629-39.
21. Bai P., Canto C., Oudart H., Brunyanszki A., Cen Y., Thomas C., et al. PARP-1 inhibition increases mitochondrial metabolism through SIRT1 activation. Cell Metab. 2011; Vol. 13 (4): 461-468. doi: 10.1016/j.cmet.2011.03.004.
22. Yoshino J., Mills K.F., Yoon M.J., Imai S. Nicotinamide mononucleotide, a key HAD(+) intermediate, treats the pathophysiology of diet-and age-induced diabetes in mice. Cell Metab. 2011; Vol. 14 (4): 528-36.
23. Schmolz L., Birringer M., Lorkowski S., Wallert M. Complexity of vitamin E metabolism. World J Biol Chem. 2016; Vol. 7 (1): 14-43.
