CC BY
748
Для корреспонденции
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-92 E-mail: [email protected]
Апрятин С.А., Мжельская К.В., Балакина А.С., Сото С.Х., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Коденцова В.М., Гмошинский И.В.
Линейные и гендерные различия в биохимических показателях и показателях обеспеченности жирорастворимыми витаминами у крыс на in vivo модели метаболического синдрома
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Потребление рационов с энергетической ценностью, неадекватной фактическим энерготратам организма, может приводить к развитию метаболического синдрома (МС), имеющего своими последствиями сахарный диабет2 типа, неалкогольный стеатогепатит, атеросклероз, подагру, аллергические заболевания. Для разработки новых подходов к диетической и медикаментозной коррекции МС необходимо наличие его экспериментальных моделей. Целью работы был сравнительный анализ функциональных, биохимических и витаминных маркеров, характеризующих воздействие рациона с высоким содержанием фруктозы на самцов и самок различных линий крыс и выбор на этой основе оптимальной in vivo модели МС. В работе использовали самцов и самок крыс аутбредной линии Вистар (W) и инбредной линии Dark Agouti (DA) численностью по 16 особей каждого пола и линии. Животные первых (контрольных) групп каждого пола и линии получали сбалансированный полусинтетический рацион по AIN93, а животные вторых (опытных) групп - такой же рацион и 30% раствор фруктозы вместо воды в режиме свободного доступа. В течение 121 сут определяли фактическую энергетическую ценность рационов, прибавку массы тела, артериальное давление; при выведении животных из эксперимента - относительную массу внутренних органов, биохимические показатели плазмы крови, содержание жирорастворимых витаминов А и Е в плазме крови и печени. Показано, что, несмотря на повышенную на протяжении всего эксперимента энергетическую ценность рациона в опытных группах, самцы и самки DA практически не отвечали на это увеличением прибавки массы тела в отличие от крыс W (особенно самок).
Для цитирования: Апрятин С.А., Мжельская К В., Балакина А.С., Сото С.Х., Бекетова Н А., Кошелева О.В., Коденцова В.М., Гмошинский И.В. Линейные и гендерные различия в биохимических показателях и показателях обеспеченности жирорастворимыми витаминами у крыс на in vivo модели метаболического синдрома // Вопр. питания. 2018. Т. 87. № 1. С. 51-62. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10006. Статья поступила в редакцию 09.06.2017. Принята в печать 18.12.2017.
For citation: Apryatin S.A., Mzhel'skaya K.V., Balakina A.S., Soto S.J., Beketova N.A., Kosheleva O.V., Kodentsova V.M., Gmoshinsky I.V. Sex and line differences in biochemical indices and fat soluble vitamins sufficiency in rats on in vivo model of metabolic syndrome. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 51-62. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10006. (in Russian) Received 09.06.2017. Accepted for publication 18.12.2017.
Sex and line differences in biochemical indices and fat soluble vitamins sufficiency in rats on in vivo model of metabolic syndrome
Apryatin S.A., Mzhel'skaya K.V., Balakina A.S., Soto S.J., Beketova N.A., Kosheleva O.V., Kodentsova V.M., Gmoshinsky I.V.
Потребление рационов с фруктозой приводило к возрастанию концентрации глюкозы независимо от пола и линии, тогда как концентрация триглицеридов (ТГ) статистически значимо повышалась при этом только у самок W. Добавление фруктозы вызывало у крыс DA обоих полов возрастание массы почек, а также более выраженную в сравнении с крысами Wманифестацию маркеров токсического действия на печень (повышение активности аланинаминотрансферазы и у-глутамилтрансферазы, увеличение концентрации мочевины и билирубина в плазме крови). У крыс обеих линий потребление фруктозы подавляло накопление ретинола пальмитата в печени по показателю его удельного содержания. Общее содержание а-токоферола в печени было достоверно выше у крыс Wв сравнении с животными DA. При этом концентрация а-токоферола в плазме крови коррелировала с концентрацией ТГ, а отношение а-токоферол/ТГдостоверно снижалось на фоне приема фруктозы у самок W, отличавшихся гиперлипидемией. Таким образом, действие фруктозы на самцов и особенно самок Wв основном соответствует классической картине МС с возрастанием массы тела, повышением артериального давления, гликемии и уровня ТГ, тогда как у DA превалирует токсическое действие фруктозы на печень и, возможно, почки без развития признаков дислипидемии и ожирения.
Ключевые слова: метаболический синдром, крысы, in vivo модели, фруктоза, витамины, витаминная обеспеченность
Consumption of diets that are inadequate in energy value to the actual energy expenditure can lead to the development of metabolic syndrome (MS), which has consequences such as type 2 diabetes mellitus, non-alcoholic steatohepatosis, atherosclerosis, gout, allergic diseases. Experimental models of MS are needed to develop new approaches to its dietary and drug correction. The aim of the work was a comparative analysis of functional, biochemical and vitamin markers characterizing the effect of a diet with a high content of fructose (F) on males and females of various rat lines and the selection on this basis of an optimal in vivo MS model. Male and female rats of the outbred Wistar line (W) and the inbred Dark Agouti line (DA) were used in the work number of 16 individuals of each sex and line. The animals of the 1st (control) groups of each sex and line received a balanced semi-synthetic diet according to AIN93, and the animals of the 2nd (experimental) groups - the same diet and 30% solution of F instead of water in the regime of free access. Within 121 days, energy value of diets consumed, the increase in body weight and blood pressure were determined; relative mass of internal organs, biochemical parameters of blood plasma, content of fat-soluble vitamins A and E in blood plasma and liver were determined at withdrawal of animals from experiment. It was shown that, in spite of the increased energy value of the diet in the experimental groups throughout experiment, DA males and females practically did not respond to this by an increase in body weight gain, in contrast to W rats (in particular, females). Consumption of diets with F led to an increase in glucose level irrespective of gender and line, whereas triglyceride level (TG) significantly increased only in the case of W female. Addition of F caused in DA rats of both sexes an increase in the mass of the kidneys, as well as more pronounced, in comparison with W rats manifestation of markers of toxic effects on the liver (increases alanine aminotransferase and y-glutamyltransferase activity, elevated urea and bilirubin level in blood plasma). In rats of both lines intake of F suppressed the accumulation of retinol palmitate in the liver in terms of its specific content. The total content of a-tocopherol in liver was significantly higher in W compared with DA. At the same time, a-tocopherol levels in blood plasma correlated with TG, and the a-tocopherol/TG ratio significantly decreased in female W receiving F, which were characterized by hyperlipidemia. Thus, the effect of F on W males and, in particular, females, basically corresponded to the classical picture of MS with body weight increasing, elevated blood pressure, glycemia and TG increase, whereas the toxic effect of F prevailed in DA liver and, possibly, kidneys without development of marked dyslipidemia and obesity.
Keywords: metabolic syndrome, rats, in vivo models, fructose, vitamin, vitamin sufficiency
Потребление высокоуглеводных и высокожировых рационов с энергетической ценностью, неадекватной фактическим энерготратам организма, может приводить к развитию метаболического синдрома (МС), характеризующегося ожирением (избыточным отложением жира в брюшной полости) и любыми двумя факторами из таких, как повышенная концентрация триглицеридов, сниженная концентрация холестерина липопротеинов высокой плотности, повышенное артериальное давление (АД), повышенный уровень глюкозы в плазме крови натощак и имеющего своими последствиями сахарный диабет 2 типа, неалкогольный стеа-тогепатит, атеросклероз, подагру, аллергические заболевания [1-3].
По данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность МС среди взрослого населения развитых стран составила у мужчин до 40 лет 18,6%, в возрасте 40-55 лет - 44,4%, среди женщин 7,3 и 20,8% соответственно [4]. В основе механизма формирования МС лежит инсулиновая резистентность, т.е. утрата или
резкое снижение способности адекватно реагировать на выделяющийся инсулин повышением абсорбции глюкозы клетками, активацией липогенеза, запасанием гликогена с соответствующим снижением липолиза и глюконеогенеза [5]. Для разработки новых подходов к диетической и медикаментозной коррекции МС на доклинической стадии необходимо наличие адекватных экспериментальных моделей МС у лабораторных животных. Такие модели воспроизводят, как правило, путем использования мышей и крыс с генетическими дефектами отдельных звеньев углеводного и липидного обмена либо путем кормления животных конвенциональных аутбредных или инбредных линий рационами с повышенными квотами легкоусвояемых углеводов (главным образом фруктозы) и/или жиров [6]. Результаты различных работ по моделированию МС трудно сопоставимы из-за использования в них животных разных видов, линий, пола и возраста. Целью настоящего исследования был сравнительный анализ функциональных, биохимических и витаминных маркеров, характери-
зующих воздействие рациона с высоким содержанием фруктозы на самцов и самок крыс аутбредной линии Вистар (W) и инбредной линии Dark Agouti (DA) и выбор оптимальной in vivo модели МС.
Материал и методы
В работе использовали самцов и самок крыс W и DA численностью по 16 особей каждого пола и линии. Животных содержали группами по 2 особи в клетке при температуре 21 ±1 °С и режиме освещения 12/12 ч. Работу с животными выполняли в соответствии с руководством [7] и приказом [8]. Животные каждого пола и линии были разделены на 2 группы (1-я и 2-я) равной численности методом случайной выборки. Средняя исходная масса тела в 1-й и 2-й группах составила (M±m) 350±8 и 368±17 г (самцы W), 250±7 и 262±7 г (самки W), 213±2 и 216±2 г (самцы DA), 145±2 и 144±3 г (самки DA) и не различалась попарно (p>0,05, ANOVA). Животные первых (контрольных) групп получали сбалансированный полусинтетический рацион по AIN93 с некоторыми модификациями [9] изначально из расчета 15 г сухого корма на крысу в сутки и очищенную обратным осмосом питьевую воду, а животные вторых (опытных) групп - такой же рацион и 30% раствор фруктозы вместо воды в режиме свободного доступа. Количество съеденного рациона и выпитой жидкости фиксировали ежедневно. Крыс еженедельно взвешивали с точностью ±1 г, фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстного покрова, стула, особенности поведения. АД в артерии хвоста определяли с помощью хвостовой манжеты на приборе «Non Invasive Blood Pressure» («ADinstruments», Австралия) на 112-е сутки эксперимента. Выведение животных из эксперимента осуществляли на 121-е сутки путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в мерные пробирки с 0,5 см3 1% раствора гепарина, индивидуально фиксируя разведение каждой пробы. Отбор органов осуществляли стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали. Массу органов (печень, селезенка, сердце, почки, надпочечники, тимус, легкие, головной мозг, забрюшинная жировая ткань) определяли на лабораторных весах с точностью ±0,01 г. Немедленно после отбора печень охлаждали на льду до температуры 0-2 °С и хранили до исследования при -80 °С.
Биохимические показатели плазмы крови [концентрацию глюкозы, триглицеридов, холестерина, фосфора, кальция, мочевины, билирубина, активность аланинами-нотрансферазы (АЛТ) и у-глутамилтрансферазы (ГГТ)] определяли на биохимическом анализаторе «Konelab 20i» («Konelab», Финляндия). Содержание витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (a-токоферола) в плазме крови и в гомогенате печени определяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофлюориметрическим детектированием [10].
Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрических критериев АЫОУА, двустороннего критерия Стьюдента для несвязанных показателей с поправкой 1_еуте на неравенство выборочных дисперсий, непараметрического критерия Манна-Уитни, коэффициента корреляции по Пирсону при уровне значимости р<0,05.
Результаты
Определение удельного энергопотребления животных (с учетом потребленной с питьевой жидкостью фруктозы) показало (рис. 1, А-Г), что энергетическая ценность рационов животных опытных групп была систематически выше, чем в контроле, за исключением самцов W в период после 85-х суток опыта, и демонстрировала определенную тенденцию к снижению на протяжении эксперимента. Средняя по всему опыту разность в энергетической ценности рационов животных опытных и контрольных групп для всех линий и полов была статистически значимо положительной (рис. 1, Д) (р<0,001 согласно двустороннему парному критерию Стьюдента). При этом влияние приема фруктозы на динамику массы тела существенно зависело от линии и пола животных. Согласно данным рис. 2, добавление фруктозы практически не влияло на прибавку массы тела крыс ОА, как самцов, так и самок. В отличие от этого у самцов W, получавших фруктозу, на протяжении всего эксперимента отмечалась тенденция к большей прибавке массы тела, достигавшая статистически достоверного различия на 63-и сутки опыта, а у самок прибавки массы тела были достоверно выше в группе, получавшей фруктозу, в течение большей части эксперимента. Таким образом, крысы ОА в отличие от W были резистентны к набору избыточной массы тела на высокоуглеводном рационе, а среди последних более предрасположены к прибавке массы в результате потребления фруктозы были самки.
Как следует из данных рис. 3, на 112-е сутки эксперимента было отмечено значимое повышение систолического и диастолического АД у крыс W в группе, получавшей фруктозу, в сравнении с контролем. У крыс инбредной линии ОА выявлены аналогичные изменения, но статистически значимым было только повышение систолического АД.
Определение относительной массы органов (в % от массы тела) при выведении животных из эксперимента (рис. 4) показало, что прием фруктозы приводил к увеличению средней массы печени (р<0,05 для всех линий/полов, за исключением самцов W). Масса печени у крыс W была значимо выше по сравнению с таковой у животных ОА того же пола и с тем же рационом, за исключением самцов, получавших фруктозу. У ОА (как самцов, так и самок), находившихся на рационе с фруктозой, отмечалась статистически значимо большая масса почек в сравнении с контролем; при этом относительная масса почек во всех группах W была меньше, чем в соответствующих группах ОА. В противо-
А
500
и к 400
т у с СО 300
а л е т 200
ы с
с а 100
м
к
а н 0
л а к к В
т с о н 700
н е ц 600
а к с 500
т и т е 400
|_ р е 300
CD 200
100
0
W самцы
-1-1-г
DA самцы
1-1-1-1-1-1
0 20 40 60 80 100 120
Б
500 400 300 200 100
Г
700 600 500 400 300 200 100 0
W самки
DA самки
W W DA DA самцы самки самцы самки
Контроль Фруктоза
т-1-1-1-1-1
0 20 40 60 80 100 120
Сутки эксперимента
0
Рис. 1. Удельная энергетическая ценность рационов опытных и контрольных групп самцов (А) и самок (Б) аутбредных крыс линии Вистар, самцов (В) и самок (Г) инбредных крыс линии Dark Agouti; средняя разность удельной энергетической ценности на протяжении эксперимента между опытными и контрольными группами (Д)
положность этому масса надпочечников в результате потребления фруктозы достоверно повышалась только у крыс W, а у РД не изменялась (самцы) или имела тенденцию к снижению (самки). Относительная масса надпочечников у самцов W была ниже, чем у РД в соответствующих группах. Масса забрюшинного жира среди всех исследованных групп животных в результате приема фруктозы увеличивалась только у самцов W (различие на уровне тенденции, р=0,077). У самок W и РД этот показатель практически не изменялся. При этом масса забрюшинного жира была статистически значимо выше во всех группах W по сравнению с показателем соответствующих групп РД, а также была достоверно выше у самок в сравнении с самцами (за исключением W, получавших фруктозу). Массы остальных изученных органов не изменялись под воздействием приема фруктозы; можно отметить статистически значимо меньшую массу селезенки и большую массу головного мозга, легких и сердца у крыс РД по сравнению с W во всех соответствующих группах (р<0,05, данные не показаны).
Потребление рационов с фруктозой приводило к возрастанию концентрации глюкозы в плазме крови
у животных всех групп, независимо от пола и линии (рис. 5). При этом самцы W были более склонны к развитию гипергликемии по сравнению с самцами РД. Концентрация триглицеридов в плазме крови статистически значимо повышалась у самок W (что совпадает с ранее полученными данными [11]) и незначимо у самцов, в то время как РД совершенно не проявляли склонности к развитию триглицеридемии: концентрация триглице-ридов в их крови была во всех группах соответственно ниже, чем у W. Концентрация холестерина в плазме крови под воздействием рациона с фруктозой значимо повышалась только у самок W. Во всех группах животных (за исключением самцов W) отмечена тенденция к росту уровня фосфора (у самок РД различие достоверно) при отсутствии выраженных изменений в уровне кальция.
При сравнении уровней маркеров повреждения паренхимы печени в плазме крови обращает на себя внимание статистически значимо повышенная в сравнении с контролем концентрация мочевины, билирубина и активность ГГТ у самок РД, получавших фруктозу. У самцов РД аналогичный эффект наблюдался в отношении концентрации мочевины и активности АЛТ и ГГТ,
у самок W - концентрации билирубина и активности ГГТ, у самцов W указанные эффекты отсутствовали. Таким образом, самки и самцы ОА в целом более чувствительны к токсическому действию фруктозы на печень в сравнении с крысами W. Показательно в этом плане, что активность АЛТ у самцов и самок ОА была достоверно повышена в сравнении с показателем у крыс W того же пола и значительно превышали вер-
W самцы
хний предел ориентировочных нормальных значений для крыс данного возраста (около 60 кЕд/л для самцов и 50 кЕд/л для самок [12]).
Как следует из данных рис. 6, потребление рациона с фруктозой не отражалось на концентрации ретинола в плазме крови крыс, за исключением повышения у самок W. Концентрация а-токоферола в плазме крови у самок, получавших фруктозу, характеризовалась разно-
W самки
В
340 320 300 280 260 240 220 200
DA самцы
DA самки
50 100
Сутки эксперимента
150
Контроль
200
190
180
170
160
150
140
50 100
Сутки эксперимента
150
Фруктоза
Г
0
0
Рис. 2. Средние прибавки массы тела самцов (А) и самок (Б) аутбредных крыс линии Вистар, самцов (В) и самок (Г) инбредных крыс линии Dark Agouti в зависимости от состава потребляемого рациона
* - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя животных, получавших раствор фруктозы согласно t-критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни.
W самцы
DA самцы
140 -| 120 -100806040 20 0
Контроль
Фруктоза ■ Систолическое
140 120 100 80 60 40 20 0
Контроль
Фруктоза
Диастолическое
Рис. 3. Артериальное давление самцов крыс линии Вистар (А) и самцов линии Dark Agouti (Б) на 112-е сутки эксперимента
* - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя контроля согласно t-критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни. Число животных - 4 в каждой группе.
направленным изменением - статистически значимым повышением у W и снижением у ОД. Причина этого различия может быть связана с выраженной корреляцией между концентрацией а-токоферола и триглицеридов (коэффициент корреляции по Пирсону г=+0,801; р<0,001 по всем животным), притом что наибольшая концентрация триглицеридов отмечалась именно у самок W, получавших фруктозу (см. рис. 5). При оценке статуса токоферола плазмы крови по его соотношению к уровню триглицеридов (рис. 6, врезка) видно, напротив, достоверное снижение этого показателя у животных данной группы.
Сравнение влияния фруктозы на маркеры обмена жирорастворимых витаминов в печени показало, что у крыс обеих линий потребление углевода подавляло накопление пальмитата ретинола по показателю его удельного содержания в ткани органа (рис. 6, В). При выражении количества пальмитата ретинола на весь орган это различие нивелировалось (что связано с возрастанием массы печени у крыс, получавших фруктозу), но отмечалось статистически значимо большее содержание метаболита у всех групп W в сравнении с соответствующими группами ОД опять же вследствие, по-видимому, меньшей массы печени у последних. В случае а-токоферола влияние фруктозы на его удельное содержание не выявлено ни в одной группе, а общее содержание достоверно повышалось у самок W, получавших фруктозу, и было выше у всех групп W в сравнении с соответствующими группами ОД, что также может быть объяснено различиями в общей массе печени между рассматриваемыми группами.
Обсуждение
В настоящее время считается установленным, что фруктоза по сравнению с другими легкоусвояемыми
углеводами (моно- и дисахаридами) обладает наибольшим липогенным действием на организм человека и ряд экспериментальных животных и создает при избыточном потреблении наибольший риск развития МС [13, 14]. Рационы с высоким содержанием фруктозы и ее источников (сахароза) стимулируют липогенез в печени, приводящий к росту концентрации общих триглицеридов, липопротеидов очень низкой плотности и свободных жирных кислот в циркуляции. Причиной этому являются особенности метаболизма фруктозы, которая после поступления в печень фосфорилируется до фруктозо-1-фосфата, который в свою очередь далее быстро деградирует до трехуглеродных фрагментов, таких как глице-ральдегид и диоксиацетонфосфат, выступающих в роли предшественников глицерина и ацетил-КоА, т.е. субстратов биосинтеза липидов de novo. В отличие от этого для глюкозы данное направление метаболизма лимитировано ее зависящей от уровня инсулина консервацией в пул гликогена, а также стадией превращения во фрук-тозо-1,6-дифосфат под действием «медленной» фос-фофруктокиназы [15]. Процессы ассимиляции фруктозы в отличие от глюкозы не контролируются инсулином, что создает предпосылки для перенапряжения инсуляр-ной оси регуляции углеводно-жирового обмена вследствие повышения концентрации общих триглицеридов и свободных жирных кислот. В результате формируется инсулиновая резистентность за счет необратимого нарушения фосфорилирования по тирозину внутриклеточных инсулиновых рецепторов IRS-1 и IRS-2, приводящего к снижению активности киназы инозитол-3-фосфата (PI-3) и повреждению каскада внутриклеточной передачи сигнала инсулина на эффекторные механизмы (ядерные транскрипционные факторы). Ключевую роль в этом процессе играет фосфатаза PTP-1B, активируемая свободными жирными кислотами [15].
Как свидетельствуют результаты, полученные в настоящем исследовании, характер специфического дейс-
Печень
Почки
4 3,5 3 2,5 2
« 1,5
га
1
0,5 0
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки Надпочечники
0,04
0,035 -
а
I 0,03 -
1 0,025 -
м
5 0,02 - I
«0,015 -са I * гЬ
Л 0,01 - г*
0,005 -
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки ■ Контроль
0,9-, 0,80,70,60,50,40,30,20,1 -0-
Г
7-, 654321 -0-
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки Забрюшинный жир
I I
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки □ Фруктоза
Рис. 4. Относительная масса внутренних органов: печени (А), почек (Б), надпочечников (В) и забрюшинной жировой ткани (Г) крыс при выведении из эксперимента на 121-е сутки
Статистически значимое (р<0,05) отличие согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни: * - от показателя животных контрольной группы; I - от показателя йЛ; а - от показателя самок той же линии. Число животных -7 (самцы йЛ, 1-я группа); 8 (остальные).
I
I
I
В
I
I
а
0
твия фруктозы на организм на двух экспериментальных моделях крыс линий W и ОД различается. С одной стороны, животные обеих линий одинаково реагируют на потребление 30% раствора фруктозы повышением АД и концентрации глюкозы в крови, что соответствует развитию МС у человека [4]. С другой стороны, несмотря на одинаковые различия в энергетической ценности опытного и контрольного рационов, крысы ОД практически не отвечают на добавку фруктозы прибавкой массы тела в отличие от W (что особенно заметно при сравнении самок животных). Крысы ОД обоих полов, получающие фруктозу, не проявляют никакой тенденции к увеличению массы забрюшинного жира и в отличие от W не демонстрируют возрастания концентрации
холестерина и триглицеридов в плазме крови. Вместе с тем добавление фруктозы вызывает у ОД возрастание массы почек, что является одним из признаков развития нефропатии, а также более выраженную в сравнении с W манифестацию маркеров токсического действия на печень (повышение активности АЛТ, ГГТ и концентрации мочевины, билирубина) - изменения 3 из 4 параметров для каждого из полов ОД в отличие от изменения двух параметров у самок и отсутствии изменений у самцов W. Таким образом, действие фруктозы на самцов, особенно самок W, в основном соответствует классической картине МС с возрастанием массы тела, повышением АД, гликемии и увеличением концентрации триглицеридов, тогда как у ОД превалирует токсическое
Глюкоза
10,00
9,00
8,00
7,00
ъ 6,00
_0 л 5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
В 2,50
2,00
ъ 1,50
_0
л о Е 1,00
ь
0,50
0,00
Д
10,00
9,00
8,00
7,00
ъ 6,00
_0 5,00
л о s 4,00
ь 3,00
2,00
1,00
0,00
гЪ
W самцы W самки ОД самцы ОД самки
Фосфор
гЬ
Б
12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
Г
Триглицериды
£
W самцы W самки ОД самцы ОД самки Холестерин
Л
3,50
3,00
2,50
3 2,00
ь л о 1,50
1,00
0,50
0,00
гЬ
и
ёЬ
W самцы W самки ОД самцы ОД самки Мочевина
гЬ
Ьъ
Ж
W самцы W самки ОД самцы ОД самки АЛТ
300
250
200
Е 150
100
50
0
Е
45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00
З
60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0,000
W самцы W самки ОД самцы ОД самки Билирубин (общий)
I *
■ Контроль □ Фруктоза
гЬ
1
г*1
W самцы W самки ОД самцы ОД самки у-Глутамилтрансфераза
W самцы W самки ОД самцы ОД самки
W самцы W самки ОД самцы ОД самки
I
I
I
I
I
V
I
*
I
*
Рис. 5. Концентрация в плазме крови крыс при выведении из эксперимента на 121-е сутки глюкозы (А), триглицеридов (Б), фосфора (В), холестерина (Г), мочевины (Д), общего билирубина (Е), активность аланинаминотрансферазы (Ж) и у-глутамилтрансферазы (З)
Статистически значимое (р<0,05) отличие согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни: * - от показателя животных контрольной группы; I - от показателя ЭЛ. Число животных - по 8 в каждой группе.
Ret, плазма
35 30 25 20 15 10 5
I
*
гЪ
2,5 1 21,51 -0,5-
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки
0
aToc, плазма
I
*
W самцы W самки р*!^ ЭД самцы ЭД самки
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
Ret-Palm, печень
Г
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки Ret-Palm, печень
350 -, 300 -250 -200 -150 -100 -500-
3500 -, 3000 -2500 -
е 2000-
"Ш 1500 -м
1000 -500 -0-
I
I
I
* *
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки
аТос, печень
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки аТос, печень
60 50403020100
800 -| 700 -600 -500 -400 -300 -200 -100-
*
(Л
■ Контроль □ Фруктоза
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки
W самцы W самки ЭД самцы ЭД самки
I
0
*
0
Рис. 6. Содержание жирорастворимых витаминов в биосубстратах крыс при выведении из эксперимента на 121-е сутки: А - ретинол, плазма крови; Б - а-токоферол, плазма крови (врезка - отношение а-токоферол/триглицериды); В - ретинола пальмитат, печень, удельное содержание; Г - ретинола пальмитат печень, общее содержание; Д - а-токоферол, печень, удельное содержание; Е - а-токо-ферол, печень, общее содержание
Статистически значимое (р<0,05) отличие согласно ^критерию Стьюдента и/или непараметрическому критерию Манна-Уитни: * - от показателя животных контрольной группы; I - от показателя йЛ. Число животных - 7 (самцы йЛ, 1-я группа); 8 (остальные).
действие фруктозы на печень и, возможно, почки без развития признаков дислипидемии и ожирения. Нефро-токсическое действие фруктозы рациона у крыс описано в литературе [13].
Причиной токсического повреждения печени вследствие потребления избытка фруктозы, по современным представлениям, может быть местное накопление жира в этом органе, провоцирующее инсулиновую резистентность и хроническое воспаление, которое сопровождается выделением провоспалительных цитокинов и подавлением активности комплекса генов, включая ген транскрипционного фактора HNF4a [16]. Недостаток HNF4a, стимулирующего в ансамбле с рецепторами ксенобиотиков PXR и CAR экспрессию белков семейства цитохрома Р-450 [17], приводит к снижению активности ряда ферментов системы детоксикации ксенобиотиков и соответствующему накоплению в органе токсических веществ. Другой причиной органотоксического действия фруктозы может быть окислительный стресс, обусловленный привлечением в печень мононуклеарных фагоцитов в условиях хронического воспаления [18]. В отличие от DA указанные эффекты проявляются у W в меньшей степени, возможно, из-за различий в скорости транспорта синтезируемых в печени de novo липидов в жировую ткань и периферические органы (включая скелетные мышцы). Это может быть связано с различием у этих линий животных функциональной активности генов, кодирующих основные классы апо-липопротеидов и их рецепторов, которые в настоящий момент не описаны в литературе.
Процессы метаболизма жирорастворимых витаминов в организме тесно связаны с липидным обменом и ввиду этого могут рассматриваться как потенциальные маркеры развития МС. Как показали проведенные исследования, относительно равномерное снижение удельного содержания производного ретинола в печени крыс обеих линий можно тривиально объяснить снижением поступления витамина в организм животных всех опытных групп за счет уменьшения поедаемости твердого корма, аналогично тому, как это наблюдали в [10]. В этой связи характерно, что прием добавки фруктозы не оказывал значимого влияния на экспрессию ключевого гена обмена ретинола Retsat [19]. Напротив, достоверные и разнонаправленные изменения уровня токоферола в плазме крови и печени самок W и DA требуют отдельного объяснения. Характерно наличие явной корреляции в повышении концентрации токоферолов и триглицеридов в плазме крови, что может рассматриваться как признак влияния дислипидемии на статус токо-
феролов. При выражении концентрации токоферолов в плазме крови в расчете на концентрацию общих три-глицеридов видно (рис. 6, врезка), что представленный таким образом показатель обеспеченности этим витамином достоверно снижается у самок W, получающих фруктозу, и только на уровне тенденции - у самок ОД и самцов W, а у самцов ОД эффект полностью отсутствует. По данным литературы, при МС у людей вследствие окислительного стресса и воспаления снижается уровень токоферолов, соотнесенный на содержание липидов [20-22]. Тем самым данные проведенного эксперимента подтверждают, что соотношение токоферол/ триглицериды в плазме крови может рассматриваться в качестве маркера метаболических нарушений при МС, вызванных потреблением избыточного количества фруктозы и проявляющихся в наибольшей степени у чувствительной линии животных (самок W).
Таким образом, изучение интегральных и биохимических маркеров МС у крыс двух линий показало, что фруктоза оказывает качественно различное влияние на самок и самцов W и ОД, причем у самок крыс W (в отличие от ОД) выявленные изменения проявляют наибольшее сходство с наблюдаемой клинической картиной МС у человека по ключевым маркерам. С другой стороны, действие фруктозы на печень ОД в большей степени может быть соотнесено с некоторыми клиническими проявлениями неалкогольного стеатогепатита. Выявленные различия в реакции крыс двух линий на фруктозу могут быть связаны с особенностями их генетического фона, проявляющегося в неодинаковом уровне экспрессии генов, отвечающих за липогенез и токсическое действие на клетки печени. По данным литературы, одним из ключевых факторов, отвечающих за защиту печени от повреждения, вызываемого избытком фруктозы, может быть С1^ЕВР (реагирующий на углеводы элемент-связывающий белок), повышенная экспрессия которого предрасполагает к накоплению жира без выраженного токсического повреждения печени, а пониженная - к развитию стеатогепатита на высо-кофруктозной диете [23]. Для проверки данного предположения необходимо проведение транскриптомного анализа ткани печени животных, что должно стать предметом отдельного исследования.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО (государственное задание № 0529-2015-0006 «Поиск новых молекулярных маркеров алиментарно-зависимых заболеваний: геномный и постгеномный анализ»).
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Апрятин Сергей Алексеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболом-ного и протеомного анализа E-mail: [email protected]
Мжельская Кристина Владимировна - лаборант-исследователь лаборатории энзимологии питания E-mail: [email protected]
Балакина Анастасия Станиславовна - младший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания E-mail: [email protected]
Бекетова Нина Алексеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Кошелева Ольга Васильевна - научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и про-теомного анализа E-mail: [email protected]
Коденцова Вера Митрофановна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected]
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: [email protected]
Литература
1. Anderson P.J., Critchley J.A., Chan J.C., Cockram C.S., Lee Z.S., Thomas G.N. et al. Factor analysis of the metabolic syndrome: obesity vs insulin resistance as the central abnormality // Int. J. Obes. 2001. Vol. 25. P. 1782-1788.
2. Carr D.B., Utzschneider K.M., Hull R.L, Kodama K., Retzlaff B.M., Brunzell J.D. et al. Intra-abdominal fat is a major determinant of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III criteria for the metabolic syndrome // Diabetes. 2004. Vol. 53, N 8. P. 2087-2094.
3. Nesto R.W. The relation of insulin resistance syndromes to risk of cardiovascular disease // Rev. Cardiovasc. Med. 2003. Vol. 4, N 6. P. S11-S18.
4. Метаболический синдром / под ред. Г.Е. Ройтберга. М. : МЕДпре-сс-информ, 2007. 224 с.
5. Rask-Madsen C., Kahn R. Tissue-specific insulin signaling, metabolic syndrome and cardiovascular disease // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2012. Vol. 32, N 9. P. 2052-2059.
6. Wong S.K., Chin K.-Y., Suhaimi F.H., Fairus A., Ima-Nirwana S. Animal models of metabolic syndrome: a review // Nutr. Metab. 2016. Vol. 13. P. 65.
7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Re-search (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : National Academies Press, 2011.
8. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 193н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».
9. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В., Аврень-ева Л.И. Влияние количества жира в рационе на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты у крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1. С. 24-29.
10. Апрятин С.А., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Кошелева О.В., Кудан П.В., Евстратова А.Д. и др. Показатели обеспеченности витаминами при экспериментальной алиментарной гиперлипи-демии у грызунов // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 1. С. 6-16.
11. Апрятин С.А., Мжельская К.В., Трусов Н.В., Балакина А.С., Кулакова С.Н., Сото Х.С. и др. Сравнительная характеристика in vivo моделей гиперлипидемии у крыс линии Вистар и мышей линии C57Bl/6 // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. C. 14-23.
12. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q., Guo S.M., Zhang J.X. et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex // Asian J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2004. Vol. 4. P. 215-218.
13. Sanchez-Lozada L.G., Tapia E., Jimenez A., Bautista P., Cristobal M., Nepomuceno T. et al. Fructose-induced metabolic syndrome is
associated with glomerular hypertension and renal microvascular damage in rats // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2007. Vol. 292. P. F423-F429.
14. Mamikutty N., Thent Z.C., Sapri S.R., Sahruddin N.N., Mohd Yusof M.R., Haji Suhaimi F. The establishment of metabolic syndrome model by induction of fructose drinking water in male Wistar rats // Biomed. Res. Int. 2014. Article ID 263897.
15. Rutledge A.C., Khosrow A. Fructose and the metabolic syndrome: pathophysiology and molecular mechanisms // Nutr. Rev. 2007. Vol. 65, N 6. P. S13-S23.
16. Vachirayonsti T., Ho K.W., Yang D., Yan B. Suppression of the preg-nane X receptor during endoplasmic reticulum stress is achieved by down-regulating hepatocyte nuclear factor-4a and up-regulating liver-enriched inhibitory protein // Toxicol. Sci. 2015. Vol. 144, N 2. P. 382-392.
17. Jover R., Moya M., Gomez-Lechon M.J. Transcriptional regulation of cytochrome P-450 genes by nuclear factor 4-alpha // Curr. Drug Metab. 2009. Vol. 10, N 5. P. 508-519.
18. Kucera O., Cervinkova Z. Experimental models of non-alcoholic fatty liver disease in rats // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20, N 26. P. 8364-8376.
19. Апрятин С.А., Трусов Н.В., Балакина А.С., Ригер Н.А., Гмо-шинский И.В. Изменение транскриптомного профиля печени крыс линии Wistar при экспериментальной алиментарной гиперлипидемии // Материалы Всерос. конф. с междунар. участием «Профилактическая медицина-2016», ч. 1. СПб., 2016. С. 34-39.
20. Бекетова Н.А., Спиричева Т.В., Переверзева О.Г., Кошелева О.Г., Вржесинская О.А., Харитончик Л.А. и др. Изучение обеспеченности водо- и жирорастворимыми витаминами взрослого трудоспособного населения в зависимости от возраста и пола // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 6. С. 53-59.
21. Mah E., Sapper T.N., Chitchumroonchokchai C., Failla M.L., Schill K.E., Clinton S.K., et al. a-Tocopherol bioavailability is lower in adults with metabolic syndrome regardless of dairy fat co-ingestion: a randomized, double-blind, crossover trial // Am. J. Clin. Nutr. 2015. Vol. 102, N 5. P. 1070-1080. doi: 10.3945/ajcn.115.118570.
22. Светикова А.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Переверзева О.Г., Погожева А.В. и др. Витаминный статус и минеральная плотность костной ткани у больных с ожирением и сердечно-сосудистой патологией // Вопр. питания. 2008. T. 77, № 3. C. 39-44.
23. Zhang D., Nong X., van Dommelen K., Gupta N., Stamper K., Drady G.F. et al. Lipogenic transcription factor ChREBP mediates fructose-induced metabolic adaptations to prevent hepatotoxicity // J. Clin. Invest. 2017. Vol. 127, N 7. P. 2855-2867.
References
1. Anderson P.J., Critchley J.A., Chan J.C., Cockram C.S., Lee Z.S., Thomas G.N., et al. Factor analysis of the metabolic syndrome: obesity vs insulin resistance as the central abnormality. Int J Obes. 2001; 25: 1782-8.
2. Carr D.B., Utzschneider K.M., Hull R.L, Kodama K., Retzlaff B.M., Brunzell J.D., et al. Intra-abdominal fat is a major determinant of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III criteria for the metabolic syndrome. Diabetes. 2004; 53 (8): 2087-94.
3. Nesto R.W. The relation of insulin resistance syndromes to risk of cardiovascular disease. Rev Cardiovasc Med. 2003; 4 (6): S11-8.
4. Metabolic Syndrome. In: G.E. Roytberg (ed.). Moscow: MEDpress-inform, 2007: 224 p. (in Russian)
5. Rask-Madsen C., Kahn R. Tissue-specific insulin signaling, metabolic syndrome and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32 (9): 2052-9.
6. Wong S.K., Chin K.-Y., Suhaimi F.H., Fairus A., Ima-Nirwana S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutr Metab. 2016; 13: 65.
7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Re-search (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington: National Academies Press, 2011.
8. Russian Federation Ministry of Health Order on 01.04.2016 N 193n «On approval of the Rules of laboratory practice». (in Russian)
9. Kravchenko L.V., Aksenov I.V., Trusov N.V., Guseva G.V., Avren'eva L.I. The effect of the amount of fat in the diet on the activity of enzymes of xenobiotics metabolism and antioxidant protection in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2012; 81 (1): 24-29. (in Russian)
10. Apryatin S.A., Mzhelskaya K.V., Vrzhesinskaya O.A., Beketova N.A., Kosheleva O.V., Kudan P.V., et al. Indicators of vitamins safety in experimental alimentary hyperlipidemia in rodents. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (1): 6-16. (in Russian)
11. Apryatin S.A., Mzhelskaya K.V., Trusov N.V., Balakina A.S., Kulakova S.N., Soto H.S., et al. Comparative characteristics of in vivo models of hyperlipidemia in Wistar rats and C57bl/6 mice. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (6): 14-23 (in Russian).
12. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q., Guo S.M., Zhang J.X., et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex. Asian J Drug Metab Pharmacokinet. 2004; 4: 215-8.
13. Sanchez-Lozada L.G., Tapia E., Jimenez A., Bautista P., Cristobal M., Nepomuceno T., et al. Fructose-induced metabolic syndrome is associated with glomerular hypertension and renal microvascular damage in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2007; 292: F423-9.
14. Mamikutty N., Thent Z.C., Sapri S.R., Sahruddin N.N., Mohd Yusof M.R., Haji Suhaimi F. The establishment of metabolic syndrome model by induction of fructose drinking water in male Wistar rats. Biomed Res Int. 2014: 263897.
15. Rutledge A.C., Khosrow A. Fructose and the metabolic syndrome: pathophysiology and molecular mechanisms. Nutr Rev. 2007; 65 (6): S13-23.
16. Vachirayonsti T., Ho K.W., Yang D., Yan B. Suppression of the preg-nane X receptor during endoplasmic reticulum stress is achieved by down-regulating hepatocyte nuclear factor-4a and up-regulating liver-enriched inhibitory protein. Toxicol Sci. 2015; 144 (2): 382-92.
17. Jover R., Moya M., Gomez-Lechon M.J. Transcriptional regulation of cytochrome P-450 genes by nuclear factor 4-alpha. Curr Drug Metab.2009; 10 (5): 508-19.
18. Kucera O., Cervinkova Z. Experimental models of non-alcoholic fatty liver disease in rats. World J Gastroenterol. 2014; 20 (26): 8364-76.
19. Apryatin S.A., Trusov N.V., Balakina A.S., Riger N.A., Gmoshinski I.V. Change in the transcriptome profile of the liver of Wistar rats with experimental alimentary hyperlipidemia. In: All-Russian Conf. with International Participation Materials «Preventive Medicine-2016», pt 1. Saint Petersburg, 2016: 34-9. (in Russian)
20. Beketova N.A., Spiricheva T.V., Pereverzeva O.G., Kosheleva O.G., Vrzhesinskaya O.A., Kharitonchik L.A., et al. Study of the availability of water- and fat-soluble vitamins of adult able-bodied population depending on age and sex. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2009; 78 (6): 53-9. (in Russian)
21. Mah E., Sapper T.N., Chitchumroonchokchai C., Failla M.L., Schill K.E., Clinton S.K., et al. a-Tocopherol bioavailability is lower in adults with metabolic syndrome regardless of dairy fat co-ingestion: a randomized, double-blind, crossover trial. Am J Clin Nutr. 2015; 102 (5): 1070-80. doi: 10.3945/ajcn.115.118570.
22. Svetikova A.A., Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M., Beketova N.A., Pereverzeva O.G., Pogozheva A.V., et al. Vitamin status and bone mineral density in patients with obesity and cardiovascular pathology. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2008. Vol. 77 (3): 39-44. (in Russian)
23. Zhang D., Nong X., van Dommelen K., Gupta N., Stamper K., Drady G.F., et al. Lipogenic transcription factor ChREBP mediates fructose-induced metabolic adaptations to prevent hepatotoxicity. J Clin Invest. 2017; 127 (7): 2855-67.
