CC BY
36
Вюник Дтпропетровського унiверситету. Бюлопя, медицина Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biología, medicina Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, medicine
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2014. 5(2), 104-109.
doi:10.15421/021420
ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online
www.medicine.dp.ua
УДК 612.119+616.155.392-036.12+616.15-07
Порiвняльна оцшка морфофункщональноУ активностi клггин кiсткового мозку пацieнтiв при хрошчнш мieлоiдшй лейкемп у pa3i терапп препаратами групи iнгiбiторiв тирозинкiназ першого та другого поколiння
1.О. Жалейко1, Д.1. Бiлько1, 1.С. Дяпль2, Н.М. Бшько1
'Центр молекулярних та клтинних до^дженъ Нацюнального yHieepcumemy «Киево-Могилянсъка академiя», Кшв, Украта 2ДУ «Науковий центрpadia^mo'iмедицини НАМН Украти», Kuie, Украта
Показано ефективтсть застосування культуральних методв дослщження для мошторингу вщповщ пащентш на терапiю шп-бпорами тиpoзинкiназ першого та другого поколшня. Фyнкцioнальна активнiсть клiтин кiсткoвoro мозку пащентш, якi мали опти-мальну вiдпoвiдь на теpапiю iнriбiтopами тирозинкшаз, була значно меншою поршняно з пащентами, якi характеризувалися набу-тою резистентшстю до пpепаpатiв, та хворими, у яких ХМЛ було дагностовано вперше. У пацiентiв з оптимальною вщповщдю на теpапiю нiлoтинiбoм кшьюсть кoлoнiй у напiвpiдкoмy аrаpi in vitro була меншою поршняно з пащентами, яю мали оптимальну вщповщь на теpапiю препаратом iматинiб. При набутт клiтинами лейкемiчнoro клону пащентш pезистентнoстi до теpапii шпбгто-рами тиpoзинкiназ у клiтинних агрегатах спостершалося переважання pаннiх клiтин гранулоцито-макрофагального ростка крово-творення, що може слугувати важливим дiаrнoстичним i прогностичним фактором для подальшого вибору стpатеrii лжування.
Ключоа слова: хpoнiчна мiелoiдна лейкемпя; культура клiтин in vitro; шпбпори тирозинк1наз
Comparative evaluation of bone marrow cells morpho-functional activity in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors
of the first and second generation
I.O. Zhaleyko1, D.I. Bilko1, I.S. Dyagil2, N.M. Bilko1
'Centre for Molecular and Cell Research of the National University of Kyiv-Mohyla Academy, Kyiv, Ukraine 2Scientific Centre of the Radiation Medicine NAMS of Ukraine, Kyiv, Ukraine
The efficiency of using the culture techniques of research for monitoring the patient's response to the treatment by tyrosine kinase inhibitors of the first and second generation is shown. Thus, the functional activity of bone marrow cells in patients having the optimal treatment response to inhibitors of tyrosine kinases was significantly lower compared with patients with the acquired resistance to the drug, and patients who had CML diagnosed for first time. Furthermore, for patients with the optimal response to the nilotinib therapy, numbers of colonies in semi-solid agar in vitro was lower, than in patients with the optimal response to imatinib. When the leukaemic cell clone becomes resistant to tyrosine kinase inhibitors, the prevalence of early cells of granulocyte-macrophage hematopoietic stem cells is observed in CFU culture which can be an important prognostic factor for choosing the appropriate treatment strategy.
Keywords: chronic myeloid leukemia; cell culture in vitro; tyrosine kinase inhibitors
Центр молекулярних та клтинтх дослiджень Нацюнального yHieepcumemy «Киево-Могилянська академия», вул. Сковороди, 2, Кигв, 04655, Украгна.
Centre of Molecular and Cell Research, National University of Kyiv-Mohyla Academy, Skovoroda str., 2, Kyiv, 04655, Ukraine. Tel.: +38-095-860-10-84. E-mail: nadia.bilko@gmail.com
Вступ
Хрончна MieroigHa лейкемiя (ХМЛ) - один i3 най-поширенiших гемобластоз1в. Захворюванiсть становить 1 на 100 тис. випадюв на piK (Weisberg et al., 2007). Причиною виникнення захворювання е поява реципрокно! транслокацп t(9;22)(q34;q11) у гeмопоeтичнiй стовбу-pовiй клiтинi. У peзультатi цього формуеться дериватна 22-га хромосома з укороченим довгим плечем, яку прийнято називати Фiладeльфiйською (Ph) (Frazer et al., 2007). На нiй утворюеться онкоген BCR-ABL, котрий кодуе онкобшок - BCR-ABL тирозинк1назу, що володiе здатнiстю до аутофосфорилювання, постшно передаючи сигнал на втоpиннi месенджери сигнальних каскад1в, як1 залучeнi практично до вс1х процес1в життедшльност кл1тини (Chen et al., 2010). У хротчнш фазi це захворювання зумовлюе нeзалeжнiсть лeйкeмiчних кл1тин вщ ростових фактоpiв i контактного iнгiбування, постшну активащю мiтогeнних сигнал1в, зниження здатносп Ph+-кл1тин до апоптозу (Frazer et al., 2007). У результат таких перетворень кл1тини лeйкeмiчного пулу поступово випсняють пул нормальних гемопоетичних кл1тин пацiента та, з набуттям додаткових мутацш, зумовлених нестабшьшстю геному, спричинюють прогресування захворювання до фази акселерацп та бластного кризу (Bacco et al., 2000).
Напришнщ 1990-х рок1в доктор Нейман i колеги до-слвджували спeцифiчнi шпбгтори тирозинюназ (1ТК), що i сприяло ввдкриттю iнгiбiтоpiв BCR-ABL тирозинк1нази (Chen, 2010). На початку 2000-х шатитб - 1ТК першого покол1ння було введено у клшчну практику як препарат, що вибipково блокуе прол1феращю кл1тин лейкем1чного клону, викликаючи повну ел1мшацш Ph+-клiтин у пунк-татах юсткового мозку пацiентiв через ргк ввд початку прийому препарату (повна цитогенетична вщповщь) (Mughal et al., 2013). Однак пiзнiшe виявилося, що лише у 70-90% випадюв пащенти досягають повно! цитогенети-чно! вщповвд (Mukhopadhyay et al., 2012). У решти хворих до препарату з часом формуеться резистенттсть. Найпо-ширетшою причиною стшкосп до iматинiбу е мутацп в гeнi BCR-ABL, причина яких - змша конформацп одно-йменно! тирозинюнази, що перешкоджае зв'язуванню препарату з онкобшком (Michael et al., 2000).
1з метою подолання стшкосп до iматинiбу розробле-но препарати другого поколшня, закрема ншотитб, який здатен протид1яти бiльшостi мутащй, що е причиною стшкосп до 1матитбу (Mughal et al., 2013). Ншотишб в1дазняеться ввд iматинiбу характером взаемодп з BCR-ABL бшком (в основному за рахунок лшофшьних взае-мод1й з тiею поверхнею протешу, де мiститься АТФ-кишеня, блокуючи ii) i вважаеться у 20 раз1в потужш-шим проти Ph+-клiтин, що продемонстровано на клгтин-них лшях in vitro (Belle et al., 2012). Терашя тлотитбом викликае швидше та глибше зниження юлькосп кл1тин лейкем1чного пулу пор1вняно з iматинiбом (Lanaerts et al., 2011). Однак до ншотитбу, як i до iматинiбу, iз часом може виникати peзистeнтнiсть, механзми форму-вання яко! до юнця не з'ясовано.
Мета даного дослвдження - ощнити морфофункцю-нальнi властивост гемопоетичних клiтин пащенпв iз piзною ввдповвддю на терашю препаратами 1ТК для вияв-
лення особливостей формування стшкосп до терапи на piBHi стовбурових клгган та ïx найближчих попередник1в.
Матерiал i методи дослщжень
Об'ект дослвдження - пунктати юсткового мозку пащенпв i3 ХМЛ, яю перебували на амбулаторному лiкуваннi в ДУ «Нащональний центр рад1ац1йно1 меди-цини» НАМН Украïни. Перед початком дослвдження всi xворi давали добровшьну шформовану згоду на викори-стання ïx матерiалу в експериментах. Залежно ввд тактики терапи, яку отримували пацieнти, ïx под1лили на три групи: ri, у яких було вперше д1агностовано ХМЛ (n = 5), пац1енти, яю як терапш отримували препарат iматинiб (n = 28) та хвор^ яю як таргетну терапш отримували препарат ншотишб (n = 19).
Для щдтвердження дiагнозу та оцiнки ввдповвд на терапiю 1ТК здiйснювали цитогенетичне дослiдження клiтин юсткового мозку пащенйв на 12-й мiсяць вiд початку терапи, вираховуючи процентний вмкт метафаз, що мiстять Ph-хромосому. Ввдповвдно до показникiв цитогенетичного дослiдження, пащенти, тсля 12 мiсяцiв прийому 1ТК, подiлялися на групи: тi, яю мали опти-мальну ввдповвдь на терапи» (у ïx юстковому мозку ввдсутш клiтини, що мають Ph-xромосому) та пацiенти, якi xарактеризувалися ввдсутшстю ввдповвд на лiкування (стiйкiсть до препарату; у ïxньому кiстковому мозку вiдмiчалося 1-100% Ph+-клiтин.
Мононуклеари юсткового мозку пащенпв культиву-вали in vitro у нашврвдкому агарi (0,33% бакто-агару ("Difco", США)), у 24-комiрковиx планшетаx (Nunc, США). Суспензiю для культивування готували на основi середовища RPMI-1640 ("Sigma", США) iз додаванням 20% фетальноï' телячоï' сироватки ("Sigma", США), анти-бiотикiв (50 МО/мл пенщилш, 50 мг/мл стрептомiцин) та 50 нг/мл гранулоцито-макрофагального ростового фактора ("Sigma", США). Культивування тривало 13 дiб за умов абсолктноï' вологостi та 5% СО2. Пюля цього ви-значали функцiональну актившсть клiтин кiсткового мозку пацiентiв шляxом пiдраxунку кiлькостi колонiй i кластерiв у комiркаx культурального планшета щд ш-вертованим мiкроскопом (Nikon, Японя).
1з метою морфолопчного дослiдження вмкту коло-нiй i кластерiв ïx вилучали з бактоагару за допомогою мшропшетки, ресуспендували у 50 мкл середовища RPMI-1640 та виготовляли препарати на цитоцентрифузi (Shandon, Великобританiя). Забарвлення цитологiчниx препаратiв здiйснювали методом Паппенгейма.
Порiвняння вибiрок проводили за допомогою непара-метричниx методiв (критерiй Манна - Уггщ). Висновок про статистичну значущiсть вщмшносп робили при Р < 0,05.
Результата та ïx обговорення
Кшьюсть rnramux агрегатiв у нашврвдкому агарi in vitro використовуеться як тест-система для перевiрки впливу xiмiотерапевтичниx препаратiв на клiтини пуx-лини. При гемобластозаx у багатьоx дослiдженняx продемонстровано пряму корелящю мiж результатами культивування та клшчною картиною пацiентiв (Mayani
е! а1., 2009). Саме цей феномен наштовхнув нас на думку дослвдити особливосп функцюнування гемопоетичних клгтин пащенпв, як1 мали р1зний характер ввдповвд на терашю 1ТК з метою пошуку функцюнальних 1 морфо-лопчних особливостей клгтин к1сткового мозку при ХМЛ, що могли б мати прогностичне значення для оцшки подальшого перебпу хвороби.
На першому еташ дослвджень необх1дно було вста-новити оптимальний термш культивування гемопоетичних клгтин пацieнгiв 1з ХМЛ, який визначали емтрично. Для цього кожт двi доби шдраховували кшькють клтинних агрегапв у комiрцi планшета. Результата дослщження виявили, що при ХМЛ кластери з'являлися на 3-тю добу культивування у великш кшькосп (115,5 ± 1,2) (рис. 1). До 9-1 доби культивування 1х кшькють дещо збiльшувалася, але недостовiрно, i надалi продовжувала стр1мко зменшуватися. Крiм того, на 3-тю добу культивування також з'являлися невеликого розмiру колони (40-50 клiтин). У випадку кластер1в к1льк1сть колонiй
компактного типу до 9-i' доби культивування збшь-шувалася недостовiрно, а з 11-1 по 13-ту добу !х кшькють досягла максимуму (70,7 ± 12,1) й у цей перюд збшьшувалася не лише 1х кшькють, а й розмри. Почи-наючи з 13-1 доби культивування к1льк1сть колонш компактного типу почала поступово зменшуватися. Невеликого розмiру колони дифузного типу при ХМЛ у культурi з'явилися одночасно з шшими клiтинними агрегатами, але до 13-1 доби культивування 1х кшькють не перевищувала 33% загально! кшькосп клiтинних агрегапв у комiрцi планшета. Однак, надалi (починаючи з 13-1 доби культивування), паралельно зi зменшенням кiлькостi кластерiв i колонш компактного типу, число колонш дифузного типу поступово зростало. Ми може-мо припустити, що причиною цього було поступове диференщювання клiтин до макрофапв, яю набували здатностi рухатися у нашврщкому агарi. Це сприяло зменшенню кшькосп колонiй компактного типу в комiрцi планшета (Cheryl, 2012).
Рис. 1. Залежшсть кiлькостi колон1й, що утворилися в ком1рц1 планшета, в1д доби культивування
Для nepeBÎpKH нашого припущення вшбирали клiтиннi агрегати, виготовляли препарати на цитоцентрифузi та забарвлювали за Паппенгеймом. Результати морфолопч-ного анашу внутршнього складу колон1й у нашврщкому агарi in vitro свщчили про те, що к1льк1сть бластних клiтин у культурi була високою до 9-ï доби культивування, коли-ваючись у межах 16-29% (рис. 2). При цьому ïx кшькють на 5-ту добу культивування удвiчi зменшувалася пор1вняно з 3-тю (16 ± 0,8%), але до 9-ï доби все ж про-довжувала зростати. Починаючи з 11-ï доби культивування кшькють бластних клтгин в агрегатах почала поступово зменшуватися, однак на 17-ту добу культивування ïx кшькють сягала 6 ± 0,1%, що е свщченням високо1' пролiферативноï активносп клiтин лейкем1чного клону, незважаючи на тривалий термш культивування. Кшькють
120
ss 100 I 80
промелоципв та м1елоципв у клгганних агрегатах суттево не в1дазнялася протягом усього термшу культивування (14-22% i 18-32%, вщповщно). Подбна картина спостерцалася й у випадку метам1елоципв, але п1сля 13-ï доби культивування ïx кшькють почала поступово зменшуватися (з 21 ± 1,6% на 13-ту до 14 ± 0,5% на 17-ту добу культивування). Кшькють сегментоядерних гранулоципв з 3-ï по 11-у добу культивування збшьшувалася до 15 ± 0,7%, а починаючи з 13-ï доби поступово зменшувалася (iмовiрно, за рахунок того, що частина сегментоядерних гранулоципв диференцтовалася на макрофаги, кiлькiсть яких починаючи з 13-ï доби культивування стр1мко збшьшувалася). На 15-ту добу культивування кшькють макрофапв зросла утрич (21 ± 0,6% загальноï' кшькосп клтган), а на 17-ту добу - бшьше шж учетверо (34 ± 1,3%).
60 40 20 0
□ макрофаги
□ сегментоядерн □ппаличкоядерн ■ метамieлоцити
□ мieлоцити
□ промieлоцити
□ бласти
3-тя 5-та 7-ма 9-та 11-та 13-та 15-та 17-та Доба культивування
Рис. 2. Залежшсть внутршнього складу клгганних агрегат1в ввд доби культивування
Ураховуючи особливосп колотеутворення та внутрь шнш склад кллинних агрегапв у нашврщкому arapi in vitro, оптимальним термшом культивування клтган кютко-вого мозку пащенпв при ХМЛ е 13 дб, оск1льки саме на цю добу спостериалася максимальна юльюсть колонш компактного типу та невелика кшьшсть макрофагальних клтган, що сприятиме адекватнш оц1нц1 функц1ональних i морфолопчних особливостей гемопоетичних стовбурових клтган та клггин-попередникш у культур1 in vitro.
У результат! аналзу функщональнот активносп кль тин к1сткового мозку пащенпв р1зних груп виявилося, що у хворих i3 вщсутшстю вщповда на терапш ншоти-шбом та у пащенпв, у яких уперше дагностовано ХМЛ, статистично достов1рнот р1знищ м1ж кшьшстю колонш у
наЩврщкому агар1 in vitro не було (147,0 ± 4,6 та 148,0 ± 2,2 колонш на 1 х 105 експлантованих м1елокарюципв, вщповщно) (рис. 3). Натомсть, у пащенпв, як характери-зувалися вщсуттстю вщповвд на тератю татитбом, колотетв1рна активтсть була в 1,6 раза меншою (90,8 ± 2,8 на 1 х 105 експлантованих клтган). У випадку пащенпв з оптимальною вщповшдю на 1ТК колотетв1рна активтсть була значно нижчою. У культур1 клтган к1сткового мозку пащенпв, як1 мали оптимальну вщповщь на терапш 1матитбом, к1льк1сть колонш становила 48,1 ± 1,8 на 1 х 105 експлантованих м1елокарюципв, а у пащенпв з оптимальною вщповшдю на ншотитб к1льк1сть колонш у наЩврщкому агар1 in vitro сягала 30,1 ± 7,6 на 1 х 105 експлантованих мононуклеар1в.
вщсутакпъ вщпов^ (нiло™нiб) оптимальна вiдповiдъ (нiло™нiб) вщсутннстъ вiдповiдi (матинб) оптимальна вiдповiдь (матинб) вперше дiагностовано ХМЛ
.......
in' P П P n nJU
1 п-п-ги—
□ кластери
□ колони'
0
50
100
150
Кшьмсть кл1тинних агрегат в на 100 000 експлантованих мклокарюцитт
Рис. 3. Результати культивування в напшрвдкому arapi in vitro шсткового мозку пащенпв i3 ХМЛ
Подабш вщмшносп, але тшьки на р1вт тенденци, спостерналися i для середшх значень кластер1в. У куль-тур1 клтган к1сткового мозку пащенпв, у яких уперше д1агностовано ХМЛ, к1льк1сть кластер1в у культур1 клтган in vitro становила 42,8 ± 4,7 на 1 х 105 експлантованих м1елокарюципв. У пащенпв, як1 характеризували-ся ввдсуттстю ввдповщ1 на терапш шатишбом, тх к1льк1сть недостов1рно збшьшилася до 44,3 ± 1,1 на 1 х 105 експлантованих клтган, а у пащенпв 1з ввдсутшстю вщповвд на терапш ншотишбом кшьшсть кластер1в була найвищою (61,3 ± 4,7 на 1 х 105 експлантованих м1елокарюципв). У культур! клтган к1сткового мозку пащенпв, як через р1к шсля початку терапи ха-рактеризувалися оптимальною вщповщдю на терапш 1матишбом, к1льк1сть кластер1в становила 41,3 ± 1,4 на 1 х 105 експлантованих клтган, а в культур! клтган к1сткового мозку пащенпв, яш характеризувалися оптимальною вщповщдю на терапш ншотишбом, кшьшсть кластер1в була в 1,4 раза вищою (61,8 ± 3,7 на 1 х 105 експлантованих м1елокарюципв).
Як вщомо з лтгературних джерел, при ХМЛ у шстковому мозку пащенпв спостерпаеться накопичення м1елоцитарних клтган (Corbin е1 al., 2011). При про-гресуванш захворювання до фази акселерацп та бластно-го кризу спостерпаеться порушення дозр1вання клтган м1елощного ростка кровотворення та зменшення шлькосп зрших форм, тобто паличкоядерних i сегмен-тоядерних гранулоципв (Grineeva et al., 2009). Однак те, яким чином тератя 1ТК впливае на диференцшвання клтган к1сткового мозку в нашврщкому агар1 in vitro, доа чттко не з'ясовано. Тому для оцшки особливостей морфолопчного складу клтган шсткового мозку пащенпв 1з р1зним характером вщповвд на терапш 1ТК псля культивування in vitro колонй' та кластери вилуча-
ли з наптврщкого агару, готували препарати на цито-центрифуз1 та забарвлювали за Паппенгеймом. У цито-лопчних препаратах клтганних агрегапв пащенпв з уперше д1агностованою ХМЛ спостерналася висока чисельшсть бластних клтган (близько 14 ± 0,6% загальнот шлькосп, рис. 4). У пащенпв з оптимальною вщповщдю на терапш 1матитбом к1льк1сть бластних клтган була значно меншою (7 ± 0,2%), а у пащенпв з оптимальною вщповщдю на ншотитб кшьшсть бластних клтган була найменшою (5 ± 0,1% загально1 шлькосп кл1тин в агрегат1). У хворих, яш характеризувалися в1дсутн1стю вщповда на терап1ю 1матин1бом, к1льк1сть бластних клпин у колон1ях i кластерах на 13-ту добу культивування становила 12 ± 0,4%, а у пащенпв 1з в1дсутн1стю в1дпов1д1 на терапш ншотитбом к1льк1сть бластних клпин була дещо меншою (8 ± 0,1%). Под1бн1 результати отримано Catriona еt al. (2004), як1 дослвд-жували ранн1 кл1тини-попередники к1сткового мозку за допомогою метод1в проточно1 цитофлуориметри та вия-вили, що у пащенпв з оптимальною в1дпов1ддю на шатитб в1дбуваеться значне зниження CD34+Lin-кл1тин, а к1льк1сть м1ело)дних попереднишв повертаеться до норми, у той час, як у зразках шсткового мозку пащенпв з1 ст1йк1стю до шатитбу в1дм1чаеться зб1ль-шення шлькосп рантх гранулоцито-макрофагальних кл1тин-попередник1в.
Разом 1з цим, у пац1ент1в р1зних груп статистично достов1рно1 р1зниц1 у шлькосп пром1елоцитарних та м1елоцитарних кл1тин не спостериалося. У хворих 1з вщсутшстю в1дпов1д1 на терап1ю 1ТК та у пащенпв з уперше д1агностованою ХМЛ вщзначалося переважання недиференц1йованих кл1тин м1ело]!дного ростка кровотворення (сумарно1 к1лькост1 бластних, пром1елоцитар-них, м1елоцитарних i метам1елоцитарних кл1тин). У хво-
рих i3 вщсутшстю вадповда на тераптю iматинiбом к1льк1сть недиференцiйованих клiгин становила 70 ± 2,9%, у пащенпв i3 вiдсутнiсгю вадповда на терашю нiлотинiбом ïx юльюсть складала 65 ± 3,1% загально!
юлькосп клтгин в агрегатах. У цитолопчних препаратах юсткового мозку пацieнгiв з уперше дiагностованою ХМЛ юльюсть недиференцiйованиx клтгин у колонiяx i кластерах становила 80 ± 2,7%.
Рис. 4. Внутргшнш склад клiтинних агрегат1в, отриманих у результат культивування касткового мозку
при ХМЛ у культург клгган in vitro
Юльюсть паличкоядерних гранулоципв у пацieнгiв з уперше дiагностованою ХМЛ становила 22 ± 1,3%, а у пащенпв з оптимальною вТдповТддю на iматинiб та ншотишб !х юльюсть була значно меншою (12 ± 0,2% та 13 ± 0,4%, вщповТдно). У пащенпв iз вiдсутнiсгю вiдповiдi на iматинiб юльюсть паличкоядерних гранулоцитiв була найвищою (30 ± 2,5% загального числа клтгин у колонiяx i кластерах). У хворих зi стшюстю до нiлотинiбу юльюсть паличкоядерних клтгин грануло-цито-макрофагального ряду була значно меншою (23 ± 1,7% клтгин в агрегатi).
Юльюсть макрофагтв у цитолойчних препаратах колонш i кластерТв клтгин юсткового мозку пацiентiв, яю як таргетну терапш отримували препарат ншотишб, була вищою, нж у пащенпв з уперше дагностованою ХМЛ та у хворих, яю як протилейкемчну терапш отримували iматинiб. У пащенпв з уперше дагностованою ХМЛ юльюсть макрофагiв сягала 3,5%, у пащенпв з оптимальною вщповщдю на Тматинб - 4 ± 0,1%, ншотишб - 3,7 ± 0,1%. У хворих Тз вадсутнстю вщповщ на iматинiб юльюсть макрофагтв становила близько 1%, а у пащенпв зТ стшюстю до терапи ншотинбом юльюсть макрофагтв була значно вищою (5,6 ± 0,2% загально! юлькосп клтгин у колонтях та кластерах на 13-ту добу культивування).
Таким чином, у разТ формування стшкосп до препарапв 1ТК вщновлювався пул лейкемТчних клтгин Тз переважанням раинх форм клтгин мТелощного ростка кровотворення, як i в пащенпв з уперше дТагностованою ХМЛ. КрТм цього, спостертгалася тенденщя, коли за бшьшо! юлькосп клтгин, яю мають Ph-хромосому, ви-
значалося бiльше раншх форм мГслощних клiтин у колошях i кластерах к1сткового мозку пащенпв, що могло свщчиш про прогресування захворювання до фази акселерацп та бластного кризу (Ruibao, 2005).
Як вщомо, при ХМЛ мiелоiдна ланка кровотворення розширюеться на всх стадях дозр1вання. Це вщбуваеться у результат! порушення балансу мтж самооновленням i диференцшванням, у результат чого в натврщкому агарi in vitro спостерпгаеться щдвищення пролiферативного потенцiалу клгтин к1сткового мозку (Faderl ег al., 2005). Використання 1ТК дозволяе пршшчувати пролiферативну перевагу Ph+-клiтин, сприяючи вщновленню нормального гемопоезу (Zhang ег al., 2010). У пащенпв, яю мають оп-тимальну вщповщь на терашю 1ТК, тобто у к юстковому мозку наявно 0% клiтин iз Ph-хромосомою, спостерпга-лося значне зниження юлькосп колонш i кластерiв у культурi клiтин in vitro. У пащенпв, яю характеризували-ся резистентшстю до терапii 1ТК, юльюсть колонш i кластер1в достовiрно не в1дазнялася вщ кiлькостi таких у пащенпв, у яких ХМЛ д1агностовано уперше. Це могло бути спричинене тим, що пiсля набуття клiтинами резистентносп до препарату пул Ph+ клгтин поступово вщновлювався й у кллинах к1сткового мозку хворих знову накопичувалися раннi клiтини-попередники, що характеризувалися високою пролТферативною актив-шстю. Причини резистентносп до 1ТК могли бути пов'язаш з мутащями у генi BCR-ABL, його амплiфiкацiею, зменшенням поглинання препарату кллинами лейкемiчного клону або щдвищенням рГвня вщгоку 1ТК (Zhang ег al., 2010).
Також на 0CH0Bi проведених дослгджень виявився феномен зменшення кшькосп колонiй у пащенпв, як1 мали оптимальну вгдповГдь на нiлотинiб, поршняно з пащентами, як1 характеризувалися оптимальною вгдпо-втдю на препарат iматинiб. Це могло бути пов'язано з тим, що нiлотинiб у 20 разш ефективтший за iматинiб, мае здатнiсгь впливати на примiтивнi CD34+ клiтини (O'Sullivan е1 al., 2011). 1з даних лiтератури також ведомо, що пащенти з ХМЛ при лiкуваннi 1ТК, навiть у разi по-вно! цитогенетично! вiдповiдi на тератю, все ж таки залишаються БСК-ЛВЬ-позитивними (Rosti е1 al., 1995). Це свщчить про те, що в !х к1стковому мозку залишаються клггани, як1 щдтримують експресш гена BCR-ABL, тобто залишаються клiтинами лейкемчного клону. Можливо, нiлотинiб елiмiнуе щ клiтини, що вщбиваеть-ся у меншш кшькосп колонiй у пащентш з оптимальною в1дпов1ддю на ншотитб, порiвняно з к1льк1стю таких у пащентш з оптимальною вщповшдю на шатишб. Деяк1 дослгдники стверджують, що ншотитб не специфiчний винятково до BCR-ABL тирозинк1нази, але вш здатен пригачувати також к1назу c-Abl, що може викликати iнгiбування формування колонш у культурi in vitro (O'Sullivan еt al., 2011).
Висновки
1ТК здатнi пригнiчувати функцiональну активнiсть клгган к1сткового мозку пацiентiв iз ХМЛ. Спостернало-ся значне зниження кшькосп колонiй у пацiентiв, як1 мали оптимальну вщповшь на тератю нiлотинiбом по-рiвняно з пацiентами, яю мали оптимальну вщповщь на тератю iматинiбом. У разi набуття клтганами лейкемГч-ного клону стiйкостi до 1ТК, ршень функщонально! ак-тивносп гемопоетичних стовбурових клiтин та клгган попередник1в пацiентiв вгдновлювався до ршня такого у хворих з уперше дiагностованою ХМЛ. У пацiенгiв Гз набутою резистенгнiстю до 1ТК першого та другого поколтня у клтганних агрегатах спостер1галося перева-жання ранЩх форм клгган гранулоциго-макрофагального ростка кровотворення. ОтриманГ дан свГдчать про те, що змши функщонально!' активносп гемопоетичних стовбурових клгган та клгган-попередникш вГдображають ршень лейкемчно! трансформаци клгган к1сткового мозку при ХМЛ i можуть використовуватися як додатковий метод мониторингу вщповвд пащентш на терашю препаратами 1ТК першого та другого поколшь.
Бiблiографiчнi посилання
Bacco Di, A., Keeshan, K., McKenna, S.L., 2000. Molecular abnormalities in chronic myeloid leukemia: Deregulation of cell growth and apoptosis. Oncologist 5, 405-415. Baran, Y., Say dam, G., 2012. Cumulative clinical experience from a decade of use: Imatinib as first-line treatment of chronic myeloid leukemia. J. Blood Med. 3, 139-150. Belle, L., Bruck, F., Foguenne, J., 2012. Imatinib and nilotinib inhibit hematopoietic progenitor cell growth, but do not prevent adhesion, migration and engraftment of human cord blood CD34+ cells. PLoS One 7(12), e52564.
Chen, Y., Peng, C., Sullivan, C., 2010. Critical molecular pathways in cancer stem cells of chronic myeloid leukemia. Leukemia 24(9), 1545-1554.
Helgason, C.D., Helgason, C.L.M., 2012. Basic cell culture protocols. 3rd ed. Vol. 290. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Corbin, A.S., Agarwal, A., Loriaux, M., 2011. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. J. Clin. Invest. 121, 396-409.
Falder, S., Talpaz, M., Estrov, Z., 1999. The biology of chronic myeloid leukemia. N. Engl. J. Med. 15, 164-172.
Frazer, R., Irvine, A., McMullin, M.F., 2007. Chronic myeloid leukaemia in the 21st century. Ulster Med. J. 76(1), 8-17.
Grineva, N.I., Ahlynina, T.V., Gerasimova, L.P., 2009. Razlichija v proliferacii i differencirovke Ph+ kletok ot individual'nyh bol'nyh HML v suspenzionnoj kul'ture. Ph+ kletki s vysokoj skorost'ju proliferacii [Differences in proliferation and differentiation of Ph+ cells from CML patients in individual suspension culture. Ph+ cells with high proliferation rates]. Jeksperimental'naja Onkologija 8, 53-68 (in Russian).
Jamieson, C.H.M., Ailles, L.E., Dylla, S.J., Muijtjens, M., Jones, C., Zehnder, J.L., Gotlib, J., Li, K., Manz, M.G., Keating, A., Sawyers, C.L., Weissman, I.L., 2004. Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast-crisis CML. N. Engl. J. Med. 351(7), 657-667.
Jorgensen, H.G., Allan, E.K., Jordanides, N.E., 2007. Nilotinib exerts equipotent antiproliferative effects to imatinib and does not induce apoptosis in CD34+ CML cells. Blood 109, 4016-4019.
Lenaerts, T., Castagnetti, F., Traulsen, A., 2011. Explaining the in vitro and in vivo differences in leukemia therapy. Cell Cycle 15, 1540-1544.
Mayani, H., Flores-Figueroa, E., Chavez-Gonzalez, A., 2009. In vitro biology of human myeloid leukemia. Leukemia Res. 33, 634-637.
Deininger, M.W.N., Goldman, J.M., Melo, J.V., 2000. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood 96(10), 3343-3355.
Mughal, A., Aslam, M., Khan, A.M.H., Saleem, S., Umar, R., Saleem, M., 2013. Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors - current status. Infect. Agents Cancer 8(1), 23.
Mukhopadhyay, A., Dasgupta, S., Mukhopadhyay, S., 2012. Imatinib mesylate therapy in patients of chronic myeloid leukemia with philadelphia chromosome positive: An experience from Eastern India. Indian J. Hematol. Blood Transfus. 28(2), 82-88.
O'Sullivan, S., Lin, J.M., Watson, M., 2011. The skeletal effects of the tyrosine kinase inhibitor nilotinib. Bone 49, 281-289.
Rosti, V., Bergamaschi, G., Lucotti, C., 1995. Oligodeoxynucleo-tides antisense to c-abl specifically inhibit entry into S-phase of CD34+ hematopoietic cells and their differentiation to granulocyte-macrophage progenitors. Blood 86, 3387-3393.
Ruibao, R., 2005. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogene-sis of chronic myelogenous leukemia. Nat. Rev. Cancer 5, 172-183.
Weisberg, E., Catley, L., Renee, D., 2007. Beneficial effects of combining nilotinib and imatinib in preclinical models of BCR-ABL leukemias. Blood 109, 2112-2120.
Zhang, B., Strauss, A.C., Chu, S., 2010. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by his-tone deacetylase inhibitors in combination with imatinib me-sylate. Cancer Cell 17(5), 427-442.
Hadiumna do редкоnегu 12.07.2014
