CC BY
1147
Для корреспонденции
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-92 E-mail: apryatin@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6543-7495
Апрятин С.А., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Ригер Н.А., Евстратова В.С., Трусов Н.В., Сото Х.С., Мжельская К.В., Шумакова А.А., Коденцова В.М., Гмошинский И.В.
Влияние В-витаминного дефицита на биохимические, иммунологические показатели и микроэлементный статус крыс и мышей различных линий
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
На разных линиях и гибридах крыс и мышей изучены изменения биохимических, витаминных, микроэлементных и иммунологических маркеров сочетанного алиментарного дефицита витаминов В1, В2, В6. Использовали самок крыс линии Wistar (W) и гибридов F1 Dark AgutixWistar (DAxW), самок мышей линии BALB/c и тетрагибридов DBCB. Животные получали на протяжении 35 сут сбалансированный рацион (контроль) по AIN-93 или аналогичный рацион с исключением витаминов В1, В2, В6 (опытные группы). Определяли содержание в печени витаминов В1 и В2, в плазме крови рибофлавин и экскрецию с мочой тиамина, рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты, а также у крыс - содержание в плазме крови и печени а-токоферола и ретинола, биохимические показатели липидного и азотистого обмена, активность изоформ цитохрома Р450 (CYP) в печени; у мышей - циркулирующие уровни про- и противовоспалительных цитокинов плазмы крови, у животных обоих видов - содержание 16 эссенциальных и токсичных элементов в почках. Судя по показателям обеспеченности витаминами В1, В2 и В6, крысы DAxW в сравнении с W и мыши DBCB в сравнении с BALB/c были более чувствительны к развитию В-витаминного дефицита. У крыс опытных групп наблюдались признаки ухудшения обеспеченности витамином Е по его содержанию в плазме крови и печени, разнонаправленные сдвиги в показателях обеспеченности витамином А, повышение активности изоформы CYP3A (6ß-Tr), снижение концентрации триглицеридов, общего белка и альбуминовой фракции при повышении уровня мочевины. Степень выраженности перечисленных эффектов зависела от выбора линии животных. У мышей В-витаминный дефицит характеризовался повышением концентрации провоспалительных цитокинов TNF-а, IL-10, IL-1ß, IL-6 и снижением уровней IFN-y и IL-17A. В поч-
Для цитирования: Апрятин С.А., Бекетова НА., Вржесинская О.А., Ригер НА., Евстратова ВС., Трусов Н.В., Сото Х.С., Мжельская КВ., Шумакова А.А., Коденцова В.М., Гмошинский И.В. Влияние В-витаминного дефицита на биохимические, иммунологические показатели и микроэлементный статус крыс и мышей различных линий // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 14-24. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10037. Статья поступила в редакцию 27.04.2018. Принята в печать 13.07.2018.
For citation: Apryatin S.A., Beketova N.A., Vrzhesinskaya O.A., Riger N.A., Evstratova V.S., Trusov N.V., Soto J.S., Mzhelskaya K.V., Shumakova A.A., Kodentsova V.M., Gmoshinsky I.V. Effect of B-vitamin deficiency on biochemical, immunologic markers and trace element status of rats and mice of various lines. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 14-24. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10037. (in Russian) Received 27.04.2018. Accepted for publication 13.07.2018.
Effect of B-vitamin deficiency on biochemical, immunologic markers and trace element status of rats and mice of various lines
Apryatin S.A., Beketova N.A., Vrzhesinskaya O.A., Riger N.A., Evstratova V.S., Trusov N.V., Soto J.S., Mzhelskaya K.V., Shumakova A.A., Kodentsova V.M., Gmoshinsky I.V.
ках крыс опытных групп было понижено содержание магния, меди, цинка, хрома и серебра, повышено — цезия. У мышей В-витаминный дефицит приводил к снижению содержания в органе магния, меди, цинка, хрома, селена, кадмия, свинца и избыточному накоплению кобальта и цезия. Ряд выявленных биомаркеров может быть использован в доклинической оценке эффективности новых витаминных комплексов, специализированных продуктов и биологически активных добавок к пище, исследованиях взаимодействия различных витаминов. Ключевые слова: витамины В1, В2, В6, дефицит, крысы, мыши, биомаркеры, цитокины, микроэлементы
Biochemical, vitamin, trace element and immunological changes were searched for the combined nutritional deficiency of vitamins B1, B2, B6 on in vivo models in rats and mice. Female rats of Wistar (W) strain and hybrids of the 1st generation of Dark Aguti and Wistar (DAxW) strains, female mice of BALB/c strain andDBCB tetrahybrids were used in experiment. Animals received for 35 days a balanced diet (control) according to AIN-93 or a similar diet with the exception of vitamins B1, B2, B6 (experimental groups). The content of vitamins B1, B2 in liver, riboflavin blood plasma level and urinary excretion of thiamine, riboflavin and 4-pyridoxic acid were determined, as well as in rats: blood and liver content of a-tocopherol and retinol, blood biochemical indices of lipid and nitrogen metabolism, activity of cytochrome P isoforms-450 (CYP) in liver; in mice: the circulating levels of pro - and anti-inflammatory cytokines of blood plasma, in animals of both species - the content of essential and toxic elements in the kidneys. DAxW rats compared to W and DBCB mice compared to BALB/c were more sensitive to the development of B-vitamin deficiency judging by the B-vitamin status indicators. In the rats of the experimental groups, there were signs of a deterioration in blood and liver levels of vitamin E, multidirectional shifts in vitamin A sufficiency, increased activity of the CYP3A isoform (6^-TG), a decrease in triglycerides, total protein and albumin fraction levels with an increase in urea level. Manifestation degree of these effects depended on the choice of the animal's line. In mice, the B-vitamin deficiency was characterized by an increase in the levels of proinflammatory cytokines TNF-a, IL-10, IL-1fi, IL-6 and a decrease in IFN-y and IL-17A. The content of magnesium, copper, zinc, chromium and silver was lowered, of cesium - was increased in the kidneys of the rats of the experimen-talgroups. In mice, B-vitamin deficiency resulted in diminishment of magnesium, copper, zinc, chromium, selenium, cadmium and lead content, excess accumulation of cobalt and cesium. Some of these biomarkers are supposed to be used in pre-clinical evaluation of the effectiveness of new vitamin complexes, specialized foods and dietary supplements, as well as studies of interactions of various vitamins.
Keywords: vitamins B1, B2, B6, deficiency, rats, mice, biomarkers, cytokines, microelements
Изменения в образе жизни современного человека, проявляющиеся в снижении энерготрат и одновременно уменьшенном потреблении мукомольно-крупя-ных изделий, бобовых, молочных продуктов при избытке рафинированных продуктов, жиров, простых углеводов, приводят к широкому распространению недостаточности витаминов группы В (В1, В2, В6, фолиевой кислоты) во взрослой и детской популяции [1]. К последствиям недостаточности витаминов группы В относятся снижение противоинфекционной резистентности [2, 3], неврологические проблемы [4], нарушения опорно-двигательного аппарата, повышение риска развития аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний [5], нарушения когнитивных функций [6] и др. Своевременное выявление и коррекция В-витаминной недостаточности с помощью адекватных доз поливитаминных комплексов является важной задачей практического здравоохранения. Современный подход к диагностике В-гиповитаминозов наряду с использованием традиционных показателей содержания витаминов в биосубстратах требует исполь-
зования новых кандидатных диагностических маркеров, отражающих изменения в гомеостазе организма. Актуальна также разработка доклинических методов оценки эффективности новых витаминных комплексов, антагонистического или синергического действия различных витаминов между собой, а также их взаимодействия с минеральными веществами, про- и пребиотиками и другими минорными биологически активными компонентами пищи.
Цель настоящей работы - поиск новых биохимических, витаминных, микроэлементных и иммунологических маркеров В-витаминного дефицита в эксперименте на in vivo моделях у крыс и мышей различных линий.
Материал и методы
Дизайн эксперимента. В эксперименте использовали самок крыс линии Wistar (W), самок мышей линии BALB/c, полученных из питомника филиала «Столбо-
вая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», самок крыс гибридов I поколения линий Dark Aguti и Wistar (DAxW) и самок мышей тетрагибридов DBCB (гибрид F2), выведенных авторами самостоятельно в виварии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) путем скрещивания 4 различных инбредных линий мышей (DBA/2J, BALB/c, CBA/lac и C57Black/6J), поступивших из вышеуказанного питомника. Животных содержали по 4 (мыши) или 2 (крысы) особи в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната на подстилке из опилок при температуре 21±1 оС в режиме искусственного освещения 12/12 ч. Работу с животными выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и международными рекомендациями1. Были сформированы по 2 группы животных каждого вида и линии численностью от 6 до 8 особей. Животные 1-х (контрольных) групп получали основной рацион, соответствующий AIN 93 [7], животные 2-х (опытных) групп - такой же рацион, с исключением из витаминной смеси применяемых форм витаминов В1, В2 и В6. Рационы и питьевую воду, очищенную в установке обратного осмоса «Milli-RO» («Waters», США), предоставляли в неограниченных количествах. Общая продолжительность эксперимента составила 35 сут. Выведение животных из эксперимента осуществляли путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с добавлением 10% по объему антикоагулянта - 1% раствора гепарина в стерильном 0,15 М NaCl для отделения плазмы. Отбор органов осуществляли стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали. Органы немедленно охлаждали на льду до температуры 0-2 оС, взвешивали с точностью ±0,01 г на лабораторных электронных весах. Микросомальную фракцию выделяли из гомогената ткани печени методом дифференциального центрифугирования [8]. Все пробы хранили до исследования в банке биологических образцов при температуре -80 оС.
Маркеры витаминной обеспеченности. Содержание в моче тиамина определяли флуориметрически тио-хромным методом [9], рибофлавина - флуориметричес-ким титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком, 4-пиридоксиловой кислоты (4-ПК) - флуориметрическим методом [10]. Аналогично определяли содержание витаминов В1 и В2 в печени после проведения кислотно-ферментативного гидролиза [11]. Концентрации витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (а-токоферола) в сыворотке крови и в гомогенате печени крыс определяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [10, 12] со спектрофлуо-риметрическим детектированием при Хвоз6 = 292, = 330, Хвозб = 325 и Хэм = 380 нм соответственно.
Биохимические и энзиматические маркеры. Биохимические показатели плазмы крови исследовали на
биохимическом анализаторе («Konelab», Финляндия) по стандартным методикам. В микросомальной фракции печени крыс определяли этоксирезоруфиндеалки-лазную активность изоформы CYP1A1 по методу [13] и бр-тестостеронгидроксилазную (бр-ТГ) активность изоформы CYP3A в соответствии с [14].
Мультиплексный иммуноанализ. Для определения уровня цитокинов IFN-y, IL-10, IL-17A, IL-1 в, IL-6 и TNF-a в плазме мышей использовали коммерческий набор Bio-Plex Pro™ Reagent Kit with Flat Bottom Plate, дополняемый реагентами: Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine Standards Group I, 23-Plex, Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine IFN-y Set, Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine IL-10 Set, Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine IL-17A Set, Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine IL-1 p Set, Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine IL-6 Set и Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine TNF-a Set («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Исследования проводили на мультиплексном анализаторе Luminex 200 («Luminex Corporation», США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Элементный состав. Содержание 16 химических элементов (алюминия, бария, ванадия, железа, кадмия, кобальта, магния, марганца, меди, никеля, свинца, селена, серебра, хрома, цезия, цинка) в почках мышей и крыс определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе серии 7700х («Agilent Technologies», Япония). Минерализацию биологических образцов проводили концентрированной азотной кислотой и концентрированной перекисью водорода в соотношении 5:1 в автоматизированной микроволновой системе подготовки проб «TOPWAVE» («Analytic Jena», Германия).
Статистическая обработка результатов включала расчет выборочного среднего, среднеквадратичного отклонения и стандартной ошибки. Достоверность различия выборочных средних устанавливали с помощью f-кри-терия Стьюдента для несвязанных выборок. Гипотезу о несовпадении функций распределения данных в группах проверяли с использованием непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Расчеты выполняли в программе SPSS 20.0. В целях повышения стабильности и сходимости результатов анализа элементного состава биосубстратов предварительно проводили исключение грубых погрешностей (выпадающих результатов измерений) согласно ГОСТ Р 8.736-2011. Число исключаемых значений составляло не более 1-2 в каждой группе образцов.
Результаты и обсуждение
Воспроизводимость модели В-витаминного дефицита у крыс и мышей. В ходе кормления опытными рационами
1 Guide for the care and use of laboratory animals. Eighth Edition / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington: The National Academies Press, 2011; приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 193н «Обутверждении правил надлежащей лабораторной практики».
Экскреция с мочой
Витамин В в печени
60
50
40
30
20
10
W
контроль
Тиамин
DAxW контроль
Рибофлавин
DAxW опыт
4-ПК
6 5 4 3 2 1 0
40 30 20 10 0
40 50 40 30 20 10 0
* *
1
W
DAxW
Витамин В в печени
W DAxW
Рибофлавин в плазме крови
W DAxW
□ Контроль ШОпыт
Г+1
1 *
т
н- —п
* —*—
1
Рис. 1. Показатели обеспеченности витаминами группы В (М±т) крыс контрольных (сбалансированный рацион) и опытных (дефицит витаминов В1, В2, В6) групп
А - экскреция тиамина, рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты с мочой; Б - содержание витамина В± в печени; В - содержание витамина В2 в печени; Г - концентрация рибофлавина в плазме крови; * - статистически значимое отличие (р<0,05) от показателя животных контрольной группы, согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни.
Б
А
В
Г
0
масса потребляемого в сутки корма крысами W статистически значимо снижалась на 10-40% в сравнении с контролем (р<0,05, парный ?-тест Стьюдента) начиная с 3-го дня эксперимента. У крыс DAxW снижение поедае-мости корма было недостоверным (р=0,055). Количество корма, потребляемого мышами DBCB опытной группы, было систематически снижено на 20-30% по сравнению с контролем начиная с 7-х суток опыта (р<0,001), тогда как у мышей ВАЬВ/с различия в поедаемости рациона между опытной и контрольной группами на протяжении опыта были недостоверными (р>0,1).
В результате потребления опытных рационов с исключением витаминов группы В крысы W статистически значимо отставали от контрольных животных в при-
бавке массы тела (214±9 г против 258±12 г; р<0,05, здесь и далее - М±т). Масса тела крыс DAxW не различалась в опытной (201±8 г) и контрольной (207±8 г) группах.
У мышей, получавших дефицитный рацион, снижение массы тела было более значительным. Так, масса тела мышей ВАЬВ/с составила 14,8±0,4 г в опыте против 26,2±0,4 г в контроле (отставание в 1,8 раза, р<0,05), а у тетрагибридов DBCB 18,3±1,0 г против 28,6±1,7 г в контроле (отставание в 1,6 раза, р<0,05).
Для мышей опытных групп была характерна также статистически значимо сниженная общая масса печени ^А!^^ 0,55±0,03 г (опыт) и 1,02±0,027 г (контроль); DBCB: 0,71±0,07 г (опыт) и 0,95±0,05 г (контроль), р<0,05]. Относительная (в % от массы тела) масса печени
у мышей не различалась, а у крыс обеих линий была достоверно, но незначительно по абсолютной величине (на 13-17%) снижена в опытных группах. Других существенных различий в массе внутренних органов не выявлено.
Как следует из данных, приведенных на рис. 1, у крыс, потреблявших опытный рацион, статистически значимо снижалась экскреция с мочой тиамина, в 2,9 и 6,1 раза у W и DAxW соответственно. Отмечалось также достоверное и многократное снижение экскреции рибофлавина (в 2,1 и 7,8 раза) и метаболита пиридоксина, 4-ПК (в 4,5 и 3,8 раза). В печени животных обеих линий достоверно снижалось содержание витамина В1 (в 3,1 и 4,0 раза), а в плазме крови - рибофлавина (в 1,7 и 1,9 раза). У мышей ВА1_Б/с и тетрагибридов DBCB, получавших опытный рацион (рис. 2), снижение экскреции с мочой тиамина было, соответственно, 3,6- и 12,7-кратным, рибофлавина - 1,44- и 14,6-кратным, 4-ПК - 3,2-и 3,4-кратным (р<0,05 во всех случаях). Содержание витамина В1 в печени мышей двух линий снизилось в 5,8 и 5,5 раза, а содержание витамина В2 незначительно по абсолютной величине (на 16 и 24%), но статистически значимо ^<0,05) увеличилось. У крыс содержание витамина В2 в печени достоверно не различалось между опытными и контрольными группами, что согласуется с данными, полученными ранее [15].
Приведенные данные позволяют заключить, что в результате потребления рационов с одновременным исключением витаминов В1, В2 и В6 как у крыс, так и у мышей наблюдалась выраженная недостаточность тиамина, рибофлавина и пиридоксина, причем, судя по амплитуде изменения большинства показателей, более чувствительны к развитию В-витаминного дефицита были крысы DAxW в сравнении с W и мыши DBCB в сравнении с BALB/c. Парадоксальный характер изменения удельного содержания витамина В2 в печени мышей можно объяснить резким снижением массы органа у животных опытных групп, вследствие чего общий запас витамина в печени у них оказался ниже, чем в контроле.
Маркеры обеспеченности жирорастворимыми витаминами у крыс. Показатели обеспеченности витаминами А и Е (табл. 1) в плазме крови и печени крыс двух линий изменялись разнонаправленно. У W в условиях В-витаминного дефицита статистически значимо возрастала концентрация ретинола в плазме крови (что может быть связано с усилением экспрессии ретинол-связывающего белка [16]), тогда как запасы этого витамина в печени не изменялись. У DAxW наблюдалась несколько иная картина: концентрация ретинола в плазме крови снизилась, а запасы в печени возрастали. Аналогичные изменения отмечали у крыс Sprague-Dawley, когда при адекватном потреблении витамина А инфузия рекомбинантного интерлейкина-6 (^-6) человека приводила к снижению синтеза ретинол-связывающего белка, концентрации ретинола в плазме крови и накоплению витамина А в печени [17].
Анализ содержания в биосубстратах крыс а-токо-ферола выявил его снижение в плазме крови у крыс опытных групп обеих линий. Однако с учетом того, что основной транспортной формой токоферолов в плазме крови являются, по-видимому, липопротеины очень низкой плотности [18], уровни циркулирующих липидов и токоферолов взаимосвязаны [19], а содержание основных классов липидов в плазме крови в условиях В-витаминного дефицита также претерпевало определенные изменения (см. ниже), представляло интерес оценить обеспеченность а-токоферолом по показателям его отношения к триглицеридам, холестерину и их сумме. Как следует из данных табл. 1, достоверных различий в отношении а-токоферол/триглицериды не наблюдалось, но отношения а-токоферол/холестерин и а-токоферол/(холестерин + триглицериды) оказались статистически значимо ^<0,05) сниженными у крыс W в состоянии В-витаминного дефицита. Аналогичные изменения у DAxW проявлялись только в виде тенденции ^<0,10). Тем самым отношение а-токоферола к холестерину и его сумме с триглицеридами является, по-видимому, более чувствительным маркером
Таблица 1. Показатели обеспеченности жирорастворимыми витаминами у крыс, М±т
Показатель Группа животных
1-я (п=6) 2-я (п=6) 3-я (п=6) 4-я (п=8)
самки линии Wistar самки гибридов DAxW
контроль дефицит В2, Вб контроль дефицит В2, Вб
Плазма крови
Ретинол, мкг/100 см3 14,7±1,6 17,8±1,4* 14,4±2,0 11,1±0,8*
а-Токоферол, мг/100 см3 0,70±0,06 0,41 ±0,05* 0,63±0,10 0,41 ±0,04*
Отношение а-токоферол/триглицериды, мг/ммольх10-1 0,58±0,05 0,64±0,05 1,16±0,22 0,85±0,11
Отношение а-токоферол/холестерин, мг/ммольх10-1 0,42±0,03 0,26±0,02* 0,28±0,04 0,21 ±0,02
Отношение а-токоферол/(холестерин + триглицериды), мг/ммольх10-1 0,24±0,01 0,18±0,01* 0,23±0,03 0,17±0,01
Печень
Ретинол пальмитат, мкг/г ткани 372±70 371 ±61 362±39 467±41*
а-Токоферол, мкг/г ткани 38,7±4,2 19,2±1,4* 31,3±1,5 23,0±1,0*
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2-5: * - статистически значимое отличие (р<0,05) от показателя животных контрольной группы согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни.
Экскреция с мочой
Витамин В в печени
БМВ/с контроль
ВМВ/с опыт
йВСВ контроль
йВСВ опыт
Тиамин
Рибофлавин
4-ПК
16
12
50 40 30 20 10 0
-1-
* *
ВД1_В/с
йВСВ
Витамин В в печени
ВМВ/с йВСВ
□ Контроль ШОпыт
Рис. 2. Показатели обеспеченности витаминами группы В (М±т) мышей контрольных (сбалансированный рацион) и опытных (дефицит витаминов В1, В2, В6) групп
А - экскреция тиамина, рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты с мочой; Б - содержание витамина В± в печени; В - содержание витамина В2 в печени; * - статистически значимое отличие (р<0,05) от показателя животных контрольной группы, согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни.
Б
А
4
8
3
4
0
3
В
1
0
нарушенной обеспеченности, чем отношение а-токо-ферола к триглицеридам, что согласуется с данными литературы [20].
Содержание токоферола в печени крыс при В-вита-минном дефиците статистически значимо снизилось в 2,0 раза у W и в 1,36 раза у DAxW. С учетом того, что абсолютная масса печени у W опытной группы была снижена всего в 1,38 раза по сравнению с контролем, в сочетании с вышеизложенными данными по концентрации а-токоферола в плазме крови это может указывать на истинное снижение обеспеченности витамином Е у этих животных при В-витаминном дефиците, тогда как в случае DAxW, у которых снижение массы печени составило всего 1,24 раза, такого утверждать нельзя. Отсюда следует, что В-витаминный дефицит, по-видимому, различным образом влияет на обеспеченность жирорастворимыми витаминами у крыс двух линий. W более склонны при этом в сравнении с DAxW к нарушению статуса витамина Е. Этому соответствует
наблюдаемое у DAxW, но не у W статистически значимое возрастание концентрации неэтерифицированного ретинола в печени (см. табл. 1), что может быть связано с повышением у последних активности ферментов, гид-ролизирующих в печени эфиры ретинола, что наблюдается при недостатке витамина Е [21].
Оценка метаболомных и энзиматических маркеров у крыс. Как следует из данных табл. 2, у самок крыс W и DAxW в условиях В-витаминного дефицита наблюдались сходные изменения в липидомных показателях плазмы крови: снизилась концентрация общего холестерина и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (у DAxW - достоверно), повысились концентрация холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и отношение ЛПНП/ЛПВП (у W - достоверно). Снижение уровня триглицеридов у W при В-витаминном дефиците было более чем 2-кратным и статистически значимым ^<0,05), тогда как у DAxW имелась только тенденция. При В-витаминном
Показатель Группы животных
1-я (п=6) 2-я (п=8) 3-я (п=8) 4-я (п=8)
самки линии Wistar самки гибридов DAxW
контроль дефицит В1, В2, В6 контроль дефицит В1, В2, В6
Плазма крови
Холестерин, ммоль/дм3 общий 1,68±0,07 1,59±0,08 2,19±0,11 1,92±0,06*
ЛПВП 1,04±0,05 0,93±0,04 1,34±0,05 1,00±0,06*
ЛПНП 0,377±0,041 0,530±0,056* 0,727±0,066 0,819±0,090
ЛПНП/ЛПВП 0,361 ±0,032 0,565±0,053* 0,545±0,045 0,885±0,16
Триглицериды, ммоль/дм3 1,29±0,21 0,645±0,05* 0,64±0,07 0,50±0,04
АЛТ, МЕ/см3 76,8±7,0 57,4±3,2* 96,6±6,3 56,9±5,2*
АСТ, МЕ/см3 68,8±28,3 70,6±16,3 131,2±17,9 77,6±19,9*
Билирубин общий, ммоль/дм3 11,4±1,1 8,4±0,4* 9,8±0,5 7,8±0,5*
Белок, г/дм3 71,6±1,7 65,3±1,9* 73,5±2,2 68,0±2,2
Альбумины, г/дм3 34,3±0,6 31,1 ±0,9* 35,7±0,9 32,3±0,8*
Мочевина, ммоль/дм3 6,45±0,43 7,94±0,44* 6,69±0,24 6,12±0,29
Печень
CYP1А1 (ЭРОД), пмоль/минхмг белка 4,27±0,42 4,56±0,25 7,38±0,44 7,89±0,30
CYP3А (6р-ТГ), пмоль/минхмг белка 172±13 239±19* 185±6 299±28*
Расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Таблица 2. Биохимические и энзиматические показатели крыс, М±т
дефиците у крыс снизилась концентрация билирубина, общего белка (только у W) и альбуминовой фракции. Возрастание у W концентрации мочевины плазмы крови может указывать на усиление катаболизма белка. Снижение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) (находящейся в пределах интервала нормальных значений для крыс данного пола и возраста) у обеих линий и ас-партатаминотрансферазы (АСТ) (только у DAxW) может быть следствием влияния недостатка витамина В6 на активность этих пиридоксаль-зависимых ферментов.
Новым, не имеющим аналогов в доступной литературе является выявленное повышение активности изоформы цитохрома Р450 CYP3A в микросомальной фракции печени. Данная монооксигеназа со смешанной функцией является одним из ключевых ферментов биосинтеза стероидов и метаболизма токоферолов [22], поэтому повышение его активности при В-витаминном дефиците может сопровождаться усилением катаболизма витамина Е. Существенных воздействий опытных рационов на активность другого фермента суперсемейства Р450, а именно CYP1A1, не выявлено.
Показатели минерального статуса. Как следует из данных табл. 3 и 4, у крыс и мышей, получавших рацион с исключением витаминов группы В, наблюдались определенные различия в микроэлементном статусе по содержанию минеральных веществ в почках. Почки являются репрезентативным органом для изучения микроэлементного гомеостаза, поскольку в их медуллярной зоне экспрессировано большое число белков-транспортеров минеральных веществ [23]. У крыс эти изменения были небольшими по амплитуде (не более 20-40% от исходного уровня) и включали статистически значимое снижение у DAxW опытной группы содержания магния, меди и цинка, у крыс W - меди, хрома и серебра, что, по-
видимому, обусловлено снижением потребления этих элементов с кормом в условиях развившегося В-вита-минного дефицита. Одновременно у крыс обеих линий наблюдали повышение содержания в почках цезия (у крыс DAxW - достоверное, р<0,05).
У мышей выявлено больше различий в минеральном статусе между опытными и контрольными группами. Так, в почках мышей BALB/c при В-витаминном дефиците статистически значимо снизилось содержание магния, меди, хрома, селена, а также токсичных элементов свинца и кадмия, несмотря на то, что различия в поеда-емости корма между животными этой линии из опытной и контрольной группы были статистически незначимыми. У тетрагибридов DBCB В-витаминный дефицит характеризовался статистически значимым снижением содержания в почках магния, меди и цинка.
Содержание кобальта в почках возрастало у мышей BALB/c опытной группы, несмотря на меньшую в сравнении с контролем массу органа. Это же относится к практически 2-кратному возрастанию содержания у животных опытных групп обеих линий цезия - микроэлемента с недостаточно изученной функцией.
Согласованное возрастание у крыс и мышей содержания в почках цезия, в свете имеющихся данных литературы, не может быть удовлетворительно объяснено. Существует предположение, что цезий является токсичным элементом, способным в высоких дозах нарушить обмен калия из-за конкуренции за общие трансмембранные переносчики [24]. Однако более существенным представляется то обстоятельство, что повышенная склонность к биоаккумуляции цезия при В-витаминном дефиците может спровоцировать избыточное накопление в органах радионуклида 137Сэ в экологически неблагополучных по радиационному фону регионах.
Это может предъявить дополнительные требования к обеспечению витаминами группы В населения таких регионов.
Влияние В-витаминного дефицита на уровни цитоки-нов у мышей. Как следует из данных, представленных в табл. 5, развитие В-витаминного дефицита привело к более или менее выраженным изменениям концентрации в плазме крови ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, имеющим одинаковую направленность у мышей обеих линий. Было выявлено снижение медианного уровня !РЫ-у (достоверное у DBCB, в 3,2 раза), возрастание ^-10 (достоверное у DBCB, в 2,2 раза), (статистически значимое
у BALB/c и DBCB, в 5,4 и 2,4 раза соответственно), ^-6 (достоверное у BALB/c, в 2,7 раза), ТЫР-а (статистически значимое у обеих линий, в 6,5 и 2,1 раза соответственно), IL-17A (достоверное у BALB-c, в 6,8 раза).
Цитокины !РЫ-у, ^-10, !ЬШ, !Ыр, ^-6 и ТЫР-а продуцируются, в том числе ТИ17 клетками и играют критическую роль в регуляции воспалительных реакций различного характера [25]. У мышей, получавших дефицитный по витаминам группы В рацион, наблюдались статистически значимое снижение как общей массы тела,
так и печени. Это может свидетельствовать о прогрессирующих дистрофических процессах, сопровождающихся, как правило, вялотекущим воспалением.
При выраженном дефиците витаминов группы В клинические воспалительные проявления быстро приобретают аутоиммунный характер и прямо ассоциированы с активацией Т-клеток различных классов [26]. Было отмечено, что дефицит витамина В1 усиливает CD4+-и CD8+-инфильтрацию и активирует клеточные элементы микроглии в спинном мозге [27]. В свою очередь антигенспецифические CD4+-лимфоциты инициируют и поддерживают воспалительный процесс [28]. Главные продуценты цитокинов среди CD4+-клеток были классифицированы как ТИ1, ТИ2 и ТИ17. Общеизвестно, что эти субпопуляции вовлечены в различные тканеспеци-фические аутоиммунные процессы. Экспрессирующие !РЫ-у Т-клетки выступают в роли инициирующих аутоиммунный воспалительный процесс, что характерно как для нейропатии при дефиците тиамина, так и при системном вялотекущем воспалении на фоне недостаточности витаминов группы В [30]. В дальнейшем происходит поляризация ТИ в ТИ1/ТИ17 и доминирует продукция провоспалительных цитокинов ^-1р, ^-6
Таблица 3. Содержание минеральных веществ в почках крыс, мкг/2 парных органа, M±m
Элемент Группа животных
1-я (п=6) 2-я (п=8) 3-я (п=8) 4-я (п=8)
самки линии Wistar самки гибридов DAxW
контроль дефицит В-,, В2, В6 контроль дефицит В1, В2, Вб
Эссенциальные элементы
Магний 323±15 277±17 275±7 248±9*
Медь 13,1 ±1,2 9,96±0,64* 12,6±0,5 8,34±0,25*
Цинк 40,8±1,6 39,1 ±3,6 41,0±1,1 33,9±1,1*
Хром 0,654±0,080 0,462±0,030* 0,510±0,054 0,0510±0,039
Элементы с неизвестной или недостаточно установленной функцией
Цезий 0,0101 ±0,0014 0,0119±0,0003 0,0056±0,0007 0,0070±0,0003*
Серебро 0,0181 ±0,0045 0,0099±0,0010* 0,0134±0,0029 0,0077±0,0011
Элемент Группа животных
1-я (п=8) 2-я (п=8) 3-я (п=6) 4-я (п=6)
самки линии БАЬБ/о самки тетрагибридов DBCB
контроль дефицит В1, В2, В6 контроль дефицит В1, В2, Вб
Эссенциальные микроэлементы
Магний 77,7±1,5 53,9±1,5* 74,5±4,2 55,4±3,5*
Медь 1,61±0,06 1,20±0,04* 1,71 ±0,07 1,25±0,09*
Цинк 23,4±0,8 24,6±1,6 31,0±1,2 24,0±0,5*
Хром 0,163±0,006 0,138±0,005* 0,156±0,014 0,152±0,010
Кобальт 0,028±0,004 0,067 ±0,003* 0,044±0,004 0,055±0,005
Селен 0,56±0,02 0,040 ±0,02* 0,53±0,02 0,42±0,03
Токсичные элементы
Кадмий 0,0118±0,0004 0,0102±0,0004* 0,0056±0,0004 0,0182±0,0067
Свинец 0,0071 ±0,0009 0,0047±0,0001* 0,0053±0,0013 0,0059±0,0006
Элементы с неизвестной или недостаточно установленной функцией
Цезий 0,0006±0,0001 0,0011 ±0,0001* 0,0006±0,0001 0,0012±0,0001*
Таблица 4. Содержание минеральных веществ в почках мышей, мкг/2 парных органа, M±m
Таблица 5. Концентрация цитокинов в плазме крови мышей, пг/см3, медиана (интервал изменения)
Цитокин, пг/см3 Группа животных
1-я (п=8) 2-я (п=8) 3-я (п=6) 4-я (п=6)
самки линии BALB/c самки тетрагибридов DBCB
контроль дефицит В!, В2, В6 контроль дефицит В!, В2, Вб
IFN-y 0,0028 (0,0004-0,0047) 0,0024 (0,0002-0,0062) 0,0038 (0,0005-0,01) 0,012* (0,0072-0,25)
IL-10 0,016 (0,010-0,031) 0,025 (0,012-0,10) 0,023 (0,018-0,037) 0,051* (0,029-0,19)
IL-17A 0,0082 (0,0033-0,040) 0,056* (0,015-0,22) 0,010 (0,0037-0,020) 0,017 (0,008-0,062)
IL-1 в 0,33 (0,091-0,84) 1,78* (0,47-2,8) 0,40 (0,16-0,92) 0,94* (0,70-1,45)
IL-6 0,026 (0,0088-0,055) 0,71* (0,06-2,28) 0,034 (0,012-0,050) 0,076 (0,017-1,06)
TNF-a 0,19 (0,11-2,14) 1,24* (0,62-3,182) 0,15 (0,10-0,33) 0,31* (0,17-1,52)
и ТЫР-а, которые стимулируют воспалительные реакции на фоне сохраняющегося дефицита витаминов группы В. При этом могут снижаться уровни инициирующих воспаление !РЫ-у и IL-17A и происходит увеличение экспрессии ^-10, супрессирующего воспалительный процесс по механизмам обратной связи [29].
В совокупности полученные данные позволяют заключить, что при В-витаминном дефиците у мышей наблюдается существенный согласованный сдвиг в сторону повышения продукции провоспалительных цитокинов. Одновременно снижение при этом выработки !РЫ-у и тенденция к уменьшению уровня IL-17A на фоне роста в плазме концентрации ^-10, отчетливо наблюдавшиеся у мышей DBCB к концу эксперимента, могут означать компенсаторное нарастание иммуносупрессорных механизмов и возможное повышение впоследствии риска гиперэргических ТИ2-реакций.
Заключение
В состоянии алиментарного В-витаминного дефицита у крыс и мышей разных линий выявлено несколько
Сведения об авторах
новых биологических маркеров, не представленных в доступной литературе: показатели обмена витаминов А и Е у животных отдельных линий, активность CYP3A печени, уровни эссенциальных (Ре, Zn, Мп, Co) и токсичных (М, Cs) микроэлементов, нарушение баланса противовоспалительных и провоспалительных цитокинов в пользу последних. Рассмотренные биомаркеры могут быть использованы в экспериментах по доклинической оценке эффективности новых витаминных комплексов, специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, исследовании совместимости витаминов, а при наличии доступных биосубстратов (моча, плазма крови) также в клинических и эпидемиологических исследованиях.
Благодарности. Авторы выражают благодарность О.В. Кошелевой и С.Н. Леоненко за техническую помощь при проведении эксперимента.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы поисковых научных исследований (тема ФАНО России № 0529-2015-0006).
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва): Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболом-ного и протеомного анализа E-mail: apryatin@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6543-7495
Бекетова Нина Алексеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: beketova@ion.ru https://orcid.org/0000-0003-2810-2351
Вржесинская Оксана Александровна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: vr.oksana@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-8973-8153
Ригер Николай Александрович - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии
E-mail: riger@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-7149-2485
Евстратова Виктория Сергеевна - младший научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: vik.evstratova@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-3732-8547
Трусов Никита Вячеславович - научный сотрудник лаборатории энзимологии питания
E-mail: nikkitosu@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0002-1919-9297
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и про-теомного анализа E-mail: jsotoc@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6622-5251
Мжельская Кристина Владимировна - лаборант-исследователь лаборатории энзимологии питания
E-mail: kristik13@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0002-0723-5860
Шумакова Антонина Александровна - научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: antonina_sh@list.ru https://orcid.org/0000-0003-1373-4436
Коденцова Вера Митрофановна - доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: kodentsova@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-5288-1132
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Литература
1. Коденцова В.М., Вржесинская О. А., Рисник Д.В. и др. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 113-124.
2. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Сафронова А.И. и др. Оценка обеспеченности витаминами детей дошкольного возраста неин-вазивными методами. // Педиатрия. Журнал им. Сперанского. 2016. № 3. С. 119-123.
3. Устинова О.Ю., Лужецкий К.П., Валина С.А., Ивашова Ю.А. Гигиеническая оценка риска развития у детей соматических нарушений здоровья, ассоциированных с дефицитом витаминов // Анализ риска здоровью. 2015. № 4. С. 79-90.
4. Kennedy D.O. B vitamins and the brain: mechanisms, dose and efficacy - a review // Nutrients. 2016. Vol. 8, N 2. Р. 68.
5. Fratoni V., Brandi M.L. B vitamins, homocysteine and bone health // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 4. P. 2176-2192.
6. Hughes C.F., Ward M., Tracey F. et al. B-vitamin intake and bio-marker status in relation to cognitive decline in healthy older adults in a 4-year follow-up study // Nutrients. 2017. Vol. 9, N 1. P. 53.
7. Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements metabolism in rodents // Trace Elements in Laboratory Rodents / ed. R.R. Watson. New York, etc.: CRC Press, 2000. 416 p.
8. Лизосомы. Методы исследования : пер. с англ. / под ред. Дж. Дингла. М. : Мир, 1980. 344 с.
9. Сокольников А.А., Коденцова В.М., Исаева В.А. Сравнительная оценка биохимических критериев обеспеченности организма тиамином // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 3. С. 50-53.
10. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. Методы оценки витаминной обеспеченности населения М. : ПКЦ Альтекс, 2001. 68 с.
11. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б. и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. 1994. Т. 63, № 6. С. 9-12.
12. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1993. № 1. С. 43-48.
13. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S. et al. Azelastine N-demeth-ylation by cytochrome P-450 (CYP)3A4, CYP2D6, and CYP1A2 in human liver microsomes: evaluation of approach to predict the
contribution of multiple CYPs // Drug Metab Dispos. 1999. Vol. 27, N 12. Р. 1381-1391.
14. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al. Ginkgo biloba extract markedly induces pentoxyresorufin O-dealkylase activity in rats // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90, N 4. Р. 345-351.
15. Гмошинский И.В., Вржесинская О.А., Шумакова А.А. и др. Воздействие наноразмерного диоксида кремния аморфного на усвояемость витаминов В!, В2 и В6 у крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 72-79.
16. Blomhoff R., Green M.H., Berg T., Norum K.R. Transport and storage of vitamin A // Science. 1990. Vol. 250. P. 399-404.
17. Gieng S.H., Raila J., Rosales F.J. Accumulation of retinol in the liver after prolonged hyporetinolemia in the vitamin A-sufficient rat// J. Lipid Res. 2005. Vol. 46, N 4. P. 641-649.
18. Reboul E. Vitamin E bioavailability: mechanisms of intestinal absorption in the spotlight // Antioxidants (Basel). 2017. Vol. 6, N 4. P. E95.
19. Traber M.G., Leonard S.W., Bobe G. et al. a-Tocopherol disappearance rates from plasma depend on lipid concentrations: studies using deuterium-labeled collard greens in younger and older adults // Am. J. Clin. Nutr. 2015. Vol. 101, N 4. P. 752-759.
20. Thurnham D.I. Davies J.A., Crump B.J. et al. The use of different lipids to express serum tocopherol: lipid ratios for the measurement of vitamin E status // Ann. Clin. Biochem. 1986. Vol. 23, pt 5. P. 514-520.
21. Napoli J.L., Beck C.D. Alpha-tocopherol and phylloquinone as noncompetitive inhibitors of retinyl ester hydrolysis // Biochem. J. 1984. Vol. 223, N 1. P. 267-270.
22. Schmolz L., Birringer M., Lorkowski S., Wallert M. Complexity of vitamin E metabolism // World J. Biol. Chem. 2016. Vol. 7, N 1. P. 14-43.
23. Beliveau R., Gelinas Y., Ferraris J., Schmit J.P. Complete analysis of the trace elements of the kidney // Biochem. Cell Biol. 1990. Vol. 68, N 11. P. 1272-1280.
24. Melnikov P., Zanoni L.Z. Clinical effects of cesium intake // Biol. Trace Elem. Res. 2010. Vol. 135, N 1-3. P. 1-9.
25. Haak S., Gyulveszi G., Becher B. Th17 cells in autoimmune disease: changing the verdict // Immunotherapy. 2009. Vol. 1, N 2. P. 199-203.
26. Reiseter B.S., Miller G.T., Happ M.P., Kasaian M.T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition
of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid // J. Neuroimmunol. 1998. Vol. 91. P. 156-170. 27. Ji Z., Fan Z., Zhang Y., Yu R., Yang H., Zhou C. et al. Thiamine deficiency promotes t cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2 // J. Immunol. 2014. Vol. 193, N 5. P. 2157-2167.
28. Simmons S.B., Pierson E.R., Lee S.Y., Goverman J.M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals // Trends Immunol. 2013. Vol. 34, N 8. P. 410-422. doi: 10.1016/j .it.2013.04.006.
29. Koenders M.I., van den Berg W.B. Translational mini-review series on Th17 cells: are T helper 17 cells really pathogenic in autoimmunity? // Clin. Exp. Immunol. 2010. Vol. 159, N 2. P. 131-136.
References
1. Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Risnik D.V., Nikityuk D.B., 15. Tutelyan V.A. Micronutrient status of population of the Russian Federation and possibility of its correction. State of the problem. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (4): 113-24.
doi: 10.24411/0042-88. (in Russian)
2. Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M., Safronova A.I., Toboleva M.A., 16. Aleshina I.V., Pereverzeva O.G., et al. Assessment of vitamins supply
in preschool children by non-invasive method. Pediatriya. Zhurnal im. G.N. Speranskogo [Pediatrics Journal named after G.N. Speran- 17. sky]. 2016; (3): 119-23. doi: 10.24110/0031-40. (in Russian).
3. Ustinova O.J., Luzhetskiy K.P., Valina S.A., Ivashova Y.A. Hygienic
risk assessment of children with somatic health problems associ- 18. ated with vitamin deficiency. Analiz riska zdorov'yu [Health Risks Analysis]. 2015 (4): 79-90. (in Russian).
4. Kennedy D.O. B vitamins and the brain: mechanisms, dose and 19. efficacy - a review. Nutrients. 2016; 8 (2): 68. doi: 10.3390/ nu8020068.
5. Fratoni V., Brandi M.L. B vitamins, homocysteine and bone health. Nutrients. 2015; 7(4): 2176-92. doi: 10.3390/nu7042176.
6. Hughes C.F., Ward M., Tracey F., Hoey L., Molloy A.M., Pentieva K., 20. et al. B-vitamin intake and biomarker status in relation to cognitive decline in healthy older adults in a 4-year follow-up study. Nutrients. 2017; 9 (1): 53. doi: 10.3390/nu9010053.
7. Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements 21. metabolism in rodents. In: R.R. Watson (eds). Trace Elements
in Laboratory Rodents. New York, etc.: CRC Press, 2000: 416 p.
8. Lysosomes - a laboratory handbook. 2nd ed. In: J.T. Dingle (ed.). 22. Amsterdam, New York, Oxford: North-Holland Publishing Company, 1977: 344 p.
9. Sokolnikov A.A., Kodentsova V.M., Isaeva V.A. Biochemical criteria 23. for evaluation of thiamine consumption. Voprosy meditsinskoy khimii [Questions of Medical Chemistry]. 1993; 39 (3): 50-3.
(in Russian). 24.
10. Spirichev V.B., Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Beketova N.A,. Kharitonchik L.A., Alekseeva I.A. Methods for evaluation of vitamin 25. status. Training handbook. Moscow: PKTs Al'teks. 2001: 68 p.
(in Russian)
11. Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M., Kharitonchik L.A., Alekseeva 26. I.A., Risnik V.V., Spirichev V.B. Refining criteria for providing the body with vitamin B2. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 1994; 40 (6): 41-4. (in Russian).
12. Yakushina L.M., Beketova N.A., Bender E.D., Kharitonchik L.A. Methods of high-performance liquid chromatography for determining 27. vitamin levels in biologic fluids and food products. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 1993; (1): 43-8. (in Russian).
13. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S., Shimada N., Yamazaki H., Yokoi T. Azelastine N-demethylation by cytochrome P-450 (CYP)3A4, 28. CYP2D6, and CYP1A2 in human liver microsomes: evaluation of approach to predict the contribution of multiple CYPs. Drug Metab. Dispos. 1999; 27 (12): 1381-91. 29.
14. Umegaki K., Saito K., Kubota Y., et al. Ginkgo biloba extract markedly induces pentoxyreso-rufin O-dealkylase activity in rats. Jpn J Pharmacol. 2002; 90 (4): 345-51.
Gmoshinsky I.V., Vrzhesinskaya O.A., Shumakova A.A., Shipelin V.A., Kodentsova V.M., Khotimchenko S.A. Influence of nanosized amorphous silica on assimilation of vitamins B-i, B2 and B6 in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (6): 72-9. (in Russian).
Blomhoff R., Green M.H., Berg T., Norum K.R. Transport and storage of vitamin A. Science. 1990; 250: 399-404. doi: 10.1126/sci-ence.2218545.
Gieng S.H., Raila J., Rosales F.J. Accumulation of retinol in the liver after prolonged hyporetinolemia in the vitamin A-sufficient rat. J Lipid Res. 2005; 46 (4): 641-9.
Reboul E. Vitamin E Bioavailability: mechanisms of intestinal absorption in the spotlight. Antioxidants (Basel). 2017; 6 (4): E95. doi: 10.3390/antiox6040095.
Traber M.G., Leonard S.W., Bobe G., Fu X., Saltzman E., Grusak M.A., et al. a-Tocopherol disappearance rates from plasma depend on lipid concentrations: studies using deuterium-labeled collard greens in younger and older adults. Am J Clin Nutr. 2015; 101 (4): 752-9. doi: 10.3945/ajcn .114.100966.
Thurnham D.I. Davies J.A., Crump B.J., Situnayake R.D., Davis M. The use of different lipids to express serum tocopherol: lipid ratios for the measurement of vitamin E status. Ann Clin Biochem. 1986; 23 (5): 514-20.
Napoli J.L., Beck C.D. Alpha-tocopherol and phylloquinone as noncompetitive inhibitors of retinyl ester hydrolysis. Biochem J. 1984; 223 (1): 267-70.
Schmolz L., Birringer M., Lorkowski S., Wallert M. Complexity of vitamin E metabolism. World J Biol Chem. 2016; 7 (1): 14-43. doi:10.4331/wjbc.v7.i1.14.
Beliveau R., Gelinas Y., Ferraris J., Schmit J.P. Complete analysis of the trace elements of the kidney. Biochem Cell Biol. 1990; 68 (11): 1272-80. doi: 10.1139/o90-189.
Melnikov P., Zanoni L.Z. Clinical effects of cesium intake. Biol Trace Elem Res. 2010; 135 (1-3): 1-9.
Haak S., Gyulveszi G., Becher B. Th17 cells in autoimmune disease: changing the verdict. Immunotherapy. 2009; 1 (2): 199-203. doi: 10.2217/1750743X.1.2.199.
Reiseter B.S., Miller G.T., Happ M.P., Kasaian M.T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. J Neuroimmunol. 1998; 91: 156-70.
Ji Z., Fan Z., Zhang Y., Yu R., Yang H., Zhou C., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. J Immunol. 2014; 193 (5): 2157-67. doi:10.4049/jimmunol.1302702. Simmons S.B., Pierson E.R., Lee S.Y., Goverman J.M. Modeling the heterogeneity of mul-tiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 2013; 34 (8): 410-22. doi: 10.1016/j.it.2013.04.006. Koenders M.I., van den Berg W.B. Translational mini-review series on Th17 cells: are T helper 17 cells really pathogenic in autoimmunity? Clin Exp Immunol. 2010; 159 (2): 131-6. doi: 10.1111/j.1365-2249.2009.04039.x.
