CC BY
67
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMeHi C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.32718/nvlvet8828 http://nvlvet.com.ua
UDC 57.085.2: 611.013: 611.127: 599.742.73
Methods of obtaining stem cells of the myocardium of cat
O.S. Kovpak, V.V. Kovpak, A.I. Mazurkevych
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Article info
Received 17.09.2018 Received in revised form 18.10.2018 Accepted 19.10.2018
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Heroyiv Oborony Str., 15, Kyiv, 03041, Ukraine. Tel.: +38-067-935-25-70 E-mail: kovpak8887@gmail.com
Kovpak, O.S., Kovpak, V.V.,& Mazurkevych, A.I. (2018). Methods of obtaining stem cells of the myocardium of cat. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies, 20(88), 152-157. doi: 10.32718/nvlvet8828
Year 2003 may be considered as the beginning of the study of "stem cells of the adult heart", when Beltrami A.P. with his colleagues finally confirmed the presence of the latter in the heart. Later, Makkar R.R. and others proved the efficacy of these cells for treatment of myocardial ischemia. However, despite the positive effect of the use of "stem cells of the adult heart" for myocardial ischemia, an obstacle to their global clinical use are the ethical issues and difficulty in obtaining. Given the above, the aim of our work was to determine the optimal method of obtaining stem cells from the myocardium of cat. The experiments on animals were performed in accordance with the requirements of the "General ethical principles for Experiments on Animals" adopted by the first National Congress on bioethics (dated 20.09.04, Kyiv, Ukraine). To obtain heart tissues the frozen fetuses of kittens, that remained after providing the birth assistance, were used (with the consent of the owners). In order to determine the optimal method for obtaining a stem cells culture of the myocardium of cat we compared the explant method and enzymatic treatment methods of tissues using different combinations of enzymes: 2 mg/ml of collagenase (type II); 2 mg/ml of collagenase (type II) supplemented with 5% bovine serum; 1 mg/ml of collagenase (type II), 1 mg/ml of hyaluron-idase and 5% BSA; 2.5% of trypsin; 2.5% of trypsin, 0.5 mg/ml of collagenase (type II) and 0.5 mg/ml of hyaluronidase. In order to determine the optimal method for obtaining a cells culture of the myocardium the counting of the number of cells after the formation of monolayer in one of the experimental groups was carried out (day 5 since the beginning of the research). The counting of number of cells was performed in the Gorjaev's chamber under 200 magnification of microscope in all the squares. The most effective method for obtaining the stem cells culture from the myocardium is to use a combination of enzymes 2.5% of trypsin, 0.5 mg/ml of collagenase (type II) and 0.5 mg/ml of hyaluronidase, which allows to obtain 986.0 ± 9.3 thousand cells capable for proliferation with 10 mg of tissue. The least effective was the explant method (without use of enzymes), because the number of cells attached to the cultural plastic of the cells during its use on day 5 of cultivation was amounted 35.7 ± 6.2 thousand. The proposed method is optimal for obtaining the stem cells culture of the myocardium of the cat, which will be used later in our studies in the treatment of diseases of the heart muscle.
Key words: primary culture, stem cells of the myocardium, enzymatic treatment, explant method, cat.
До методики отримання стовбурових клггин миокарда kotîb
О.С. Ковпак, В.В. Ковпак, А.Й. Мазуркевич
Нацюнальний yuieepcumem 6iopecypcie i природокористування Украти, м. Кшв, Укра'та
Початком до^дження стовбурових клтин серця можна вважати 2003 рщ коли Beltrami A.P. з колегами тдтвердили налететь остантх у мiокардi. Шзтше Makkar R.R. та т. довели ефективтсть даних клтин за л^вання i-шемп мюкарда. Проте, незважаючи на позитивний ефект вiд застосування мiокардiальних стовбурових клiтин за i-шемп мюкарда, перешкодою для ïx масового ^iтчного застосування е етичт сyперечностi та складтсть в отримант. Зважаючи на вищесказане, метою нашог роботи було визначення оптимального методу отримання стовбурових клтин з мюкарду кота. Експерименти на тваринах були виконат вiдповiдно до вимог "Загальних етичних принцитв експериментiв на тваринах", схвалених IНацюнальним конгресом з бюетики (20.09.04 р., Кигв, Украша). Для отримання тканин серця використовували завмерлi плоди кошенят (за згоди господарiв), що залишалися тсля надання рододопомоги. Для визначення оптимального методу отримання культури стовбурових клтин мюкарда кота нами було порiвняно метод експланту та методи ферментативног обробки тканин з використанням рiзниx комбта-цш ферментiв: 2 мг/мл колагенази (тип II); 2 мг/мл колагенази (тип II) з додаванням 5% бичачого сироваткового альбумту (BSA);
1 мг/мл колагенази (тип 11),1 мг/мл síayponídasu та 5% BSA; 2,5% трипсину; 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази (тип II) та 0,5 мг/мл гiалуронiдази. Найбтьш оптимальним методом отримання культури стовбурових клтин мюкарда вважали метод, за якого найшвидше утворювався моношар клтин у однш Í3 чашок Петрi. При цьому враховували ктькють клтин у моношарi, яш тдраховували у камерi Горяева за допомогою мжроскопу при збтьшент у 200 разiв. Найбтьш ефективним методом отримання культури стовбурових клтин мюкарда котiв е використання комбтацп ферментiв: 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази (тип II) та 0,5 мг/мл гiалуронiдази, що дозволяе з 10 мг тканин серця отримати 986,0 ± 9,3 тис. клтин, здатних до пролiферацiï. Найменш ефективним виявився метод експланту (без використання ферментiв), осктьки ктькють при^плених до культурального пластику клтин за його використання на 5 добу культивування складала 35,7 ± 6,2 тис.
Ключовi слова: первинна культура, стовбуровi клтини мюкарда, ферментативна обробка, метод експланту, кт.
Вступ
Тривалий час серце вважалося постмггогенним органом без здатносп до регенерацп, тому пошук стовбурових клгган у цьому орган вважався марним. Проте з часом почали з'являтися повгдомлення про юнування у шлуночках серця ссавщв кглькох видiв, включаючи людей, мюципв, що здатн до мгтозу та цитошнезу в нормi та за патологи (Kajstura et al., 1998; Beltrami et al., 2001). А вже в 2003 рощ Beltrami A.P. et al. (Beltrami et al., 2003) остаточно тдтвердили наявшсть у серш так званих "дорослих стовбурових клгган серця", яш, своею чергою, володгють здатшс-тю до самоввдновлення, клоногеншстю та е мульти-потентними (здатш до диференщаци у мюцити, глад-ку мускулатуру та ендотелiальнi клггани) (Bearzi et al., 2007).
При введенш за шфаркту мюкарда в серце мюкар-дiальних стовбурових клгган ушкоджений серцевий м'яз регенеруе, що вгдбуваеться завдяки утворенню нових судин i мiоцитiв з характеристиками молодих клгган, що охоплюють приблизно 70% ушкодженого шлуночка (Beltrami et al., 2003).
Makkar R.R. et al. (Makkar et al., 2012) вгдзначають, що за введения стовбурових клгган, отриманих з сер-цево! тканини, вгдмгчають зменшення розмгру рубця мюкарда та утворення нових здорових тканин. Вказа-нг дан спростовують теоргю, що рубщ серцевого м'яза е постшними i тсля втрати здоровг серцевг м'язи не можуть бути ввдновлеш
Зважаючи на вищесказане, використання стовбурових клгган мюкарда е перспективним методом л1-кування домашшх тварин Гз хворобами серця, викли-каних дистрофГчними змшами у мюкарда Проте, незважаючи на позитивний ефект вгд застосування мюкардгальних стовбурових клгган за шемп мюкар-да, перешкодою для !х масового ктшчного застосування е етичн суперечносп та складшсть в отриман-ш
Мета роботи: визначити оптимальний метод отримання стовбурових клгган мюкарда кота.
MaTepia™ та методи дослiджень
Експерименти на тваринах були виконаш вгдпо-вгдно до вимог "Загальних етичних принцитв експе-рименпв на тваринах", схвалених I Нацюнальним конгресом з бюетики (20.09.04 р., Ки!в, Укра!на).
Для отримання тканин серця використовували за-вмерлГ плоди кошенят (за згоди господарГв), що за-лишалися тсля надання рододопомоги. Для отримання культури стовбурових клгган мюкарда отримаш
шматочки серця масою 10 мг вносили у npo6ipKH та додавали 1 см3:
1) використовували модифшований метод експланту: шматочки тканин культивували у стандартному поживному середовищi (80% - середовище 1гла модифiкованого Дюльбеко (DMEM), 20% - ембрюна-льна сироватка ВРХ) з додаванням 10 мкл/см3 антибь отика-антимiкотика);
2) 2 мг/мл колагенази (тип II) (Sigma, США);
3) 2 мг/мл колагенази (тип II) (Sigma, США) + 5% бичачого сироваткового альбумГну (BSA) (Sigma, США);
4) 1 мг/мл колагенази (тип II) (Sigma, США) + 1 мг/мл пауронвдази (Life Global, Бельпя) + 5% BSA (Sigma, США);
5) 2,5% трипсину (Sigma, США);
6) 2,5% трипсину (Sigma, США) + 0,5 мг/мл колагенази (тип II) (Sigma, США) + 0,5 мг/мл палурош-дази (Life Global, Бельпя).
Пробiрки з тканиною та розчинами № 1, 2, 3 та 4 помщали у СО2лнкубатор при t 37 °C на 1 годину, пробiрки з тканиною та розчинами № 5 та 6 - у холодильник при t 4 °C на 12 годин. Шсля зашнчення ви-значеного часу ïx тддавали центрифугуванню протя-гом 20 хв за вадцентрово! сили 300 g. Зливали надоса-дову ргдину, а до осаду клггин вносили стандартне поживне середовище з додаванням 10 мкл/см3 антибь отика-антимшотика), розпiпетовували, переносили в чашки Петрi з поживним середовищем та ставили на культивування.
НайбГльш оптимальним методом отримання культури стовбурових клгган мюкарда вважали метод, за якого найшвидше утворювався моношар клгган у однш iз чашок Петрг При цьому враховували шль-шсть клiтин у моношарi, яш шдраховували у камерi Горяева за допомогою мшроскопа при збiльшеннi у 200 разiв. Пiдраxунок кiлькостi клгган проводили в уах квадратах камери та розраховували за формулою: Х = А х 1000/ 0,9
де Х - число клгган в 1 см3; А - число клгган у вах квадратах; 1000 - кшьшсть мм3 в 1 см3; 0,9 -об'ем камери Горяева в мм3 (Masurkewitsch et al., 2014).
Пасажування клгган здшснювали у сшввщношенш 1:2 за стандартною методикою. Мшроскошчний ана-лГз i ощнку культури здшснювали за допомогою ш-вертованого мшроскопа Axiovert 40 (Карл Цейс).
Результата та ïx обговорення
Ниш метод експланту вважаеться найбГльш оптимальним для отримання первинно! культури з малоï
шлькосл тканини, адже ферментативна обробка може призвести до пошкодження клггин i, як наслшок, втрати ïx життeздатностi. Разом з тим ферментатив-ний метод отримання первинно1 культури у разi правильного шдбору комбiнацiï ферментiв та експозицiï дозволяе отримати бiльший, порiвняно з методом експланту, вихш клiтин, здатних до прол1ферацп. Саме тому для отримання культури стовбурових кль тин мюкарда кота ми порiвнювали як метод експланту, так i ферментативну дезагрегащю. Зважаючи на
* «.г®. ^ V ^¿"Х .- Я' Г ^ - е*1 1
9 1 "ai*
.••¿^V.-r.v
ê s *
Û. y , P *■> »M? ftp* ''
¡oA) s «I» Й ■ «.' :
■я1.
те, що для сепараци клiтин серця науковщ зазвичаи використовують трипсин (Hynes and Walton, 2000; Shoulders and Raines, 2009), колагеназу (Speicher and McCarl, 1974; Makkar et al., 2012) i дещо рщше па-лурошдазу (Sharma et al., 2015), у сво!х дослщженнях ми використовували саме цi ферменти.
Варто зазначити, що вiзуальна вiдмiннiсть у фор-муванш колонiИ первинно! культури мiокарда кота залежала ввд методу, що був застосований для И отримання (рис. 1).
Ш
» 4
■ г.
У " - S*
в i , L s» %: У. • /'
ч f —^ \ —i
v
- «*■" .*- -11 «j» Ц ' ;.4ДМ *'
••/ 's ' 4
i- • : < »
& - • >
Regp «
» е.й
б
Рис. 1. Моношар культур стовбурових клгган мiокарда кота за використання рiзниx методiв ïx отримання (3 доба культивування, 0 пасаж): а) 1 метод (метод експланту); б) 6 метод (2,5% трипсину + 0,5 мг/мл колагенази (тип II) + 0,5 мг/мл палуронщази). Нативний перпарат. Зб.: х40
Вже на 3 добу культивування ми спостертали вщ-мшносп у рост клгган. Так, за використання 1 методу (метод експланту) ввдшчали утворення поодиноких колонш (рис. 1, а). Водночас за використання 6 методу ввдшчали велику кшьшсть клгган, що були дифуз-но прикрiпленi до культурального пластику (рис. 1,
б). При оцшш росту клгган у шших дослшних групах на 3 добу культивування виявляли як наявнiсть коло-нш, так i поодиноких клгган.
Статистичш результати щодо отримання культури стовбурових клгган мiокарда кота на 5 добу культивування наведеш у таблиц 1.
Таблиця 1
Юльшсть стовбурових клгган мюкарда кота в моношарг залежно вщ методу обробки первинного матергалу, M ± m, n = 3
№ методу
Метод обробки серцевоï тканини
Кшьюсть клгшн на 5 добу культивування, тис. шт.
Метод експланту (контроль) 2 мг/мл колагенази (тип II) 2 мг/мл колагенази (тип II) + 5% BSA 1 мг/мл колагенази (тип II) + 1 мг/мл пауротдази + 5% BSA 2,5% трипсину
2,5% трипсину + 0,5 мг/мл колагенази (тип II) + 0,5 мг/мл г1алуротдази_
35,7 ± 6,2 560,3 ± 7,8*** 340,7 ± 15,8***
276,0 ± 8,7***
175,0 ± 7,3***
986,0 ± 9,3***
Примтки: - Р < 0,001 поргвняно з контролем
а
При ощнщ статистичних даних, наведених в таблиц 1, та в1зуальних вадмшностей, продемонстрова-них на рисунку 2, можна стверджувати, що за ферме-нтативно! обробки тканин серця кота можна отримати достов1рно бшьшу к1льк1сть клгган, здатних до проль ферацп, пор1вняно з використанням методу експланту (без застосування ферменлв).
Так, обробка 10 мг отримано! тканини комбшаць ею ферменпв 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази
(тип II) та 0,5 мг/мл палурошдази дозволила досягти 100% конфлюентносп моношару на 5 добу культиву-вання (рис. 2, б). Кшьшсть клгган при цьому станови-ла 986,0 ± 9,3 тис., що, своею чергою, у 27,6 разу бь льше, шж за використання методу експланту (контроль) (рис. 2, а). Варто зазначити, що даний метод виявився найефектившшим у процеа нашого досль дження.
■ \
Рис. 2. Моношар культур стовбурових клгган мюкарда кота за використання р1зних метод1в отримання (5 доба культивування, 0 пасаж): а) метод експланту (контроль); б) 6 метод (2,5% трипсину + 0,5 мг/мл колагенази (тип II) + 0,5 мг/мл палурошдази). Нативний перпарат. Зб.: ><200
Дещо нижчий вихвд клгган, що здатш до прол1фе-рацп, отримали за використання 2 мг/мл колагенази (тип II). За використання даного методу кшьшсть клгган на 5 добу культивування складала 560,3 ± 7,8 тис., що у 15,7 разу бшьше, пор1вняно з контролем, проте у 1,8 разу менше, шж за використання 6 методу обробки тканини.
Наступним за ефектившстю був 3 метод обробки з використанням 2 мг/мл колагенази (тип II) з додаван-ням 5% BSA. Кшьшсть клгган, здатних до прол1фера-ци, становила 340,7 ± 15,8, що у 9,5 разу бшьше, шж за використання методу експланту.
Менш ефективними методами ферментативно! об-робки виявилися 4 (з додаванням 1 мг/мл колагенази (тип II) + 1 мг/мл пауронщази + 5% BSA) та 5 (з до-даванням 2,5% трипсину) методи. Кшьшсть клгган за використання 4 методу на 5 добу культивування ста-новила 276,0 ± 8,7 тис., 5 методу - 175,0 ± 7,3 тис., що вщповщно у 7,7 та 4,9 раз1в б1льше пор1вняно з контролем.
Зважаючи на те, що ефектившсть методу експланту в нашому дослщженш була найнижчою, дошльним буде розглянути вплив ферменпв на тканину. Варто зазначити, що мехашзм ди трипсину, колагенази та палуронщази значно вщр1зняеться. Так, трипсин -розщеплюе С-термшальний арпнш та л1зин (Lee et а1., 2015), тобто здатний пдрол1зувати бшьшють б1лшв. Палуронщаза - фермент, який здатний розщеплювати палуронову кислоту (Mukherjee et а1., 2002) та зб1ль-шувати проникнють тканин, що сприяе розповсю-дженню речовин, як1 надходять разом з ним (К^Шга et а1., 1998), тому при дезагрегацп И використовують у поеднанш з шшими ферментами. Колагеназа здатна розщеплювати колаген, який е найб1льш розповсю-дженим б1лком позаклгганного матриксу в оргашзм1 ссавшв (не винятком е 1 серце, у якому в норм1 вияв-ляють дек1лька тишв колагену) ^^ег et а1., 1983).
На даний час юнуе ряд розр1знених даних щодо впливу ферменпв на серцеву тканину за И дезагрегацп. Так, за даними МтеШе Masson-Pëvet та ш.
(Messina et al., 2016) вплив трипсину на клггани серця призводить до значного ïx пошкодження, тод1 як за впливу колагенази - пошкоджень клгган не ввдшчали. De Bruijne J. та ш. (Gross et al., 1968; de Bruijne and Jongsma, 1980), повщомляють, що мембранш власти-восп клгган серця, оброблених колагеназою, вщповь дають таким у штактних клгганах. Разом з тим, Colizza D. та ш. (Colizza et al., 1983) у сво1х досль дженнях демонструють протилежш результати: кль тини, що тддавалися дiï трипсину, бшьш под1бн1 до штактних клгган, нiж тi, що тддавалися ди колагенази. Speicher, D.W. та ш. (Speicher and McCarl, 1974) пояснюють це тим, що вившьнення клгган без ï\ пош-кодження з тканин можливе лише при правильно пщбранш концентрацп трипсину з урахуванням сту-пеня його очистки.
Зважаючи на вищесказане, ферментативну оброб-ку тканин серця кота комбшащею 2,5% трипсину з додаванням 0,5 мг/мл колагенази (тип II) та 0,5 мг/мл палурошдази з експозишею 12 годин при температу-рГ 4 °C можна вважати оптимальним методом отри-мання культури стовбурових клгган мюкарда копв. При цьому комплексний вплив ферменпв та тривала експозицГя за низькоï температури дозволили розще-пити мгжклгганш зв'язки та мшмГзувати негативний вплив на клггани, як в подальшому були здатш до пролГфераци.
Висновки
Найбшьш ефективним методом отримання культури стовбурових клгган мюкарда копв е використання комбшацп ферменпв: 2,5% трипсину, 0,5 мг/мл колагенази (тип II) та 0,5 мг/мл палурошдази, що дозволяе з 10 мг тканин серця отримати 986,0 ± 9,3 тис. клгган, здатних до пролГферацп. Найменш ефективним виявився метод експланту (без викорис-тання ферменпв), оскшьки кшьшсть прикршлених до культурального пластику клгган за його використання на 5 добу культивування складала 35,7 ± 6,2 тис.
Перспективи подальших до^джень: проведен дослщження щодо визначення оптимального методу отримання культури стовбурових клгган мюкарда копв дасть можливють апробувати даний шдхщ при отриманш культури стовбурових клгган з шших орга-шв.
References
Masurkewitsch, A.J., Kowpak, V.V. & Danilow, V.B. (2014). Klitynni technologii u weterinarniy medyzyni. Nawtschal'nyi pocibnyk. [Cellular technologies in veterinary medicine. Manual]. Kyev: KOMPRINT (in Ukrainian).
Beltrami, A.P., Urbanek, K., Kajstura, J., Yan, S. M., Finato, N., Bussani, R., Nadal-Ginard, B., Silvestri, F., Leri, A., Beltrami, C.A., & Anversa, P. (2001). Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N. Engl. J. Med., 344(23), 17501757. doi: 10.1056/NEJM200106073442303. Bearzi, C., Rota, M., Hosoda, T., Tillmanns, J., Nascim-bene, A., De Angelis, A., Yasuzawa-Amano, S.,
Trofimova, I., Siggins, R. W., Lecapitaine, N.. Cascapera, S., Beltrami, A. P., D'Alessandro, D. A., Zias, E., Quaini, F., Urbanek, K., Michler, R. E., Bolli, R., Kajstura, J., Leri, A. & Anversa, P. (2007). Human cardiac stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(35),14068-14073. doi: 10.1073/pnas.0706760104.
Beltrami, A.P., Barlucchi, L., Torella, D., Baker, M., Limana, F., Chimenti, S., Kasahara, H., Rota, M., Musso, E., Urbanek, K., Leri, A., Kajstura, J., Nadal-Ginard, B., & Anversa, P. (2003). Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell, 114(6), 763-776. doi: 10.1016/S0092-8674(03)00687-1.
Colizza, D., Guevara, M.R., & Shrier, A. (1983). A comparative study of collagenase- and trypsin-dissociated embryonic heart cells: reaggregation electrophysiolo-gy, and pharmacology. Can J Physiol Pharmacol, 61(4), 408-419. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/6305468.
de Bruijne, J., & Jongsma, H.J. (1980). Membrane properties of aggregate of collagenase-dissociated rat heart cells. Adv Myocardiol, 1, 231-242. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6248936.
Gross, W.O., Schopf-Ebner, E., & Bucher, O.M. (1968). Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res, 53(1), 1-10.
Hynes, W.L., & Walton, S.L. (2000). Hyaluronidases of Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Lett, 183(2), 201-207. doi: 10.1111/j.1574-6968.2000.tb08958.x.
Kajstura, J., Leri, A., Finato N., DiLoreto C., Beltrami, C.A., & Anversa, P. (1998). Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(15), 8801-8805. https://www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC21157.
Olsen, J.V., Ong S.E., & Mann, M. (2004). Trypsin Cleaves Exclusively C-terminal to Arginine and Lysine Residues Molecular & Cellular Proteomics, 3 (6), 608-614. doi: 10.1074/mcp.T400003-MCP200.
Lee, J.H., Ha, J.M., & Leem, C.H. (2015). A Novel Nico-tinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca(2+) Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean J Physiol Pharmacol, 19(4), 373-382. doi: 10.4196/kjpp.2015.19.4.373.
Makkar, R.R., Smith, R.R., Cheng, K., Malliaras, K., Thomson, L.E., Berman, D., Czer, L.S., Marban, L., Mendizabal, A., Johnston, P.V., Russell, S.D., Schuleri, K.H., Lardo, A.C., Gerstenblith, G. & Mar-ban, E. (2012). Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet, 379(9819), 895-904. doi: 10.1016/ S0140-6736(12)60195-0.
Masson-Pevet, M., Jongsma, H.J., & de Bruijne, J. (1976). Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: A comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 8(10), 747-757 doi: 10.1016/0022-2828(76)90082-1.
Messina, L., Gavira, J.A., Pernagallo, S., Unciti-Broceta, J.D., Sanchez Martin, R.M., Diaz-Mochon, J.J., Vac-caro, S., Conejero-Muriel, M., Pineda-Molina, E., Ca-
ruso, S., Musumeci, L., Di Pasquale, R., Pontillo, A., Sincinelli, F., Pavan, M., & Secchieri, C. (2016). Identification and characterization of a bacterial hyaluron-idase and its production in recombinant form. FEBS Lett, 590(14), 2180-2189. doi: 10.1002/18733468.12258.
Mukherjee, R., Multani, M.M., Sample, J.A., Dowdy, K.B., Zellner, J.L., Hoover, D.B., & Spinale, F.G. (2002). Effects of adrenomedullin on human myocyte contractile function and beta-adrenergic response. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 7(4), 235-240. doi: 10.1177/107424840200700406.
Sharma, S., Mishra, R., Simpson, D., Wehman, B., Col-letti, E. J., Deshmukh, S., Datla, S. R., Balachandran, K., Guo, Y., Chen, L., Siddiqui, O. T., Kaushal, S. & Kaushal, S. (2015). Cardiosphere-derived cells from pediatric end-stage heart failure patients have enhanced functional activity due to the heat shock response regulating the secretome. Stem Cells, 33(4), 1213-1229. doi: 10.1002/stem.1937.
Shoulders, M.D., & Raines, R.T. (2009). Collagen structure and stability. Annual review of biochemistry, 7, 929958. doi: 10.1146/annurev.biochem.77.032207.120833.
Silver, L.H., Hemwall, E.L., Marino, T.A., & Houser, S.R. (1983). Isolation and morphology of calcium-tolerant feline ventricular myocytes. Am J Physiol, 245 (5 Pt 1), H891-6. doi: 10.1152/ajpheart.1983.245.5.H891.
Speicher, D.W. & McCarl, R.L. (1974). Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro, 10(1-2), 30-41. doi: 10.1007/BF02615336.
Zhang, D., Wu, C.T., Qi, X., Meijering, R.A., HoogstraBerends, F., Tadevosyan, A., Cubukcuoglu Deniz, G., Durdu, S., Akar, A.R., Sibon, O.C., Nattel, S., Henning, R.H., & Brundel, B.J. (2014). Activation of histone deacetylase-6 induces contractile dysfunction through derailment of a-tubulin proteostasis in experimental and human atrial fibrillation. Circulation, 129(3), 346-358. doi: 10.1161/CIRCULATI0NAHA.113.005300.
