CC BY
640
Для корреспонденции
Ригер Николай Александрович - доктор медицинских наук,
старший научный сотрудник лаборатории иммунологии
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Россия, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-68
E-mail: riger@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-7149-2485
Ригер Н.А., Шипелин В.А., Апрятин С.А., Гмошинский И.В.
Иммунологические маркеры алиментарно-индуцированной гиперлипидемии у крыс линии Вистар
Immunological markers of alimentary-induced hyperlipidemia in Wistar rats
Riger N.A., Shipelin V.A., Apryatin S.A., Gmoshinski I.V.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва, Россия
Federal Research Centre for Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow, Russia
Изменения концентраций основных групп цитокинов и адипокинов в плазме крови при гиперлипидемии и ожирении могут коррелировать с выраженностью обменных нарушений.
Цель исследования - оценка значимости грелина, лептина, их соотношения (Ь/СН), а также цитокинового профиля в качестве биомаркеров при алиментарно-индуцированной гиперлипидемии.
Материал и методы. В работе использовали 48 самок крыс линии Вистар с исходной массой тела 123±1 г, которые были разделены на 6 групп. Животные 1-й группы (контроль) получали сбалансированный полусинтетический рацион по ЛШ93; 2-й группы - рацион с избытком жиров (30% по массе); 3-й группы - рацион с добавлением 20% раствора фруктозы вместо питьевой воды; 4-й группы - рацион с избытком жиров и фруктозой; 5-й группы - рацион с добавкой холестерина (0,5%), 6-й группы - рацион с холестерином и фруктозой. На 64-й день эксперимента определяли массу внутренних органов, концентрацию цитокинов и адипокинов в плазме крови методом мультиплексного иммуноанализа.
Результаты и обсуждение. Выявлено снижение концентрации лептина в плазме крови животных 5-й группы по сравнению с животными контрольной, 2, 4 и 6-й групп (р<0,05). Самый низкий уровень грелина обнаружен у крыс 2-й группы (р<0,05) на фоне высоких концентраций лептина. Выявлены корреляционные связи между Ь/СН и общей массой животных (г=0,321;р=0,034), относительной массой жировой ткани (г=0,439; р=0,003) и относительной массой селезенки (г=-0,460; р=0,003). У крыс 2-й группы при максимальном отношении Ь/СН выявлено статистически значимо большее количество жировой ткани, тогда как у животных 3-й и 5-й групп при самом низком Ь/СН относительное количество общего жира было наименьшим. Значения Ь/СН коррелировали с концентрацией моноцитарного хемотаксического протеина-1 (МСР-1), регулятора актива-
Для цитирования: Ригер НА., Шипелин В.А., Апрятин С.А., Гмошинский И.В. Иммунологические маркеры алиментарно-индуцированной гиперлипидемии у крыс линии Вистар // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 44-52. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10028. Статья поступила в редакцию 13.03.2019. Принята в печать 20.05.2019.
For citation: Riger N.A., Shipelin V.A., Apryatin S.A., Gmoshinski I.V. Immunological markers of alimentary-induced hyperlipidemia in Wistar rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 44-52. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10028. (in Russian) Received 13.03.2019. Accepted 20.05.2019.
ции экспрессии и секреции нормальных T-клеток (RANTES), интерлейкина-18 и макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF). Концентрации интерлейкинов-17, -18, -4, -5; макрофагального белка воспаления-3а, интерфе-рона-у, M-CSF и RANTES были снижены по сравнению с контролем в опытных группах, причем в наибольшей степени в 5-й группе на фоне самого низкого значения L/Gh.
Заключение. Наличие значимой корреляционной зависимости между L/Gh и изменениями массы тела, селезенки, жировой ткани крыс, а также уровнями цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, подтверждает информативность L/Gh в качестве биомаркера на in vivo модели дислипидемии. Ключевые слова: гиперлипидемия, холестерин, лептин, грелин, цитокины, крысы
Changes in plasma levels of the main groups of cytokines and adipokines may correlate with the severity of metabolic disorders in hyperlipidemia and obesity. The aim of the study was to assess the significance of ghrelin, leptin, their ratio (L/Gh), and the cytokine profile as biomarkers at dietary-induced hyperlipidemia. Material and methods. We used 48 female Wistar rats with an initial body weight of 123±1 g, which were divided into 6 groups. Group 1 (control) received a balanced semi-synthetic diet according to AIN93; group 2 - diet with excess fat (30% by weight); group 3 - a diet with the addition of 20% fructose solution instead of drinking water, group 4 - a diet with excess fat and fructose, group 5 - a diet with added cholesterol (0.5%), group 6 - a diet with cholesterol and fructose. On the 64th day of the experiment, the mass of internal organs was determined; the levels of cytokines and adipokines in blood plasma were measured by multiplex immunoassay.
Results and discussion. A decrease in the level of leptin was found in group 5 compared with the control and with groups 2, 4 and 6 groups (p<0.05). The lowest level of ghrelin was found in group 2 (p<0.05) against the background of high concentrations of leptin. Significant correlations were found between L/Gh and the total mass of animals (r=0.321;р=0.034), the relative mass of adipose tissue (r=0.439;р=0.003) and with the relative mass of the spleen (r=-0.460; р=0.003). In group 2, at the maximum L/Gh ratio, a significantly higher weight of adipose tissue was found, whereas in groups 3 and 5, at the lowest L/Gh ratio, the relative amount of total fat was the lowest. L/Gh ratio correlated with the level of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), RANTES, IL-18 and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The concentrations of IL-17, IL-18, IL-4, IL-5, MIP-3a, IFN-y, M-CSF and RANTES in the experimental groups were reduced compared with the control, with the most pronounced effect in group 5 together with the lowest L/Gh ratio.
Conclusion. The presence of a significant correlation between L/Gh ratio and changes in the weight of rats' body, spleen, adipose tissue, as well as levels of cytokines involved in inflammation regulation, confirms the importance of L/Gh ratio as a biomarker in an in vivo model of dyslipidemia.
Keywords: hyperlipidemia, cholecterol, leptin, ghrelin, cytokines, rats
Метаболический синдром (МС) представляет собой состояние, характеризуемое висцеральным ожирением, артериальной гипертензией, дислипидемией, гипергликемией и резистентностью к инсулину. Избыток жировой ткани и прогрессирование МС ведут к нарушению соотношения уровней ряда групп цитокинов и ади-покинов [1, 2], список которых постоянно расширяется, а их экспрессия взаимосвязана с количеством резидентных лейкоцитов, мигрирующих из сосудистого русла в жировую клетчатку, и ее гетерогенностью [3]. Выработка провоспалительных цитокинов [4, 5], маркеров прооксидантного статуса (продукты окисления липидов, мочевая кислота) [6, 7] и факторов тромбогенного риска [8], увеличивается при ожирении вместе с повышением концентрации лептина и нарастанием резистентности к нему [1]. Вместе с тем экспрессия противовоспалительных цитокинов [в частности интерлейкина-10
(IL-10)], грелина, адипонектина и продукция антиокси-дантных факторов (параоксоназа/арилэстераза-1 - PON-1) уменьшаются при прогрессировании МС [9, 10].
Важнейшими белковыми гормоноподобными факторами, участвующими в поддержании энергетического гомеостаза организма, являются лептин, грелин и ади-понектин. Механизмы взаимодействия лептина и гре-лина в регуляции метаболизма и расходования энергии менее изучены по сравнению с совместным действием лептина и адипонектина [11-14]. Анорексическое действие лептина обусловлено угнетением грелин-инду-цированной экспрессии нейропептида Y нейронами дугообразных ядер гипоталамуса (NPY-нейроны), играющими основную роль в стимуляции аппетита [15]. В исследованиях по оценке программ уменьшения массы тела было отмечено, что увеличение отношения лептин/грелин (L/Gh) является предвестником сниже-
ния эффективности лечения и последующего нарастания жировой массы [16]. В связи с этим представляется целесообразной оценка изменения концентрации и соотношения лептина и грелина в крови в качестве биомаркеров развития нарушений метаболизма, обусловленных дислипидемией и ожирением.
Цель данного исследования - экспериментальная оценка значимости уровней грелина, лептина, их соотношения, а также цитокинового профиля в качестве биомаркеров при алиментарно-индуцированной гипер-липидемии у крыс.
Материал и методы
Исследования проведены на 48 крысах-самках линии Вистар с исходной массой тела 123±1 г (М±т), полученных из питомника лабораторных животных Филиал «Столбовая» ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Работу с животными выполняли в соответствии с руководством [17] и Правилами надлежащей лабораторной практики (приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н). Животных содержали по 2 особи в клетке при температуре 20-22 °С и режиме освещения 12/12 ч.
Животных распределили на 6 групп по 8 особей. Исходная масса тела животных в группах не различалась (р>0,05, АЫОУА). В течение 63 дней по ранее описанной методике [18] животные 1-й группы (контроль) получали стандартный полусинтетический рацион по А!Ы93 [19];
10 п
8 -
6 -
4 -
2 -
□ Gh □ L
1
Рис. 1. Концентрация грелина (йИ) и лептина (1_) в плазме крови крыс
По оси абсцисс: номера групп животных (1-я - контроль; 2-я - избыток жира; 3-я - избыток фруктозы; 4-я - избыток жира и фруктозы; 5-я - избыток холестерина; 6-я - избыток холестерина и фруктозы); по оси ординат - концентрация, пг/мл, Ме, т1п-тах. Статистически значимые отличия (р<0,05) согласно критерию Манна-Уитни от показателя животных: * - из 1-й группы; ** - 5-й группы; # - 2-й группы.
2-й группы - модифицированный рацион с избытком жиров (30% по массе сухого корма) за счет сниженного количества крахмала; 3-й группы - стандартный рацион с добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды, 4-й группы - рацион с избытком жиров с добавлением 20% раствора фруктозы, 5-й группы - модифицированный рацион с избытком холестерина (0,5% по массе сухого корма), 6-й группы - рацион с избытком холестерина и добавлением 20% раствора фруктозы вместо воды. Все исследуемые рационы были изо-калорийными в потребляемых количествах. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с добавлением 10% по объему антикоагулянта - 1% раствора гепарина в стерильном 0,15 М NaCl. После этого кровь центрифугировали при 600g в течение 15 мин для отделения плазмы. Образцы плазмы хранили при температуре -24 °С. У всех животных определяли массу внутренних органов (печень, селезенка, сердце, почки, тимус, легкие, головной мозг, жир подкожно-паховый, брыжеечный и забрюшинный) на электронных весах с точностью ±0,01 г.
Для определения уровня цитокинов и ростовых факторов использовали набор «Bio-Plex Pro Rat Cytokine Grp I Panel 24-Plex»; для определения уровня маркеров диабета (лептин, грелин) - набор «Bio-Plex Pro™ Reagent Kit», дополняемый реагентами: Pro-Rat 33-Plex Standarts, Rat Diabetes Ghrelin SET и Rat Diabetes Leptin SET (BioRad Laboratories, Inc., США). Исследования проводили на мультиплексном анализаторе «Luminex 200» (Luminex Corporation, США) с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Статистическую обработку полученных данных и корреляционный анализ выполняли с помощью программы SPSS 20.0 (SPSS Inc., США). Концентрацию адипокинов и цитокинов оценивали по медиане (Me) и интервалом изменений (min-max). Достоверность различия эмпирической функции распределения в группах животных оценивали с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Пороговое значение вероятности отклонения нулевой гипотезы было принято равным p<0,05. Статистически значимыми коэффициенты корреляции (r) принимали при p<0,05.
Результаты
У животных, получавших экспериментальные рационы, содержащие избыток жира, фруктозы, холестерина и их сочетания, были выявлены увеличение массы жировой ткани, накопление липидов в печени и характерные изменения в биохимических показателях плазмы крови, данные о которых были представлены в ранее опубликованной работе [18]. При сравнении показателей большинства опытных групп с контролем не выявлено значимых различий концентрации лептина и грелина, за исключением 5-й группы, у животных которой уровень лептина был достоверно снижен (рис. 1). Обнаруженное
#
0
снижение уровня лептина в 5-й группе было статистически значимым не только по сравнению с контролем, но и с показателями крыс 2, 4 и 6-й групп (р<0,05).
Статистически значимые различия концентрации гре-лина выявлены между 2-й и 6-й группами (р<0,05), причем при избытке жира в рационе выявлен самый низкий уровень грелина [Ме=1,11 (0,22-1,79) пг/мл] и наиболее высокая медиана концентрации лептина [Ме=4,9 (1,01-6,98) пг/мл]. При избытке холестерина отмечен самый низкий уровень лептина в плазме [Ме=1,17 (0,39-3,46) пг/мл] (см. рис. 1).
Изменения соотношения концентраций лептина и грелина (1_ЮИ) и относительной массы общего жира в зависимости от рационов сопоставлены на рис. 2. При избытке жирового компонента в рационе (2-я группа) медиана соотношения в плазме была выше по сравнению с контролем и большинством опытных групп, однако различия не достигали уровня статистической значимости. Избыток фруктозы, холестерина и сочетание этих компонентов способствовали снижению отношения 1_/ЗИ. При избытке холестерина (5-я группа) показатель 1_/ЗИ был статистически значимо ниже по сравнению с таковым при избытке жира в рационе (2-я группа, р<0,05).
Участие лептина и грелина в метаболических процессах накопления липидов и энергетических ресурсов подтверждается обнаружением положительной корреляции между индивидуальными значениями отношения и показателями общей массы животных (г=0,321; р=0,034) и относительной массы жировой ткани (г=0,439; р=0,003). У животных 2-й группы при максимальном отношении [Ме=3,1 (0,26-7,21)] выявлено достоверно большее относительное количество жировой ткани, а в 3-й и 5-й группах при самом низком отношении относительное количество общего жира было, соответственно, наименьшим, причем у животных 5-й группы относительная масса общего жира была статистически значимо меньше по сравнению с показателем у крыс 2-й и 4-й групп (рис. 2).
Выявлены корреляционные связи между значениями 1_/ЗИ, массой органов и тканей и концентрациями ряда цитокинов в плазме. Так, в частности:
- отношение коррелировало с концентрацией мо-ноцитарного хемотаксического протеина-1 (МСР-1) (г=0,36; р=0,015) и регулятора активации экспрессии и секреции нормальных Т-клеток (РАЫТЕв) (г=0,37; р=0,014);
- общая масса тела в конце эксперимента - с концентрацией !Ы8 (г=0,32; р=0,036) и РАЫТЕв (г=0,32; р=0,036);
- относительная масса селезенки - с концентрацией макрофагального колониестимулирующего фактора (М-СвР) (г=-0,33; р=0,031) и отношением (г=-0,460; р=0,003).
Наряду с этим установлены групповые различия по концентрациям в плазме эритропоэтина, 11_-4, 11_-5, 11_-17, интерферона-у (!РЫ-у), макрофагального белка воспаления-3а (М!Р-3а), фактора некроза опухоли а (ТЫР-а), !1_-18, макрофагального колониестимули-
12 -|
10 -
8 -
6 -
4 -
2 -
□ Fat -■- L/Gh
/-=0,439; р=0,003; n=48
Рис. 2. Связь между соотношением концентраций лептина и грелина (L/Gh) и относительной жировой массой у крыс разных групп
По оси абсцисс: номера групп животных (1-я - контроль; 2-я - избыток жира; 3-я - избыток фруктозы; 4-я - избыток жира и фруктозы; 5-я - избыток холестерина; 6-я - избыток холестерина и фруктозы); по оси ординат - L/Gh (ломаная линия) и жировая масса (Fat), M±m (гистограмма) в относительных единицах; * - статистически значимое отличие (р<0,05) согласно критерию Манна-Уитни от показателя животных 5-й группы.
рующего фактора (М-СвР и РАЫТЕв) (см. таблицу). Отмечено статистически значимое по сравнению с контролем снижение уровня М-СвР в плазме животных 3, 5 и 6-й групп. Среди других провоспалитель-ных цитокинов по сравнению с контролем на фоне индуцированной гиперлипидемии достоверно (р<0,05) уменьшились концентрации 11_-17 (3-я и 5-я группы), М!Р-3а, !РЫ-у и РАЫТЕв (5-я группа), ТЫР-а (6-я группа). Наиболее выраженное снижение большинства провос-палительных пептидов выявлено в 5-й группе на фоне самых низких показателей отношения 1_/ЗИ и относительной массы общего жира (см. таблицу; см. рис. 2). Концентрация !1_-18 была статистически значимо ниже у крыс 5-й группы по сравнению с уровнем у животных 2-й и 6-й групп (см. таблицу). Уровень противовоспалительного цитокина !1_-5 у крыс 5-й группы был достоверно ниже по сравнению с крысами контрольной и 6-й групп.
Обсуждение
В настоящее время растет число доказательств, что воспаление на фоне висцерального ожирения является важнейшим патогенетическим фактором развития резистентности к инсулину при МС [20]. Избыточно накапливаемая жировая ткань выступает в роли эндокринного органа, активно продуцирующего ряд гормонов и цитокинов [3, 21]. Увеличение продукции провоспали-
0
Уровни цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл
Цитокин Группа животных (л=8)
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я
ЕРО Ме т1п-тах 0,11 0,08-0,63 0,175 0,03-0,93 0,08 0,03-0,38 0,205 0,00-0,83 0,042, 4, 6 0,00-0,30 0,195 0,00-0,59
1Ь-4 Ме тП-тах 0,07 0,00-0,23 0,046 0,00-0,10 0,036 0,02-0,08 0,05 0,02-0,07 0,046 0,01-0,49 0,072, 3, 5 0,03-1,01
!Ь-5 Ме тП-тах 0,155 0,06-0,22 0,10 0,05-0,18 0,10 0,05-0,23 0,12 0,08-0,22 0,091, 6 0,01-0,12 0,125 0,09-0,78
1Ь-17 Ме тП-тах 0,053, 5 0,02-0,26 0,045 0,02-0,10 0,021, 4, 6 0,01-0,05 0,043 0,02-0,19 0,021, 2 0,00-0,07 0,053 0,01-0,39
!Р1\1-у Ме тП-тах 0,095 0,00-0,50 0,045 0,00-0,30 0,04 0,00-0,14 0,045 0,00-0,14 01, 2, 4, 6 0,00-0,05 0,155 0,03-1,87
М!Р-3а Ме тП-тах 0,155 0,06-0,22 0,10 0,05-0,18 0,10 0,05-0,23 0,12 0,08-0,22 0,091, 6 0,01-0,12 0,125 0,09-0,78
Т^-а Ме тП-тах 0,056 0,01-0,14 0,03 <0,006-0,09 0,03 <0,006-0,08 0,076 <0,006-1,80 0,04 <0,006-0,07 0,011, 4 <0,006-0,07
!Ь-18 Ме тП-тах 0,14 0,06-0,73 0,415 0,00-1,11 0,29 0,11-0,98 0,45 0,00-1,44 0,172, 6 0,00-0,57 0,435 0,00-0,85
М-СБР Ме т п-тах 1,073, 5, 6 0,88-1,27 0,91 0,29-1,32 0,881, 6 0,70-1,14 0,836 0,72-1,24 0,781 0,51-0,89 0,641, 3, 4 0,52-0,91
ВА1\1ТЕБ Ме т п-тах 1,195 0,43-2,43 0,67 0,26-0,99 0,62 0,21-1,21 0,77 0,32-2,04 0,371 0,20-1,28 0,55 0,35-2,84
МСР-1 Ме т п-тах 1,17 0,59-2,03 0,68 0,49-2,02 1,06 0,35-2,08 1,41 0,13-3,60 0,94 0,43-1,65 0,81 0,46-1,49
П р и м е ч а н и е. Надстрочные индексы - номера групп, различия между показателями которых статистически значимы (р<0,05) согласно критерию Манна-Уитни; ЕРО - эритропоэтин; И - интерлейкин; 1РЫ-у - интерферон-у; М1Р-3а - макрофагальный белок воспаления-3а; ТЫЕ-а - фактор некроза опухоли а; М-СЭЕ - макрофагальный колониестимулирующий фактор; ЯАЫТЕЭ -регулятор активации экспрессии и секреции нормальных Т-клеток; МСР-1 - моноцитарный хемотаксический протеин-1.
тельных цитокинов [4, 5], повышение концентрации леп-тина и нарастание резистентности к нему коррелируют с выраженностью обменных нарушений [1, 9, 10].
В полученных нами данных из 24 цитокинов и ростовых факторов в плазме крыс статистически значимые различия между показателями животных контрольной и опытных групп были выявлены для ЕРО, 11_-4, 11_-5, 11_-17, IРЫ-у, М1Р-3а, ТЫР-а, 11-18, М-СвР и РАЫТЕв (см. таблицу). Однако взаимосвязь с накоплением жировых отложений и динамикой отношения массы тела и органов обнаружена только для МСР-1, М-СвР, 11_-18 и РАЫТЕв. По своему иммунологическому механизму индуцированное ожирением воспаление имеет много общего с классическими воспалительными реакциями, вызванными патогенами различной природы. Однако при вялотекущем воспалении в жировой ткани продуцируется значительно меньшее количество цитокинов [20].
Иммунокомпетентным клеткам, мигрирующим в жировую клетчатку из периферической крови, отводится главная роль в регуляции индуцированного ожирением воспаления. В избыточно накапливаемой жировой ткани возрастает количество и активность макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов, тучных клеток, эози-нофилов, ТИ1/ТИ2/Тгедз-популяций Т-клеток и В-клеток. Выраженность воспаления в жировой ткани зависит от соотношения про- и противовоспалительных клеточных
субпопуляций, однако при ожирении этот иммунорегуля-торный баланс чаще сдвинут в сторону провоспалитель-ного статуса [22].
Степень повышения циркулирующих провоспали-тельных факторов при ожирении может быть незначительной и не отражать в полной мере характер обменных изменений, развивающихся на фоне МС. Вследствие этого большинство цитокинов не могут выступать в роли высокоспецифичных биомаркеров метаболических нарушений. Использование альтернативных моделей гиперлипидемии и МС у крыс (кормление высокожировым, высокохолестериновым рационами в комбинации с добавкой фруктозы) выявило ряд различий между опытными группами в цитокиновом и адипокиновом профилях (см. рис. 1; см. таблицу). Это подтверждает возникающие нарушения иммунитета при различной степени ожирения и гиперлипиде-мии. Однако четкой зависимости между концентрацией большинства исследуемых цитокинов и изменением массы органов и тканей в проведенном исследовании не обнаружено, за исключением крыс, получавших избыток холестерина в рационе (5-я группа). В этой группе животных меньшее относительное количество жира прямо коррелирует с отношением и сочетается со значимым снижением уровня большинства ци-токинов в плазме. В остальных группах такого явления не наблюдалось.
Результаты оценки уровня циркулирующих адипо-кинов на in vivo моделях индуцированного рационом ожирения и в клинических исследованиях подтвердили, что изменения в соотношении лептина и адипонектина (L/A) более информативны по сравнению с динамикой концентрации каждого из этих маркеров в сыворотке по отдельности [12, 14]. Лимитирующими факторами использования отношения L/A являются более высокая концентрация адипонектина у самок животных и лиц женского пола и более значимая ассоциация с МС у женщин, чем у мужчин [11, 13]. В проведенных нами исследованиях не выявлено значимых различий концентраций лептина и грелина в плазме животных контрольной и большинства опытных групп, за исключением 5-й группы (рацион с избытком холестерина), у крыс которой уровень лептина был достоверно снижен по сравнению с контролем, а также с показателями животных 2, 4 и 6-й групп (см. рис. 1). Поэтому оценка абсолютных концентраций, как свидетельствуют результаты исследований, по аналогии с концентрациями лептина и адипонектина, про- и противовоспалительных цитокинов остается недостаточно информативной для мониторинга течения МС [12, 14]. Как правило, при исследовании in vivo цитокинового и адипокинового спектра, про- и антиоксидантной активности наблюдается широкая индивидуальная дисперсия показателей [20, 23]. Похожая ситуация была обнаружена в ранее проведенных нами исследованиях на мышах C57BI/6 [24]: показатели цитокинового профиля, концентрации лептина и грелина в большинстве случаев не различались у животных контрольной и опытных групп.
Основной результат антагонизма лептина и грелина проявляется в регуляции потребления пищи, накопления жировой ткани и расхода энергии. Лептин супрес-сирует эффект грелина через метаболические пути фосфоинозитид-З-киназы/Akt (PI3k/Akt) и фосфодиэ-стеразы 3 (PDE3) [20]. Кроме того, низкая концентрация глюкозы потенцирует активирующее действие грелина, а инсулин, наоборот, усиливает супрессорное влияние лептина на NPY-нейроны [16]. Иммуногистохимиче-ские исследования свидетельствуют, что грелин-спец-ифические рецепторы (GHSR) и рецепторы к лептину (OB-Rb) коэкспрессируются более чем в 90% нейронов дугообразных ядер гипоталамуса [25]. Такая тесная взаимосвязь отражает значимость отношения L/Gh в качестве биомаркера. Это подтверждается положительной корреляцией между отношением L/Gh и массой тела животных, а также относительной массой жировой ткани. По окончании эксперимента у животных 2-й группы при максимальном отношении L/Gh (см. рис. 2) выявлено статистически значимо большее относительное количество жировых отложений по сравнению с крысами из 5-й группы, у которых выявлено достоверно самое низкое значение L/Gh. Взаимосвязь между изменением L/Gh и массой органов и тканей во многом может быть обусловлена участием лептина и грелина в регуляции ангиогенеза и формировании
фиброзных изменений, которые наблюдаются при ожирении и МС. В частности, грелин обладает проангио-генными и антифибротическими свойствами за счет участия в активации сигнального пути Вс1-2 (белок, регулятор апоптоза), супрессирующего процессы апо-птоза [26]. Системное введение грелина мышам, получающим обогащенный жирами рацион, способствовало увеличению уровня фактора роста эндотелия (VEGF) и снижению концентрации лептина и окиси азота (!!) в сыворотке крови [27].
На этом фоне закономерным фактом становится значимая обратная корреляция между показателем и относительной массой селезенки. При этом выявлена отрицательная корреляция между уровнем М-СвР в плазме и относительной массой селезенки. На фоне диет, индуцирующих гиперлипидемию, уровень М-СвР снижался по сравнению с контролем у животных во всех опытных группах, кроме 2-й группы, что согласуется с данными работы [28] и отрицательно коррелирует с ранее выявленным накоплением жира в печени крыс [18].
Механизмы влияния рационов с повышенной энергетической плотностью и уровнем холестерина на гемо-поэз и активную миграцию лейкоцитов в строму жировой ткани пока не вполне ясны [29, 30]. Исследование экспрессии в костном мозге мРНК гемопоэтических ростовых факторов и лептина при ожирении не выявило различий в содержании гранулоцитарно-моно-цитарных колониестимулирующих факторов ^-СвР, GM-CвР и М-СвР), хотя был обнаружен достоверно повышенный уровень мРНК лептина по сравнению с контролем [31]. Возможно, в избыточных концентрациях лептин выступает в роли хемоаттрактанта, увеличивающего выход зрелых клеток крови из костного мозга в сосудистое русло с последующей миграцией в жировую ткань.
Лептин и грелин наравне с цитокинами обладают плейотропной активностью и участвуют в механизмах регуляции хронического вялотекущего воспаления [22, 32]. Структурно лептин содержит 4 а-спиральных домена - 2 пары а-спиралей, расположенных под углом друг к другу. Эти домены обладают большим сходством с участками а-спиралей длинных цепей большинства цитокинов и хемокинов [20, 23]. Рецепторы лептина ОВ-РЬ, помимо их высокой экспрессии в ядрах гипоталамуса, обнаруживаются на различных субпопуляциях Т-, В- и ЫК-лимфоцитов, дендритных клетках, моноцитах/макрофагах и гранулоцитах у грызунов и человека [32]. Известно, что цитокины !1_-18, МСР-1, РАЫТЕв и М-СвР также содержат а-спиральные домены, а их рецепторные структуры имеют большое сходство с рецепторами лептина. Поэтому корреляционная зависимость между отношением показателями абсолютной и относительной массы органов и тканей и достоверно изменяющимися концентрациями И.-18, МСР-1, РАЫТЕв и М-СвР в плазме крови крыс свидетельствует о роли лептина наравне с перечисленными цитокинами в регуляции иммунного ответа
[32]. Дальнейшие исследования механизмов развития лептин/лептин-рецептор и грелин/грелин-рецептор резистентности позволят использовать эти сигнальные пути как мишени для целевого воздействия на патофизиологию иммунных и метаболических расстройств при МС и ожирении.
Заключение
Таким образом, в проведенном исследовании выявлен специфический характер изменений соотношения лептина и грелина у крыс на альтернативных моделях дислипидемии, вызванной потреблением жира, легкоусвояемых углеводов или холестерина. Наличие корреляционных взаимосвязей отношения
L/Gh с изменениями массы тела, селезенки и жировой ткани, а также уровнями цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, указывает на информативность отношения L/Gh как биомаркера направленности и тяжести обменных нарушений при МС и ожирении.
Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема ФАНО России № 0529-2015-0006 «Поиск новых молекулярных маркеров алиментарно-зависимых заболеваний: геномный и постгеномный анализ»).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия):
Ригер Николай Александрович (Riger Nikolay A.) - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: rieger_63@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7149-2485
Апрятин Сергей Алексеевич (Apryatin Sergey A.) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа E-mail: apryatin@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6543-7495
Шипелин Владимир Александрович (Shipelin Vladimir A.) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: v.shipelin@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0015-87354
Гмошинский Иван Всеволодович (Gmoshinski Ivan V.) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Литература
Srikanthan K., Feyh A., Visweshwar H., Sodhi K. Systematic 8. review of metabolic syndrome biomarkers: a panel for early detection, management, and risk stratification in the West Virginian population // Int. J. Med. Sci. 2016. Vol. 13, N 1. P. 25-38. Cui H., Lopez M., Rahmouni K. The cellular and molecular bases 9. of leptin and ghrelin resistance in obesity // Nat. Rev. Endocrinol. 2017. Vol. 13, N 6. P. 338-351.
Deng Y., Scherer P.E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2011. 10. Vol. 1226, N 1. P. 50-69.
Aroor A.R., McKarns S., Demarco V.G., Jia G., Sowers J.R. Maladaptive immune and inflammatory pathways lead to cardiovascular insulin resistance // Metabolism. 2013. Vol. 62, N 11. P. 1543-1552. Musialik K. The influence of chosen adipocytokines on blood pres- 11. sure values in patients with metabolic syndrome // Kardiol. Pol. 2012. Vol. 70, N 12. P. 1237-1242.
Kelly A.S., Jacobs D.R., Sinaiko A.R., Moran A., Steffen L.M., Steinberger J. Relation of circulating oxidized LDL to obesity and insulin resistance in children // Pediatr. Diabetes. 2010. Vol. 11, 12. N 8. P. 552-555.
Silva H.A., Carraro J.C., Bressan J., Hermsdorff H.H. Relation between uric acid and metabolic syndrome in subjects with cardio- 13. metabolic risk // Einstein. 2015. Vol. 13, N 2. P. 202-208.
Lallukka S., Luukkonen P.K., Zhou Y., Isokuortti E., Leivonen M., Juuti A. et al. Obesity/insulin resistance rather than liver fat increases coagulation factor activities and expression in humans // Thromb. Haemost. 2017. Vol. 117, N 2. P. 286-294. Gotoh K., Fujiwara K., Anai M., Okamoto M., Masaki T., Kakuma T. et al. Role of spleen-derived IL-10 in prevention of systemic low-grade inflammation by obesity // Endocr. J. 2017. Vol. 64, N 4. P. 375-378.
Martinelli N., Micaglio R., Consoli L., Guarini P., Grison E., Piz-zolo F. et al. Low levels of serum paraoxonase activities are characteristic of metabolic syndrome and may influence the metabolic-syndrome-related risk of coronary artery disease // Exp. Diabetes Res. 2012. Vol. 2012. Article ID 231502.
Cicero A.F., Magni P., More M., Ruscica M., Borghi C., Strollo F. et al. Metabolic syndrome, adipokines and hormonal factors in pharmacologically untreated adult elderly subjects from the Bri-sighella Heart Study historical cohort // Obes. Facts. 2012. Vol. 5, N 3. P. 319-326.
Falahi E., Khalkhali Rad A.H., Roosta S. What is the best bio-marker for metabolic syndrome diagnosis? // Diabetes Metab. Syndr. 2015. Vol. 9, N 4. P. 366-372.
Finucane F.M., Luan J., Wareham N.J., Sharp S.J., O'Rahilly S., Balkau B. et al. Correlation of the leptin: adiponectin ratio with
1.
2.
4.
6.
7
measures of insulin resistance in non-diabetic individuals // Dia-betologia. 2009. Vol. 52, N 11. P. 2345-2349.
14. Kotani K., Sakane N. Leptin: adiponectin ratio and metabolic syndrome in the general Japanese population // Korean J. Lab. Med. 2011. Vol. 31, N 3. P. 162-166.
15. Kohno D., Nakata M., Maekawa F., Fujiwara K., Maejima Y., Kuramochi M. et al. Leptin suppresses ghrelin-induced activation of neuropeptide Y neurons in the arcuate nucleus via phosphati-dylinositol 3-kinase- and phosphodiesterase 3-mediated pathway // Endocrinology. 2007. Vol. 148, N 5. P. 2251-2263.
16. Williams R.L., Wood L.G., Collins C.E., Morgan PJ., Callister R. Energy homeostasis and appetite regulating hormones as predictors of weight loss in men and women // Appetite. 2016. Vol. 101. P. 1-7.
17. Guide for the care and use of laboratory animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.
18. Апрятин С.А., Мжельская К.В., Трусов Н.В., Балакина А.С., Кулакова С.Н., Сото Х.С., и др. Сравнительная характеристика in vivo моделей гиперлипидемии у крыс линии Вистар и мышей линии C57Bl/6 // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 24-33.
19. Reeves P.C. AIN-93 Purified Diets for the Study of Trace Elements Metabolism in Rodents. Trace Elements in Laboratory Rodents / ed. R.R. Watson. CRC Press, 1997. P. 3-34.
20. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity-induced insulin resistance // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1842, N 3. P. 446-462.
21. Ouchi N., Parker J.L., Lugus J.J., Walsh K. Adipokines in inflammation and metabolic disease // Nat. Rev. Immunol. 2011; 11 (2): 85-97.
22. Li L., Duan M., Chen W., Jiang A., Li X., Yang J. et al. The spleen in liver cirrhosis: revisiting an old enemy with novel targets // J. Transl. Med. 2017. Vol. 15, N 1. P. 111-120.
23. López-Jaramillo P., Gómez-Arbeláez D., López-López J., López-López C., Martínez-Ortega J., Gómez-Rodríguez A. et al. The role
of leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and diabetes // Horm. Mol. Biol. Clin. Invest. 2014. Vol. 18, N 1. P. 37-45.
24. Ригер Н.А., Евстратова В.С., Апрятин С.А., Гмошинский И.В., Ханферьян Р.А. Значение соотношения концентраций лептина и грелина как биомаркера при индуцированной диетой гиперлипидемии у самок мышей C57Black/6J // Мед. иммунология. 2018. T. 20, № 3. С. 341-352.
25. Perello M., Scott M.M., Sakata I., Lee C.E., Chuang J.C., Osborne-Lawrence S. et al. Functional implications of limited leptin receptor and ghrelin receptor coexpression in the brain // J. Comp. Neurol. 2012. Vol. 520. P. 281-294.
26. Katare R., Rawal S., Munasinghe P.E., Tsuchimochi H., Inagaki T., Fujii Y. et al. Ghrelin promotes functional angiogenesis in a mouse model of critical limb ischemia through activation of proangiogenic microRNAs // Endocrinology. 2016. Vol. 157, N 2. P. 432-445.
27. Khazaei M., Tahergorabi Z. Systemic ghrelin administration alters serum biomarkers of angiogenesis in diet-induced obese mice // Int. J. Pept. 2013. Article ID 249565. [Электронный ресурс]. URL: https://www.hindawi.com/journals/ypep/2013/ 249565/
28. Amano S.U., Cohen J.L., Vangala P., Tencerova M., Nicoloro S.M., Yawe J.C. et al. Local proliferation of macrophages contributes to obesity-associated adipose tissue inflammation // Cell Metab. 2014. Vol. 19, N 1. P. 162-171.
29. Ye J., Gimble J.M. Regulation of stem cell differentiation in adipose tissue by chronic inflammation // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2011. Vol. 38, N 12. P. 872-878.
30. Trottier M.D., Naaz A., Kacynski K., Yenumula P.R., Frak-er P.J. Functional capacity of neutrophils from class III obese patients // Obesity (Silver Spring). 2012. Vol. 20, N 5. P. 10571065.
31. Trottier M.D., Naaz A., Li Y., Fraker P.J. Enhancement of hemato-poiesis and lymphopoiesis in diet-induced obese mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109, N 20. P. 7622-7629.
32. Pérez-Pérez A., Vilariño-García T., Fernández-Riejos P., Martín-González J., Segura-Egea J.J., Sánchez-Margalet V. Role of leptin as a link between metabolism and the immune system // Cytokine Growth Factor Rev. 2017. Vol. 35. P. 71-84.
References
Srikanthan K., Feyh A., Visweshwar H., Sodhi K. Systematic 9. review of metabolic syndrome biomarkers: a panel for early detection, management, and risk stratification in the West Virginian population. Int J Med Sci. 2016; 13 (1): 25-38.
Cui H., López M., Rahmouni K. The cellular and molecular bases 10. of leptin and ghrelin resistance in obesity. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13 (6): 338-51.
Deng Y., Scherer P.E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann NY Acad Sci. 2011; 1226 (1): 50-69. 11.
Aroor A.R., McKarns S., Demarco V.G., Jia G., Sowers J.R. Maladaptive immune and inflammatory pathways lead to cardiovascular insulin resistance. Metabolism. 2013; 62 (11): 1543-52. Musialik K. The influence of chosen adipocytokines on blood pressure values in patients with metabolic syndrome. Kardiol Pol. 2012; 12. 70 (12): 1237-42.
Kelly A.S., Jacobs D.R., Sinaiko A.R., Moran A., Steffen L.M., Steinberger J. Relation of circulating oxidized LDL to obesity 13. and insulin resistance in children. Pediatr Diabetes. 2010; 11 (8): 552-5.
Silva H.A., Carraro J.C., Bressan J., Hermsdorff H.H. Relation between uric acid and metabolic syndrome in subjects with cardio- 14. metabolic risk. Einstein. 2015; 13 (2): 202-8. Lallukka S., Luukkonen P.K., Zhou Y., Isokuortti E., Leivonen M., Juuti A., et al. Obesity/insulin resistance rather than liver fat 15. increases coagulation factor activities and expression in humans. Thromb Haemost. 2017; 117 (2): 286-94.
Gotoh K., Fujiwara K.,Anai M., Okamoto M., Masaki T., Kakuma T., et al. Role of spleen-derived IL-10 in prevention of systemic low-grade inflammation by obesity. Endocr J. 2017; 64 (4): 375-8.
Martinelli N., Micaglio R., Consoli L., Guarini P., Grison E., Piz-zolo F., et al. Low levels of serum paraoxonase activities are characteristic of metabolic syndrome and may influence the metabolic-syndrome-related risk of coronary artery disease. Exp Diabetes Res. 2012; 2012: 231502.
Cicero A.F., Magni P., More M., Ruscica M., Borghi C., Strollo F., et al. Metabolic syndrome, adipokines and hormonal factors in pharmacologically untreated adult elderly subjects from the Bri-sighella Heart Study historical cohort. Obes Facts. 2012; 5 (3): 319-26.
Falahi E., Khalkhali Rad A.H., Roosta S. What is the best bio-marker for metabolic syndrome diagnosis? Diabetes Metab Syndr. 2015; 9 (4): 366-72.
Finucane F.M., Luan J., Wareham N.J., Sharp S.J., O'Rahilly S., Balkau B., et al. Correlation of the leptin: adiponectin ratio with measures of insulin resistance in non-diabetic individuals. Diabe-tologia. 2009; 52 (11): 2345-9.
Kotani K., Sakane N. Leptin: adiponectin ratio and metabolic syndrome in the general Japanese population. Korean J Lab Med. 2011; 31 (3): 162-6.
Kohno D., Nakata M., Maekawa F., Fujiwara K., Maejima Y., Kuramochi M., et al. Leptin suppresses ghrelin-induced activation of neuropeptide Y neurons in the arcuate nucleus via phosphati-
1.
2
4
6.
7
8
dylinositol 3-kinase- and phosphodiesterase 3-mediated pathway. Endocrinology. 2007; 148 (5): 2251-63.
16. Williams R.L., Wood L.G., Collins CE., Morgan P.J., Callister R. Energy homeostasis and appetite regulating hormones as predictors of weight loss in men and women. Appetite. 2016; 101: 1-7.
17. Guide for the care and use of laboratory animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington: The National Academies Press, 2011: 248 p.
18. Apryatin S.A., Mzhel'skaya K.V., Trusov N.V., Balakina A.S., Kula-kova S.N., Soto Kh.S., et al. Comparative in vivo characterization of hyperlipidemia models in Wistar rats and C57Bl / 6 mice. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (6): 24-33. (in Russian)
19. Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements metabolism in rodents. Trace elements in laboratory rodents. Edided by R.R. Watso. CRC Press, 1997: 3-34.
20. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity-induced insulin resistance. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842 (3): 446-62.
21. Ouchi N., Parker J.L., Lugus J.J., Walsh K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 2011; 11 (2): 85-97.
22. Li L., Duan M., Chen W., Jiang A., Li X., Yang J., et al. The spleen in liver cirrhosis: revisiting an old enemy with novel targets. J Transl Med. 2017; 15 (1): 111-20.
23. López-Jaramillo P., Gómez-Arbeláez D., López-López J., López-López C., Martínez-Ortega J., Gómez-Rodríguez A., et al. The role of leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and diabetes. Horm Mol Biol Clin Invest. 2014; 18 (1): 37-45.
24. Riger N.A., Evstratova V.S., Apryatin S.A., Gmoshinskiy I.V., Khanferyan R.A. Importance of the leptin/grelin ratio as a bio-
marker in dietary induced hyperlipidemia in female C57Black/6 mice. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2018; 20 (3): 341-52. (in Russian)
25. Perello M., Scott M.M., Sakata I., Lee C.E., Chuang J.C., Osborne-Lawrence S., et al. Functional implications of limited leptin receptor and ghrelin receptor coexpression in the brain. J Comp Neurol. 2012; 520: 281-94.
26. Katare R., Rawal S., Munasinghe P.E., Tsuchimochi H., Inagaki T., Fujii Y., et al. Ghrelin promotes functional angiogenesis in a mouse model of critical limb ischemia through activation of proangiogenic microRNAs. Endocrinology. 2016; 157 (2): 432-45.
27. Khazaei M., Tahergorabi Z. Systemic ghrelin administration alters serum biomarkers of angiogenesis in diet-induced obese mice. Int J Pept. 2013: 249565 [Electronic Resource]. URL: https://www. hindawi.com/journals/ypep/2013/249565/.
28. Amano S.U., Cohen J.L., Vangala P., Tencerova M., Nicoloro S.M., Yawe J.C., et al. Local proliferation of macrophages contributes to obesity-associated adipose tissue inflammation. Cell Metab. 2014; 19 (1): 162-171.
29. Ye J., Gimble J.M. Regulation ofstem cell differentiation in adipose tissue by chronic inflammation. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011; 38 (12): 872-8.
30. Trottier M.D., Naaz A., Kacynski K., Yenumula P.R., Fraker P.J. Functional capacity of neutrophils from class III obese patients. Obesity (Silver Spring). 2012; 20 (5): 1057-65.
31. Trottier M.D., Naaz A., Li Y., Fraker P.J. Enhancement of hema-topoiesis and lymphopoiesis in diet-induced obese mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109 (20): 7622-9.
32. Pérez-Pérez A., Vilariño-García T., Fernández-Riejos P., Martín-González J., Segura-Egea J.J., Sánchez-Margalet V. Role of leptin as a link between metabolism and the immune system. Cytokine Growth Factor Rev. 2017; 35: 71-84.
