CC BY
17
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHaibHoro ymBepcHrery BeTepHHapHoi' MeguuHHH
Ta 6ioTexHonoriH iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7320
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 575:576.3:[616.419+611.018.26]
Порiвняльна характеристика генетичноУ стабiльностi культур клггин жировоУ тканини та кiсткового мозку щурiв на paHHix пасажах
В.В. Ковпак, О.С. Ковпак kovpak8887@gmail.com
Нацюнальний утверситет бюресурав i природокористування Украгни, вул. Полковника Потехта, 16, м. Кигв, 03041, Украгна
З лтературних джерел нами отримано ряд суперечливих даних щодо ризиюв неопластичног трансформацп стовбуро-вих клтин in vitro. На сьогодт як джерела стовбурових клтин дорослих донорiв досить добре до^джено юстковий мо-зок. Альтернативним джерелом отримання клтинного матерiалу е жирова тканина (з яког вони можуть бути отримат за допомогою менш iнвазивних методiв у быьших юлькостях). Зважаючи на це, визначення генетичног стабiльностi саме цих культур клтин е найбыьш актуальними на даний час.
Наведено порiвняння показниюв генетичног стабiльностi культури клтин юсткового мозку та жировог тканини щурiв тд час гх культивування in vitro. До^дження проводились з першого до шостого пасажу включно. Змти у генетичному апаратi були виявлею як у культурi клтин юсткового мозку, так i жировог тканини. За використаних нами умов культивування, кыьюсть анеуплогдш та полпогдт змтювалась з кожним пасажем, але не виходила за межi спонтанного мутагенезу, характерного для ссавщв. Цитогенетична оцтка культури показала, що кыьюсть клтин з мжроядрами та двояде-рних клтин знаходилася у межах норми впродовж всього перiоду до^дження. Найвищий мтотичний тдекс визначався на першому пасажi з подальшим зниженням в процеЫ культивування, що зворотно пропорщйно апоптозному тдексу.
Отриман дан генетичног стабiльностi культури клтин, як жировог тканини так i юсткового мозку за вЫма дослi-джуваними показниками знаходяться в межах норми, характерног для ссавщв. Це дозволяе подальше до^дження щодо трансплантащг з мтмальним ризиком неопластичног трансформацп вказаних культур.
K.mnoei слова: цитогенетичний аналiз, мжроядерний тест, мтотичний тдекс, апоптозний тдекс, культура клтин жировог тканини, культура клтин юсткового мозку
Сравнительная характеристика генетической стабильности культур клеток жировой ткани и костного мозга крыс на ранних пассаж
В.В. Ковпак, О.С. Ковпак kovpak8887@gmail.com
Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, ул. Полковника Потехина 16, Киев, 03041, Украина
Из литературных источников нами получен ряд противоречивых данных о рисках неопластическом трансформации стволовых клеток in vitro. Сегодня в качестве источника стволовых клеток взрослых доноров достаточно хорошо исследован костный мозг. Альтернативным источником получения клеточного материала является жировая ткань (из которой они могут быть получены с помощью менее инвазивных методов в больших количествах). Ввиду этого, определение генетической стабильности именно этих культур клеток являются наиболее актуальными в настоящее время.
Приведено сравнение показателей генетической стабильности культуры клеток костного мозга и жировой ткани крыс при их культивирования in vitro. Исследования проводились с первого до шестого пассажа включительно. Изменения в генетическом аппарате были обнаружены как в культуре клеток костного мозга, так и жировой ткани. При использован-
Citation:
Kovpak, V.V., Kovpak, O.S. (2017). Comparative analysis of genetic stability of rat adipose and bone marrow cell cultures on earley passages. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(73), 95-100.
ных нами условиях культивирования, количество анеуплоидий и полиплоидий изменялась с каждым пассажем, но не выходила за пределы спонтанного мутагенеза, характерного для млекопитающих. Цитогенетическая оценка культуры показала, что количество клеток с микроядрами и двухъядерных клеток находилась в пределах нормы в течении всего периода исследования. Самый высокий митотический индекс определялся на первом пассаже с последующим снижением в процессе культивирования, что обратно пропорционально апоптозному индексу.
Полученные данные генетической стабильности культуры клеток, как жировой ткани, так и костного мозга по всем исследуемым показателям находятся в пределах нормы, характерной для млекопитающих. Это позволяет дальнейшее исследование по трансплантации с минимальным риском неопластической трансформации указанных культур.
Ключевые слова: цитогенетический анализ, микроядерный тест, митотический индекс, апоптозный индекс, культура клеток жировой ткани, культура клеток костного мозга
Comparative analysis of genetic stability of rat adipose and bone marrow cell
cultures on earley passages
V.V. Kovpak, O.S. Kovpak kovpak8887@gmail.com
National University of life and environmental sciences of Ukraine, Polkovnyka Potekhyna Str., 16, Kyiv, 03041, Ukraine
From literary sources, we received a number of controversial data regarding the risks of neoplastic transformation of stem cells in vitro. Inasmuch as today bone marrow has been sufficiently studied as a source of adult donor stem cells, and adipose tissue is an alternative source for obtaining cell material (from which it may be obtained using less invasive methods and in much greater quantity), determination of genetic stability of these particular cell cultures currently is the most relevant issue.
Comparison of genetic stability of rat bone marrow and adipose cell cultures from the first to the sixth passages. Materials and methods: 3 non-linear 4 months old male rats and 9 non-linear 12 days old infant rats were used in the experiment.
Adipose cell culture was obtained from subcutaneous fat using the standardized method in our own modification. Bone marrow cell culture was obtained from the rat femurs, tibiae, and humeri using the standardized method. Obtained cell mass was cultivated in a standard culture medium in a СО2 incubator at 37 °С and with 5% СО2 concentration.
Cytogenetic analysis was carried out on 30 metaphase plates from each passage. Cells from the first to the sixth passage we used in the research. A modification of the standard cytogenetic method was used to obtain chromosome preparations. In the preparations prepared in an aforementioned way, numerical chromosome abnormalities, like aneuploidy, polyploidy, were determined, as well as the number of binucleate cells, micronucleus cells, mitotic and apoptotic indexes.
Here, we provide the comparison of genetic stability indicators for rat bone marrow and adipose cell cultures throughout the in vitro cultivation thereof. Changes in the genetic apparatus were identified in both bone marrow and adipose tissue cell cultures. Karyotype analysis of rat bone marrow and adipose cell cultures showed that, given the conditions that we used for the cultivation, the number of aneuploidies and polyploidies varies from one passage to another; however it does not go beyond the limits of spontaneous mutagenesis typical for mammals. Based on the results of cytogenetic evaluation of the culture, it was determined that the number of cells with micronuclei and the binucleate cell remains within the normal range from the first to the sixth passages. The number of cells with aneuploidy and micronuclei in adipose cell culture on all passages was lower than in bone marrow cell culture; this indicates its higher genetic stability in terms of these indicators. The highest mitotic index was determined on the first passage with its following decrease throughout the cultivation in inverse proportion to apoptotic index.
The obtained data on the genetic stability of both adipose and bone marrow cell cultures are within normal range typical for mammals in terms of all studied indicators. This allows for the following studies relating to the transplantation with minimal risk of neoplastic transformation of the said cultures.
Key words: cytogenetic analysis, micronucleus test, mitotic index, apoptotic index, adipose tissue cell culture, bone marrow cell culture.
Вступ
Вадкриття стовбурових клгшн викликало бурхливу реакцш в науковому cbítí, а напришнщ XX столптя журнал «Science» визнав це нововведения найб№-шим вадкриттям минулого столитя. Сьогодш ж лшу-вальне застосування неспецiалiзованих клгшн викли-кае гарячi суперечки у фахiвцiв i не менш гарячий штерес громадськосп. Зокрема найчаслше постае питання ризику неопластично! трансформацп як in vitro так i in vivo.
Актуальнiсть теми. З лггературних джерел нами отримано ряд суперечливих даних щодо ризишв неопластично! трансформацп неспецiалiзованих клгшн in vitro. Зокрема, частина дослвднишв отримала результата у яких культура клгшн зазнавала спонтанно!
1мортал1заци та непластично! трансформацп (Miura et al., 2005; Bersenev, 2005), шш1 вказують на вщсутшсть генетичних помилок при культивуванш до 2 м1сящв (Rubio et al., 2005; Mareschi et al., 2006). 1снують даш про вщсутшсть неопластично! трансформацп' in vivo навиъ при введенш клггин 3Í змшеним карютипом (Izadpanah et al., 2008). Проте ва сходяться на тому, що важливу роль вщграють: джерело отримання культури, умови культивування, ензимна обробка тощо (Bersenev, 2005; Foudah et al., 2009; Mazurkevych et al., 2015).
На сьогодш як джерела стовбурових клгшн дорос-лих донор1в досить добре дослвджено шстковий мо-зок, проте альтернативним джерелом отримання катанного матер1алу е жирова тканина, з яко! вони мо-жуть бути отримаш за допомогою менш швазивних
методiв у значно бiльших шлькостях. Оск1льки данi культури клiтин найчастше використовують у досль дженнях, визначення !х генетично! стабiльностi е найбшьш актуальними на даний час.
Мета до^дження: ropiB^ra генетичну стабшь-шсть культури клiтин кiсткового мозку та жирово! тканини щуpiв з першого до шостого пасажу.
Завдання. 1. Отримати культури клгшн кiсткового мозку та жирово! тканини. 2. Дослщити змши сшв-ввдношення кiлькостi клгшн з анеуплощею, полшло-!даею, мшроядрами та двоядерних клiтин з першого до шостого пасажу. 3. Прослщкувати змши мгготич-ного та апоптозного iндексу у культуpi клiтин шстко-вого мозку (КККМ) та культуpi клiтин жирово! тканини (ККЖТ).
Матерiал i методи дослiдження
Експерименти на тваринах були проведет з до-триманням вимог Закону Укра!ни «Про захист тварин ввд жорстокого поводження» (ст. 230 ввд 2006 року). У дослщ використали 3-ох самцiв не лiнiйних щуpiв вшом 4 мiсяцi та 9 не лшшних щуренят 12-денного вiку. Евтаназш дослiдних тварин здiйснювали шляхом декаштацп пвд ефipним наркозом.
Отримання культури клiтин жирово! тканини здшснювали з шдшшрно! жирово! клiтковини за стандартною методикою (Ian Freshney, 2005; Bunnell et al., 2008; Carswell et al., 2012) у власнш модифкацп. Культуру клiтин шсткового мозку отримували з шст-кового мозку стегнових, великогомшкових та плечо-вих к1сток щуpiв за стандартною методикою (Ma-surkewitsch et al., 2014). Одержану клiтинну масу ку-льтивували у стандартному сеpедовищi: 80% -DMEM; 20% - FBS; 10 мкл/см3 - антибютика-антимшотика («Sigma», США); у СО2 iнкубатоpi за 37 °С та 5% концентрацп СО2 (Masurkewitsch et al., 2014), до конфлюентносл 90-100%.
Результати цитогенетичного аналiзу культур
I - VI паса
Клгшни зшмали за стандартною методикою (роз-чином 0,25% трипсин/ЕДТА) (Masurkewitsch et al., 2014). Подальше пасажування здшснювалось у розве-денш 1 : 3. Мжроскошчний аналГз i оцшку культур здшснювали за допомогою швертованого мшроско-па Axiovert 40 (Карл Цейс).
Цитогенетичний аналiз проводили на 30 метафаз-них пластинках культур клiтин з кожного пасажу. ДослГдження проводили на клггинах першого-шостого пасаж1в. Для отримання препаралв хромосом використовували модифiкацiю стандартного цитогенетичного методу (Masurkewitsch et al., 2014). Отримаш препарати забарвлювали за допомогою набору для фарбування (Лейкодиф 200), зпдно ш-струкцй виробника. Аналiз метафазних пластинок здшснювали за допомогою мшроскопа Leica DMR (Нiмеччина), збiльшення х400, х1000.
У пiдготовлених вище зазначеним способом препаратах виявляли шльшсш порушення хромосом -анеупловдш (А), полшлоццю (1111), а також пГдрахо-вували к1льк1сть двоядерних клiтин (ДЯ), клiтин з мiкроядрами (МЯ), мгготичний iндекс (вiдсоток кль тини в стади подiлу вiд загально! шлькосп проаналь зованих клiтин (MI) (Kolmakowa et al., 2013), апопто-зний шдекс (вГдсоток клiтин з ознаками апоптозу в!д загально! кiлькостi проаналiзованих клiтин (AI) (Penaloza et al., 2008). Частоту прояву ДЯ, МЯ та АП вираховували на 500 клгшн (%).
Результати та Тх обговорення
Aналiз карiотипу культур клгшн к1сткового мозку та жирово! тканини щурГв, у процесi !х культивуван-ня, показав, що для них характерш шльшсш порушення (анеуплощя та полшлощя), результати досль джень приведено у таблицi 1.
Таблиця 1
клттин шсткового мозку та жировоТ тканини щурiв ®iB, M ± m, n = 3
№ пасажу Анеупло1дш, % Полшло!д1я, %
КККМ ККЖТ КККМ ККЖТ
I 8,9 ± 1,3 4,4 ± 1,3 1,1 ± 1,2 5,6 ± 1,3
II 13,2 ± 2,0 4,4 ± 1,3 1,1 ± 1,2 3,3 ± 2,0
III 18,9 ± 1,3** 5,6 ± 1,3 1,1 ± 1,2 0,0 ± 0,0*
IV 14,5 ± 2,6 5,6 ± 1,3 2,2 ± 1,3 0,0 ± 0,0*
V 15,6 ± 1,3* 6,7 ± 0,0 4,4 ± 1,3 0,0 ± 0,0*
VI 17,8 ± 1,3** 12,2 ± 1,3* 4,4 ± 1,3 0,0 ± 0,0*
Примггаа: * — Р < 0,05; ** — Р < 0,01; *** — Р < 0,001, поршняно з контролем (контролем виступав перший пасаж)
Хромосомш пластинки з анеуплощею вiдмiчали з першого до шостого пасажу у обох дослГджуваних культурах (табл. 1.) (рис.1, б). Найнижчий !х вГдсоток, як у культур! клгшн шсткового мозку (8,9%), так i в жировш тканиш (4,4%), вГдмГчали на першому пасажг Максимальна к1льк1сть клгшн з некратним набором хромосом у КККМ припадала на третш пасаж (18,9%), у ККЖТ - на шостий (12,2%). Процеси опи-саш вище можна пояснити тим, що у процеа культи-вування кшьшсть клгшн з неправильним набором хромосом збшьшуеться за рахунок !х неконтрольова-
ного подГлу. Варто вадштити, що на четвертому паса-ж1 у культур! клгшн к1сткового мозку кшьшсть клгшн з анеуплощею зменшуеться (14,5%), на цьому ж пасаж! вщшчаеться шк апоптозу у дослщжуванш культур! (0,7%), подГбш змши спостерйали i у ККЖТ. Описаний процес можна пояснити тим, що на 3-му пасаж у КККМ та 6-му у ККЖТ помилки, що нако-пичились генетичному апарап клгшн, активують каскад реакцш вщомий як «апоптоз зсередини» (Mus-chkambarow and Kusnezow, 2013), що тдтверджуеться даними отриманими нами у попередшх дослГдженнях:
збшьшенням CD 95 (бшок, що шщше запрограмова-ну клгшнну загибель) (Mazurkevych et al., 2016) та клгшн у сташ апоптозу (табл. 3). Стд вшмгшти, що
У
жирово! тканини був нижчий на Bcix пасажах шж у культур! клiтин кicткового мозку, що свщчить про 11 бiльшу генетичну стабшьшсть за даним показником.
культур! кл1тин
* t '
ч, г
<■ > *1 % -V, f .
б)
кшыасть кл1тин з анеуплоццею
Рис 1. Мжрофотографи метафазних пластинок клтгин щура: а) нормальний карютип, n = 42; б) полшлощя, n = 84; в) анеуплощя, n = 70. Забарвлення Лейкодиф 200. Зб. ><1000
Метафазнi пластинки з кратним зб!льшенням числа хромосом (рис.1, в.) виявляли у культур! клгтин шсткового мозку з 1-го (1,1%) до VI-го (4,4%) пасажу, жирово! тканини - з 1-го (5,6%) до 11-го (3,3%) (табл. 1). На даний час остаточний мехашзм появи полшлощй не визначений. Проте юнуе ряд гшотез: вЩдхилення вШд нормального ходу мггозу, внаслЩдок злиття двох клгшн (бшьш характерно саме для культур клгшн) (Kovaljova, 2008), cповiльненням чи прис-коренням мггозу (Matsyara, 1980). Прослшковуючи закономiрнicть появи полшлощй та двоядерних клШ-тин можна зробити висновок, що механiзм !х появи у КККМ та ККЖТ р!зний. У культур! клгшн жирово! тканини максимальну шльшсть клгшн з кратним збь
льшенням хромосом (5,6%) та двоядерних клгшн (2,9%) вiдмiчали на першому пасаж1, у той час як у культур! клгшн шсткового мозку cпоcтерiгали зворо-тну законом!ршсть: найвищий р!вень полшлощй (4,4%) та двоядерних клгшн (2,0%) на шостому пасажу (табл. 2). Описан! явища можуть бути пояснен! тим, що у ККЖТ наявшсть полшлощй зумовлено швидким мггозом (мгготичний !ндекс 4,3%), у той час як у КККМ - внаслЩдок злиття клгшн впродовж три-валого культивування та вЩдхиленням вШд нормального ходу мггозу.
Для додатково! оцшки цитогенетичних змш куль-тури клгшн к1сткового мозку та жирово! тканини був проведений мшроядерний тест (табл. 2, рис. 2).
Таблиця 2
Результати мжроядерного тесту культур клггин шсткового мозку та жировоТ тканини щурiв на
№ пасажу Клппни з мжроядрами, % Двоядерш клппни,%
КККМ ККЖТ КККМ ККЖТ
I 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,5 ± 0,2 2,9 ± 0,2
II 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,9 ± 0,1 2,5 ± 0,3
III 1,2 ± 0,1** 0,3 ± 0,1 1,3 ± 0,1** 1,9 ± 0,1**
IV 1,4 ± 0,2** 0,3 ± 0,1 1,6 ± 0,1** 1,7 ± 0,1**
V 1,7 ± 0,1*** 0,3 ± 0,1 1,8 ± 0,1** 1,4 ± 0,1**
VI 1,9 ± 0,1*** 1,0 ± 0,1** 2,0 ± 0,1** 1,1 ± 0,1**
Приметка: *— Р < 0,05; **- Р < 0,01; ***- р < 0,001, поршняно з контролем (контролем виступав перший пасаж)
Пд час дослщження клгшни з мшроядрами виявляли на вах пасажах, як у КККМ, так i в ККЖТ (рис. 2, а) (табл. 2). Спостерпали збшьшення шлькосп МЯ у культурах клгшн з пасажами, при чому у шст-кового мозку воно було бшьш штенсивним шж у культур! клгшн жирово! тканини.
За результатами таблиц! 1 та 2 прослвдковуеться законом!ршсть до збшьшення клгшн зШ змшеним ка-рютипом та клгшн з мжроядрами. Це можна поясни-ти тим, що мшроядра утворюються в результат! по-рушення веретена под!лу, що призводить до нерозхо-дження чи ввдставання в розходженш хромосом до полюав клгшни. До складу мшроядра можуть входи-
ти як окрем! цш хромосоми, так i !х фрагмента. Вони е патолопчною структурою i !х утворення пов'язано з хромосомною нестабшьшстю (Kovaljova, 2008; Kolmakowa et al., 2013).
Додатково у культурах клгшн дослвджували пока-зники мгготично! активносл та апоптозу. Нами вщ м!чалась зворотна законом!ршсть апоптозного та мгготичного щдексш, як у КККМ, так i ККЖТ. Так, найменший ввдсоток клгшн у стан! апоптозу в!дм!чав-ся на першому пасаж! як у культур! клгшн шсткового мозку (0,1%), так i жирово! тканини (0,1%), у той час як мгготичний шдекс був найвищим за весь перюд дослщження (4,1% та 4,3% вшповшно).
• /* i
а) б) в)
Рис.2. Мжрофотографп клiтин культури жировоТ тканини щура (6 пасаж): а) клггана з мжроядром; б) двоядерна клггана, в) клггана в сташ апоптозу). Забарвлення Лейкодиф 200. Зб. ><1000.
Таблиця 3
Показник м^отичноТ активностi та апоптозу культури клггин KicTKOBoro мозку та жирово'1 тканини щурiв на раннiх пасажах культивування, M ± m, n = 3
№ пасажу 1ндекс апоптозу, % Мгготичний шдекс, %
КККМ ККЖТ КККМ ККЖТ
I 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 4,1 ± 0,2 4,3 ± 0,2
II 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 3,8 ± 0,1 4,1 ± 0,1
III 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,0 3,7 ± 0,1 3,6 ± 0,1*
IV 0,7 ± 0,2** 0,3 ± 0,1 2,7 ± 0,3** 3,5 ± 0,1*
V 0,5 ± 0,1* 0,3 ± 0,1 3,3 ± 0,1** 3,4 ± 0,1*
VI 0,5 ± 0,1* 1,4 ± 0,1*** 3,5 ± 0,1* 2,0 ± 0,1***
Примггаа: * — Р < 0,05; ** — Р < 0,01; *** — Р < 0,001, поршняно з контролем (контролем виступав перший пасаж)
Максимальний апоптозний 1ндекс у КККМ ввдш-чали на 4 пасаж1 (0,7%) за мшмального мгготичного вдексу (2,7%), у ККЖТ под1бна законом1рнють про-слвдковувалась на 6-му пасаж1 (1,4%; 2,0% вщповвд-но).
Отримаш результати вказують на генетичну стабь льшсть дослщжуваних культур клтган, оск1льки за вама дослщжуваними показниками знаходяться в межах норми, характерно! для ссавщв (Xikum and Liming, 1990; Jernct and Zhigatschew, 2006; Kovaljowa et al., 2008; Mazurkevych et al., 2015). Це вщкривае нов1 можливосп для подальших дослвджень щодо трансплантаци, гарантуючи мшмальний ризик неопластично! трансформацп вказаних культур in vivo.
Висновки
1. Анал1з карютипу культур клггин к1сткового мозку та жирово! тканини щур1в показав, що за викорис-таних нами умов !х культивування, кшьшсть анеупло-щй та полшлощй зм1нюеться з кожним пасажем, але не виходить за меж1 спонтанного мутагенезу, характерного для ссавщв.
2. За результатами цитогенетично! ощнки культури встановлено, що кшьшсть клгган з мжроядрами та двоядерних клгган знаходиться у межах норми з пер-шого до шостого пасажу.
3. Кшьшсть клгган з анеуплощею та мжроядрами у культур1 клгган жирово! тканини був нижчий на вах пасажах шж у культур1 клгган шсткового мозку, що свщчить про ïï б1льшу генетичну стабшьшсть за даними показниками.
4. Найвищий мiтотичний iндекс визначасться на першому пасаж з подальшим зниженням в процесi культивування, що зворогно пропорцшно апопгозно-му iндексу.
Перспективи подальших до^джень: огримаш да-m вiдкриваюгь можливосгi для вивчення впливу ККЖТ га КККМ на оргашзм реципieнгiв, га можли-вiсгь прогнозування змiни генотипу грансплангова-них клггин.
Бiблюграфiчш посилання
Bersenev, A.B. (2005). Izucheniye spontannoy onkogeneticheskoy transformatsii mezenkhimal'nykh stvolovykh kletok cheloveka v kul'ture [Study of spontaneous oncogenetic transformation of human mesenchymal stem cells in culture] Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya.- Cellular transplantation and tissue engineering. 1, 14-16 (in Russian).
Kolmakowa, T.C., Belik, C.N., Morgul', E.W., Cewiju-kow, A.W. (2013). Icpol'sowanie mikrojadernogo tecta dlja ozenki jevvektiwnocti letschenija allergii u detej: metod. rekomendazii. [Using the micronucleus test to assess the effectiveness of the treatment of allergies in children: guidelines]. Roctow na Donu. Isd-wo RoctGMU (in Russian). Kovaljowa, O., Koboseva, N., Burdo, E., Glasko, T. (2008). Mikrojadernyj tect kak metod opredelenija ce-sonnoj ismentschiwocti zitogenetitscheckich poka-satelej u mlekopetajushich [Micronucleus test as a method of determining the seasonal variability of cytogenetic indices in of mammals]. Raritetna teriovauna
ta ii ochorona - Rare fauna and its protection. 9, 266269 (in Ukrainian).
Kovaljova, O.A. (2008). Zitogenetitscheckie anomalii w comatitscheckich kletkach mlekopitajushich. [Cytogenetic abnormalities in somatic cells at mammalian]. Zitologija i genetika - Cytology and Genetics. 1, 5872 (in Ukrainian).
Mazurkevych, A.Y., Malyuk, M.O., Starodub, L.F., Danilov, V.B. (2015). Kariotypovyy analiz me-zenkhimal'nykh stovburovykh klityn kistkovoho mozku kroliv za riznykh metodiv dysotsiatsiyi klitynnoho monosharu na rannikh pasazhakh kul'tyvuvannya in vitro [Kariotyp analysis of mesen-chimal bone marrow stem cells of rabbits by different methods dissociation of cell monolayers at early cultivation passage in vitro]. Naukovyy visnyk NUBiP Ukrayiny. Seriya: Veterynarna medytsyna, yakist' i bezpeka produktsiyi tvarynnytstva - Scientific Bulletin NUBIP of Ukraine. Series: Veterinary Medicine, the quality and safety of animal products, 227 (in Ukrainian).
Mazurkevych, A.Y., Kovpak, V.V., Kovpak, O.S. (2016). Fenotypovi ta morfolohichni zminy kul'tury klityn kistkovoho mozku shchuriv v protsesi yikh kul'tyvuvannya [Phenotypic and morphological changes of bone marrow cells culture of rats during cultivation]. Naukovyy visnyk LNUVMBT imeni S.Z.Gzhyts'koho - Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj. 18, 2(66), 126-131 (in Ukrainian).
Masurkewitsch, A.J., Kowpak, W.W., Danilow, W.B. (2014). Klitinni technologii u weterinarnij medizini. Nawtschal'nij pocibnik. [Cellular technologies in veterinary medicine. Study Guide]. Kyev: KOMPRINT (in Ukrainian).
Muschkambarow, N.N., Kusnezow, C.L. (2013). Moleku-ljarnaja biologija.Utschebnoe pocobie dlja ctudentow medizinckich wusow [Molecular biology. Textbook for medical students]. Moscow: Medizinckoe in-vormazionnoe agentctwo (in Russian).
Jernct, L.K., Zhigatschew, A.I. (2006). Monitoring genet-itscheckich bolesnej zhiwotnych w cicteme krupnom-
acschtabnoj celekzii [Monitoring animal genetic diseases in the system of largescale selection]. Moscow: Roccel'chosakademija (in Russian).
Bunnell, B.A., Flaat, M., Gagliardi, Ch. et al. (2008). Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, 2, 115-120.
Carswell, K.A., Mi-Jeong, Lee, Fried, S.K. (2012). Culture of Isolated Human Adipocytes and Isolated Adipose Tissue. Methods Mol Biol. 806, 203-214.
Foudah, D., Redaelli, S., Donzelli, E. et al. (2009). Monitoring the genomic stability of in vitro cultured rat bone-marrow-derived mesenchymal stem. Chromosome Res.17(8), 1025-1039.
Ian Freshney, R. (2005). Culture of animal cells: a manual of basic technique [5th ed.]. USA: John Wiley & Sons.
Izadpanah, R., Kaushal, D., Kriedt, C., Tsien, F. et al. (2008). Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem. Cancer Res. 68(11), 4229-4238.
Mareschi, K., Ferrero, I., Rustichelli, D., Aschero, S. et al. (2006). Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. J. Cell. Biochem. 97(4), 744-754.
Matsyara, T. (1980) Multinucleation and polypoloidiza-tion of aging human cells in culture. Adv Exp Med Biol. 129, 31-38.
Miura, M., Miura, Y., Padilla, N.M. et al (2005). Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenhymal stem cells leads to malignant transformation. Stem. Cells. 24, 1095-1103.
Penaloza, C., Orlanski, S., Entezari-Zaher, T. et al. (2008). Cell death in mammalian development. Curr. Pharm. Des. 14(2), 184-196.
Rubio, D., Garcia Castro, J., Martin, M.C. et al. (2005) Spontaneous human stem cell trans formation. Cancer Res. 65, 3035-3039.
Xikum, X., Liming, S. (1990). Observations on micronu-clei germ cells. Zool. Res. 11, 4, 343.
Cmammn nadiümna do peda^iï 19.03.2017
